Vergleich zweier repräsentativer Methoden zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in mesenchymale Stromazellen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in mesenchymale Stromazellen (MSCs). Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus. Die Methode der Embryoidkörper (EBs) zeichnet sich durch einen geringeren Zeitaufwand aus.

Abstract

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind adulte pluripotente Stammzellen, die in der regenerativen Medizin weit verbreitet sind. Da MSCs aus somatischem Gewebe durch begrenzte Spende, Qualitätsschwankungen und Biosicherheit eingeschränkt sind, haben in den letzten 10 Jahren die Bemühungen, MSCs aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu erzeugen, stark zugenommen. Frühere und neuere Bemühungen zur Differenzierung von hiPSCs in MSCs konzentrierten sich auf zwei Kulturmethoden: (1) die Bildung von Embryoidkörpern (EBs) und (2) die Verwendung von Monolayer-Kulturen. Dieses Protokoll beschreibt diese beiden repräsentativen Methoden zur Ableitung von MSC aus hiPSCs. Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile, einschließlich Zeit, Kosten, Zellproliferationsfähigkeit, der Expression von MSC-Markern und ihrer Fähigkeit zur Differenzierung in vitro. Dieses Protokoll zeigt, dass beide Methoden reife und funktionelle MSCs aus hiPSCs ableiten können. Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus, während sich die EB-Methode durch einen geringeren Zeitaufwand auszeichnet.

Introduction

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind aus dem Mesoderm gewonnene adulte pluripotente Stammzellen¹. MSCs sind in fast allen Bindegeweben vorhanden². Seit MSCs in den 1970er Jahren entdeckt und 1987 von Friedenstein et al.3,4,5 erfolgreich aus dem Knochenmark isoliert wurden, wurde eine Vielzahl von menschlichen somatischen (einschließlich fetaler und adulter) Gewebe wie Knochen, Knorpel, Sehnen, Muskeln, Fettgewebe und hämatopoetisches unterstützendes Stroma zur Isolierung von MSCs verwendet 1,2,6,7 . MSCs zeigen eine hohe proliferative Fähigkeit und Plastizität, sich in viele somatische Zelllinien zu differenzieren und könnten in verletztes und entzündetes Gewebe migrieren ^2,8,9. Diese Eigenschaften machen MSCs zu einem potenziellen Kandidaten für die regenerative Medizin¹⁰. Aus somatischem Gewebe gewonnene MSCs (st-MSCs) sind jedoch durch eine begrenzte Spende, eine begrenzte Zellproliferationskapazität, Qualitätsschwankungen und Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit hinsichtlich einer möglichen Übertragung von Krankheitserregern, falls vorhanden, von den Spendern eingeschränkt^11,12.

Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) werden aus adulten Zellen gewonnen, die mit Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc) reprogrammiert werden, die ähnliche Funktionen wie embryonale Stammzellen haben^13,14. Sie können sich selbst erneuern und besitzen das Potenzial, sich in jede Art von somatischen Zellen, einschließlich MSCs, zu differenzieren. Im Vergleich zu st-MSCs haben iPSC-MSCs den Vorteil einer unbegrenzten Versorgung, niedrigerer Kosten, höherer Reinheit, Bequemlichkeit bei der Qualitätskontrolle, einfacher Produktion und Genmodifikation 15,16,17.

Aufgrund dieser Vorteile von iPSC-MSCs wurde über eine Vielzahl von Methoden berichtet, mit denen MSC aus iPSC gesteuert wird. Diese Differenzierungsmethoden basieren auf zwei Kulturmethoden: (1) der Bildung von Embryoidkörpern (EBs) und (2) der Verwendung von Monolayerkulturen 11,18,19,20. In dieser Arbeit wurde ein repräsentativer Ansatz für jede der beiden Methoden charakterisiert. Darüber hinaus wurden Vergleiche zwischen zwei repräsentativen Ansätzen basierend auf Zeit, Kosten, Proliferationsfähigkeit, Expression von MSC-Biomarkern und Differenzierungsfähigkeit in vitro durchgeführt.

Protocol

1. Wartung von hiPSCs Auftauen von hiPSCNehmen Sie die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auf. Die auftauenden Zellen werden in ein 15-ml-Röhrchen überführt, das mit 3 ml iPSC-Erhaltungsmedium vorbereitet ist (Materialtabelle). Mischen Sie das Medium vorsichtig. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml iPSC…

Representative Results

In Anlehnung an das Protokoll (Abbildung 1A) wurden hiPSCs mit Hilfe der EB-Bildung und der Monolayer-Kulturmethode in MSCs differenziert. Während der Differenzierung zeigten die Zellen unterschiedliche repräsentative Morphologien (Abbildung 1B,C). Wie in Abbildung 1B dargestellt, zeigen die hiPS-Kolonien vor der Differenzierung eine typische kompakte Morphologie mit einem klaren Rand, …

Discussion

In diesem Protokoll wurden zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in MSCs untersucht 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Beide Methoden waren in der Lage, MSCs aus hiPSCs…

Materials

Alizarin red staining kit	Beyotime Biotechnology	C0148S
Anti-human-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbic acid	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Carbon dioxide level shaker	Crystal	CO-06UC6
Compensation Beads	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethasone	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12  medium	Servicebio	G4610
Fetal bovine serum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
human IgG1 isotype control APC	BioLegend	403505
human IgG1 isotype control FITC	BioLegend	403507
human IgG1 isotype control PE	BioLegend	403503
Human TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC maintenance medium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced	BD Corning	354230
Oli Red O staining kit	Beyotime Biotechnology	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Sodium pyruvate	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
Toluidine blue staining kit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glycerophosphate	Solarbio	G8100