ヒト人工多能性幹細胞から間葉系間質細胞への分化のための2つの代表的な方法の比較
Summary
このプロトコルでは、ヒトiPS細胞を間葉系間質細胞(MSC)に分化させるための2つの代表的な方法を説明し、比較します。単層法は、低コスト、操作の簡便さ、骨形成の分化の容易さを特徴としています。胚様体(EB)法は、時間消費が少ないという特徴があります。
Abstract
間葉系間質細胞(MSC)は、再生医療で広く利用されている成体多能性幹細胞です。体細胞組織由来のMSCは、提供が限られていること、品質のばらつきがあること、バイオセーフティーによって制限されているため、過去10年間で、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)からMSCを作製する取り組みが大幅に増加しています。ヒトiPS細胞を間幹細胞に分化させるためのこれまでの取り組みは、(1)胚様体(EB)の形成と(2)単層培養の2つの培養方法が中心でした。このプロトコルでは、iPS細胞からMSCを誘導する際のこれら2つの代表的な方法について説明します。それぞれの方法には、時間、コスト、細胞増殖能、MSCマーカーの発現、 in vitroでの分化能力など、長所と短所があります。このプロトコルは、どちらの方法もiPS細胞から成熟した機能的なMSCを導き出すことができることを示しています。単層法は低コスト、操作の簡便さ、骨形成の分化の容易さを特徴とし、EB法は時間消費が少ないという特徴があります。
Introduction
間葉系間質細胞(MSC)は、中胚葉由来の成体多能性幹細胞です1。MSCは、ほとんどすべての結合組織に存在します2。MSCが1970年代に初めて発見され、1987年にFriedensteinらによって骨髄からの単離に成功して以来3,4,5、骨、軟骨、腱、筋肉、脂肪組織、造血支持間質などのさまざまなヒト体細胞組織(胎児および成人を含む)がMSCの単離に使用されてきました1,2,6,7.MSCは、多くの体細胞系統に分化するための高い増殖能力と可塑性を示し、損傷組織や炎症組織に移動する可能性があります2,8,9。これらの特性により、MSCは再生医療の候補となる可能性があります10。しかし、体細胞組織由来MSC(st-MSC)は、提供が限られていること、細胞増殖能力が限られていること、品質のばらつき、およびドナーからの病原体の伝播の可能性に対するバイオセーフティー上の懸念によって制限されている11,12。
ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、胚性幹細胞と同様の機能を持つ転写因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)でリプログラミングした成体細胞に由来します13,14。iPS細胞は、ST-MSCと比較して、供給量が無制限で、低コスト、高純度、品質管理の利便性、スケール生産や遺伝子改変が容易であるという利点があります15,16,17。
iPS細胞-MSCのこれらの利点により、iPS細胞からMSCを駆動する方法がいろいろと報告されています。これらの分化法は、(1)胚様体(EB)の形成と(2)単層培養の使用という2つの培養方法論を中心としています11,18,19,20。本明細書では、2つの方法論のそれぞれに対する代表的なアプローチを特徴づけた。さらに、時間、コスト、増殖能、MSCバイオマーカーの発現、およびin vitroでの分化能力に基づく2つの代表的なアプローチの比較もアクセスしました。
Protocol
1. iPS細胞のメンテナンス iPS細胞の解凍液体窒素から細胞を取り出し、37°Cのウォーターバスで細胞を速やかに融解します。融解細胞を、3 mLのiPS細胞維持培地(材料表)で調製した15 mLのチューブに移します。培地を静かに混ぜます。 300 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、10 μM Y-27632を含む1 mLのiPS細胞維持培地に細胞を静かに再懸?…
Representative Results
プロトコール(図1A)に従い、iPS細胞をEB形成法および単層培養法でMSCに分化させました。分化中、細胞は異なる代表的な形態を示しました(図1B、C)。 図1Bに示すように、iPS細胞コロニーは、分化前は典型的なコンパクトな形態を示し、細胞が密集した明確な境界を示しています。iPS細胞が解離?…
Discussion
このプロトコルでは、ヒトiPS細胞をMSCに鑑別する2つの代表的な方法を検討しました20,21,22,23,24,25,26,27,28,30。どちらの方法も、iPS細胞からMSC?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
過去と現在のMao and Hu Labのすべてのメンバーに、興味深い議論とプロジェクトへの多大な貢献に心から感謝しています。国立成育医療研究センターの多大なるご支援に感謝いたします。本研究は、中国国家自然科学基金会(U20A20351は毛建華、胡立丹82200784)、中国浙江省自然科学基金会(No.LQ22C070004 Lidan Hu へ)。
Materials
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
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Citer Cet Article
Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q., Hu, L., Mao, J. Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells. J. Vis. Exp. (200), e65729, doi:10.3791/65729 (2023).