Sammenligning af to repræsentative metoder til differentiering af humane inducerede pluripotente stamceller i mesenkymale stromale celler

Summary

Denne protokol beskriver og sammenligner to repræsentative metoder til differentiering af hiPSC’er i mesenkymale stromale celler (MSC’er). Enkeltlagsmetoden er kendetegnet ved lavere omkostninger, enklere betjening og lettere osteogen differentiering. Embryoidlegememetoden (EB’er) er kendetegnet ved lavere tidsforbrug.

Abstract

Mesenkymale stromale celler (MSC’er) er voksne pluripotente stamceller, der har været meget udbredt i regenerativ medicin. Da somatisk vævsafledte MSC’er er begrænset af begrænset donation, kvalitetsvariationer og biosikkerhed, har de sidste 10 år oplevet en stor stigning i bestræbelserne på at generere MSC’er fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er). Tidligere og nylige bestræbelser på differentiering af hiPSC’er i MSC’er har været centreret omkring to dyrkningsmetoder: (1) dannelsen af embryoidlegemer (EB’er) og (2) brugen af enkeltlagskultur. Denne protokol beskriver disse to repræsentative metoder til at udlede MSC fra hiPSC’er. Hver metode præsenterer sine fordele og ulemper, herunder tid, omkostninger, cellespredningsevne, ekspression af MSC-markører og deres evne til differentiering in vitro. Denne protokol viser, at begge metoder kan udlede modne og funktionelle MSC’er fra hiPSC’er. Enkeltlagsmetoden er kendetegnet ved lavere omkostninger, enklere betjening og lettere osteogen differentiering, mens EB-metoden er kendetegnet ved lavere tidsforbrug.

Introduction

Mesenkymale stromale celler (MSC’er) er mesodermafledte voksne pluripotente stamceller¹. MSC’er er til stede i næsten alle bindevæv². Siden MSC’er først blev opdaget i 1970’erne og med succes isoleret fra knoglemarv i 1987 af Friedenstein et al.3,4,5, er en række humane somatiske (herunder føtale og voksne) væv blevet brugt til isolering af MSC’er såsom knogle, brusk, sener, muskler, fedtvæv og hæmatopoietisk understøttende stroma 1,2,6,7 . MSC’er demonstrerer høje proliferative evner og plasticitet til at differentiere sig til mange somatiske cellelinjer og kunne migrere til skadet og betændt væv ^2,8,9. Disse egenskaber gør MSC’er til en potentiel kandidat til regenerativ medicin¹⁰. Imidlertid er somatiske vævsafledte MSC’er (st-MSC’er) begrænset af begrænset donation, begrænset celleproliferativ kapacitet, kvalitetsvariationer og biosikkerhedsproblemer for mulig overførsel af patogener, hvis nogen, fra donorerne^11,12.

Human induceret pluripotent stamceller (hiPSC’er) stammer fra voksne celler, der omprogrammeres med transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc), som har lignende funktioner som embryonale stamceller^13,14. De kan forny sig selv og have potentialet til at differentiere sig til enhver type somatiske celler, herunder MSC’er. Sammenlignet med st-MSC’er har iPSC-MSC’er fordelen ved ubegrænset forsyning, lavere omkostninger, højere renhed, bekvemmelighed i kvalitetskontrol, let at skalere produktion og genmodifikation 15,16,17.

På grund af disse fordele ved iPSC-MSC’er er der rapporteret om en række forskellige metoder, der driver MSC fra iPSC. Disse differentieringsmetoder har været centreret omkring to dyrkningsmetoder: (1) dannelsen af embryoidlegemer (EB’er) og (2) brugen af enkeltlagskulturer 11,18,19,20. Heri blev en repræsentativ tilgang til hver af de to metoder karakteriseret. Desuden blev der også adgang til sammenligninger mellem to repræsentative tilgange baseret på tid, omkostninger, proliferativ evne, ekspression af MSC-biomarkører og differentieringsevne in vitro.

Protocol

1. vedligeholdelse af hiPSC’er Optøning af hiPSCTag cellerne ud af det flydende kvælstof og tø hurtigt cellerne op i et 37 °C vandbad. Optøningscellerne overføres til et 15 ml rør fremstillet med 3 ml iPSC-vedligeholdelsesmedium (materialetabel). Bland forsigtigt mediet. Centrifuger ved 300 x g i 5 min. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes forsigtigt i 1 ml iPSC-vedligeholdelsessubstrat med 10 μM Y-27632 (cellerne pipetteres op og…

Representative Results

Efter protokollen (figur 1A) blev hiPSC’er differentieret til MSC’er via EB-dannelses- og enkeltlagskulturmetoderne. Under differentieringen viste cellerne forskellige repræsentative morfologier (figur 1B, C). Som vist i figur 1B viser hiPSC-kolonierne typisk kompakt morfologi før differentiering med en klar kant sammensat af tæt pakkede celler. Ensartede sfæriske EB’er dannet efter h…

Discussion

I denne protokol blev to repræsentative metoder til differentiering af hiPSC’er i MSC’er undersøgt 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Begge metoder var i stand til at aflede MSC’er fra hiPS…

Materials

Alizarin red staining kit	Beyotime Biotechnology	C0148S
Anti-human-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbic acid	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Carbon dioxide level shaker	Crystal	CO-06UC6
Compensation Beads	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethasone	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12  medium	Servicebio	G4610
Fetal bovine serum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
human IgG1 isotype control APC	BioLegend	403505
human IgG1 isotype control FITC	BioLegend	403507
human IgG1 isotype control PE	BioLegend	403503
Human TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC maintenance medium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced	BD Corning	354230
Oli Red O staining kit	Beyotime Biotechnology	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Sodium pyruvate	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
Toluidine blue staining kit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glycerophosphate	Solarbio	G8100