השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים
Summary
פרוטוקול זה מתאר ומשווה שתי שיטות מייצגות להבחנה של hiPSCs לתאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). השיטה החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר. שיטת הגופים העובריים (EBs) מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.
Abstract
תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים הנמצאים בשימוש נרחב ברפואה רגנרטיבית. מכיוון שתאי MSC שמקורם ברקמה סומטית מוגבלים על ידי תרומה מוגבלת, שינויי איכות ובטיחות ביולוגית, בעשר השנים האחרונות חלה עלייה גדולה במאמצים לייצר MSCs מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). מאמצים קודמים ואחרונים בהתמיינות של hiPSCs ל- MSCs התרכזו סביב שתי מתודולוגיות תרבית: (1) היווצרות גופים עובריים (EBs) ו- (2) שימוש בתרבית חד-שכבתית. פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות מייצגות אלה בהפקת MSC מ- hiPSCs. כל שיטה מציגה את יתרונותיה וחסרונותיה, לרבות זמן, עלות, יכולת התפשטות תאים, ביטוי סמני MSC ויכולת התמיינות שלהם במבחנה. פרוטוקול זה מדגים כי שתי השיטות יכולות להפיק MSCs בוגרים ופונקציונליים מ- hiPSCs. שיטת החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר, ואילו שיטת EB מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.
Introduction
תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים שמקורם במזודרם1. MSCs נמצאים כמעט בכל רקמות החיבור2. מאז MSCs התגלו לראשונה בשנת 1970 ובודדו בהצלחה ממח עצם בשנת 1987 על ידי Friedenstein et al.3,4,5, מגוון של רקמות סומטיות אנושיות (כולל עובריות ובוגרות) שימשו לבידוד MSCs כגון עצם, סחוס, גיד, שריר, רקמת שומן, סטרומה תומכת hematopoietic 1,2,6,7 . MSCs מפגינים יכולות שגשוג גבוהות ופלסטיות כדי להתמיין לשושלות תאים סומטיות רבות ויכולים לנדוד לרקמות פצועות ומודלקות 2,8,9. תכונות אלה הופכות MSCs למועמד פוטנציאלי לרפואה רגנרטיבית10. עם זאת, MSCs שמקורם ברקמה סומטית (st-MSCs) מוגבלים על ידי תרומה מוגבלת, יכולת שגשוג תאים מוגבלת, שינויים באיכות וחשש לבטיחות ביולוגית להעברה אפשרית של פתוגנים, אם בכלל, מהתורמים11,12.
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) נגזרים מתאים בוגרים המתכנתים מחדש עם גורמי שעתוק (Oct4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc), שיש להם תפקידים דומים לתאי גזע עובריים13,14. הם יכולים לחדש את עצמם ויש להם את הפוטנציאל של התמיינות לכל סוג של תאים סומטיים, כולל MSCs. בהשוואה ל- st-MSCs, ל- iPSC-MSCs יש את היתרון של אספקה בלתי מוגבלת, עלות נמוכה יותר, טוהר גבוה יותר, נוחות בבקרת איכות, קל לייצור בקנה מידה ושינוי גנים 15,16,17.
בשל יתרונות אלה של iPSC-MSCs, דווח על מגוון שיטות המניעות MSC מ- iPSC. שיטות התמיינות אלה התרכזו סביב שתי מתודולוגיות תרבית: (1) היווצרות גופים עובריים (EBs) ו-(2) שימוש בתרביות חד-שכבתיות 11,18,19,20. כאן אופיינה גישה מייצגת לכל אחת משתי המתודולוגיות. כמו כן, נערכה השוואה בין שתי גישות מייצגות המבוססות על זמן, עלות, יכולת שגשוג, ביטוי סמנים ביולוגיים של MSC ויכולת התמיינות במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה נבדקו שתי שיטות מייצגות להבחנה בין hiPSCs ל-MSCs: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. שתי השיטות היו מסוגלות לגזור…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לכל חברי מעבדת מאו והו, בעבר ובהווה, על הדיונים המעניינים והתרומות הגדולות לפרויקט. אנו מודים למרכז המחקר הקליני הלאומי לבריאות הילד על התמיכה הגדולה. מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U20A20351 לג’יאנהואה מאו, 82200784 ללידן הו), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג’ג’יאנג בסין (No. LQ22C070004 ללידן הו).
Materials
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
References
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus – Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
