Bu protokol, hiPSC’leri mezenkimal stromal hücrelere (MSC’ler) farklılaştırmak için iki temsili yöntemi tanımlar ve karşılaştırır. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterizedir. Embriyoid cisimler (EB’ler) yöntemi, daha düşük zaman tüketimi ile karakterizedir.
Mezenkimal stromal hücreler (MSC’ler), rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılan yetişkin pluripotent kök hücrelerdir. Somatik doku kaynaklı MSC’ler sınırlı bağış, kalite varyasyonları ve biyogüvenlik ile kısıtlandığından, son 10 yılda insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC’ler) MSC’ler üretme çabalarında büyük bir artış görülmüştür. hiPSC’lerin MSC’lere farklılaşmasına yönelik geçmiş ve son çabalar iki kültür metodolojisi etrafında toplanmıştır: (1) embriyoid cisimciklerin (EB’ler) oluşumu ve (2) tek katmanlı kültürün kullanımı. Bu protokol, hiPSC’lerden MSC türetilmesinde bu iki temsili yöntemi açıklar. Her yöntem, zaman, maliyet, hücre proliferasyon yeteneği, MSC belirteçlerinin ekspresyonu ve in vitro farklılaşma yetenekleri dahil olmak üzere avantaj ve dezavantajlarını sunar. Bu protokol, her iki yöntemin de hiPSC’lerden olgun ve işlevsel MSC’ler türetebileceğini göstermektedir. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterize edilirken, EB yöntemi daha düşük zaman tüketimi ile karakterize edilir.
Mezenkimal stromal hücreler (MSC’ler) mezoderm kaynaklı yetişkin pluripotent kök hücrelerdir1. MSC’ler hemen hemen tüm bağ dokularında bulunur2. MSC’ler ilk olarak 1970’lerde keşfedildiğinden ve 1987’de Friedenstein ve ark.3,4,5 tarafından kemik iliğinden başarılı bir şekilde izole edildiğinden beri, kemik, kıkırdak, tendon, kas, yağ dokusu ve hematopoietik destekleyici stroma gibi MSC’leri izole etmek için çeşitli insan somatik (fetal ve yetişkin dahil) dokular kullanılmıştır 1,2,6,7. MSC’ler, birçok somatik hücre soyuna farklılaşmak için yüksek proliferatif yetenekler ve plastisite gösterir ve yaralı ve iltihaplı dokulara göç edebilir 2,8,9. Bu özellikler, MSC’leri rejeneratif tıp için potansiyel bir aday haline getirir10. Bununla birlikte, somatik doku kaynaklı MSC’ler (st-MSC’ler) sınırlı bağış, sınırlı hücre proliferatif kapasitesi, kalite varyasyonları ve varsa patojenlerin donörlerden olası bulaşması için biyogüvenlik endişesi ile kısıtlanmıştır11,12.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC’ler), embriyonik kök hücrelerle benzer işlevlere sahip transkripsiyon faktörleri (Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc) ile yeniden programlanan yetişkin hücrelerden türetilir13,14. Kendi kendini yenileyebilir ve MSC’ler de dahil olmak üzere her tür somatik hücreye farklılaşma potansiyeline sahip olabilirler. st-MSC’lerle karşılaştırıldığında, iPSC-MSC’ler sınırsız tedarik, daha düşük maliyet, daha yüksek saflık, kalite kontrolünde kolaylık, ölçekli üretim ve gen modifikasyonu için kolay avantaja sahiptir 15,16,17.
iPSC-MSC’lerin bu avantajları nedeniyle, MSC’yi iPSC’den yönlendiren çeşitli yöntemler rapor edilmiştir. Bu farklılaşma yöntemleri iki kültür metodolojisi etrafında toplanmıştır: (1) embriyoid cisimciklerinin (EB’ler) oluşumu ve (2) tek katmanlı kültürlerin kullanımı 11,18,19,20. Burada, iki metodolojinin her biri için temsili bir yaklaşım karakterize edilmiştir. Ayrıca, zaman, maliyet, proliferatif yetenek, MSC biyobelirteçlerinin ekspresyonu ve in vitro farklılaşma kabiliyetine dayalı iki temsili yaklaşım arasındaki karşılaştırmalara da erişildi.
Bu protokolde, hiPSC’leri MSC’lere ayırmanın iki temsili yöntemi incelenmiştir 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Her iki yöntem de MSC’leri hiPSC’lerden türetme yeteneğine sahipti. Hi…
The authors have nothing to disclose.
Mao ve Hu Lab’ın geçmişteki ve şimdiki tüm üyelerine, ilginç tartışmalar ve projeye büyük katkıları için son derece minnettarız. Büyük destek için Ulusal Çocuk Sağlığı Klinik Araştırma Merkezi’ne müteşekkiriz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Jianhua Mao’ya U20A20351, Lidan Hu’ya 82200784), Çin’in Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. LQ22C070004 Lidan Hu’ya).
Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
Proline | Solarbio | P0011 | |
Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
Versene | Gibco | 15040-66 | |
Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |