Questo protocollo descrive e confronta due metodi rappresentativi per differenziare le hiPSC in cellule stromali mesenchimali (MSC). Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica. Il metodo dei corpi embrioidi (EBs) è caratterizzato da un minor consumo di tempo.
Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule staminali pluripotenti adulte che sono state ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa. Poiché le MSC derivate da tessuti somatici sono limitate da donazioni limitate, variazioni di qualità e biosicurezza, negli ultimi 10 anni si è assistito a un grande aumento degli sforzi per generare MSC da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Gli sforzi passati e recenti nella differenziazione delle hiPSC in MSC sono stati incentrati su due metodologie di coltura: (1) la formazione di corpi embrioidi (EB) e (2) l’uso di colture monostrato. Questo protocollo descrive questi due metodi rappresentativi per derivare le MSC dalle hiPSC. Ogni metodo presenta i suoi vantaggi e svantaggi, tra cui il tempo, il costo, la capacità di proliferazione cellulare, l’espressione dei marcatori MSC e la loro capacità di differenziazione in vitro. Questo protocollo dimostra che entrambi i metodi possono derivare MSC mature e funzionali dalle hiPSC. Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica, mentre il metodo EB è caratterizzato da un minor consumo di tempo.
Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule staminali pluripotenti adulte derivate dal mesoderma1. Le MSC sono presenti in quasi tutti i tessuti connettivi2. Da quando le MSC sono state scoperte per la prima volta negli anni ’70 e isolate con successo dal midollo osseo nel 1987 da Friedenstein et al.3,4,5, una varietà di tessuti somatici umani (inclusi fetali e adulti) sono stati utilizzati per isolare le MSC come ossa, cartilagine, tendini, muscoli, tessuto adiposo e stroma di supporto ematopoietico 1,2,6,7. Le MSC dimostrano elevate capacità proliferative e plasticità per differenziarsi in molte linee cellulari somatiche e potrebbero migrare verso tessuti danneggiati e infiammati 2,8,9. Queste proprietà rendono le MSC un potenziale candidato per la medicina rigenerativa10. Tuttavia, le MSC derivate da tessuti somatici (st-MSC) sono limitate da una donazione limitata, da una limitata capacità proliferativa cellulare, da variazioni di qualità e da preoccupazioni di biosicurezza per la possibile trasmissione di agenti patogeni, se presenti, dai donatori11,12.
Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) derivano dalla riprogrammazione di cellule adulte con fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc), che hanno funzioni simili a quelle delle cellule staminali embrionali13,14. Possono auto-rinnovarsi e possedere il potenziale di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellule somatiche, comprese le MSC. Rispetto alle st-MSC, le iPSC-MSC hanno il vantaggio di una fornitura illimitata, un costo inferiore, una maggiore purezza, convenienza nel controllo di qualità, facile per la produzione su larga scala e la modificazione genica 15,16,17.
A causa di questi vantaggi delle iPSC-MSC, sono stati riportati una varietà di metodi che guidano le MSC dalle iPSC. Questi metodi di differenziazione sono stati incentrati su due metodologie di coltura: (1) la formazione di corpi embrioidi (EB) e (2) l’uso di colture monostrato 11,18,19,20. In questo caso, è stato caratterizzato un approccio rappresentativo per ciascuna delle due metodologie. Inoltre, sono stati effettuati confronti tra due approcci rappresentativi basati su tempo, costo, capacità proliferativa, espressione di biomarcatori MSC e capacità di differenziazione in vitro.
In questo protocollo, sono stati esaminati due metodi rappresentativi di differenziazione delle hiPSC in MSC: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Entrambi i metodi erano in grado di derivare l…
The authors have nothing to disclose.
Siamo estremamente grati a tutti i membri del Mao and Hu Lab, passati e presenti, per le interessanti discussioni e i grandi contributi al progetto. Siamo grati al National Clinical Research Center for Child Health per il grande supporto. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), dalla Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu).
Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
Proline | Solarbio | P0011 | |
Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
Versene | Gibco | 15040-66 | |
Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |