Summary
이 원고는 곰팡이 식물 병원체와의 옥수수 상호 작용에 대한 재현 가능한 세포학적, 생리학적, 분자적 연구를 위해 분리된 옥수수 잎 덮개를 사용하는 최적화된 접종 프로토콜을 자세히 설명합니다. 잎 덮개는 고정되지 않은 조직에서 살아있는 식물과 곰팡이 사이의 세포 상호 작용을 실시간으로 관찰할 수 있도록 합니다.
Abstract
우리는 옥수수 잎 덮개에 hemibiotrophic 및 necrotrophic foliar pathogenic fungi를 접종하기 위한 프로토콜을 최적화했습니다. 이 방법은 원래 벼 잎 덮개에 적용되었던 방법에서 변형되어 살아있는 식물 세포의 곰팡이 성장 및 발달을 직접 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 두 개의 완전히 나온 잎 고리가 있는 옥수수 묘목에서 채취한 잎초는 5 x 105 포자/mL 곰팡이 포자 현탁액의 20μL 방울을 접종하고 연속 형광등 아래에서 23°C의 습도 챔버에서 배양합니다. 24-72시간 후, 과도한 조직을 면도날로 제거하여 표피 세포의 단일 층을 남기며, 화학적 고정이나 투명화 없이 직접 이미지를 얻을 수 있는 광학적으로 투명한 샘플입니다. 식물과 곰팡이 세포는 실험 기간 동안 살아 있으며 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 외피는 감염 및 집락화 중 숙주 및 병원체 세포의 발달 세포학 및 생존력을 연구하기 위해 염색하거나 형질분해를 실시할 수 있습니다. 형광 단백질을 발현하도록 형질전환된 곰팡이 균주는 분리능을 높이고 경쟁적 또는 시너지 상호작용의 평가를 용이하게 하기 위해 외피에 접종하거나 동시 접종할 수 있습니다. 형광 융합 단백질을 발현하는 곰팡이 균주는 planta에서 이러한 개별 단백질의 생산 및 표적화를 추적하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 접종된 수초 조직을 추출하여 핵산, 단백질 또는 대사 산물을 특성화할 수 있습니다. 이러한 외피 분석법의 사용은 옥수수의 곰팡이 병원성 메커니즘과 병원성에 기여하는 곰팡이 단백질 효과기 및 2차 대사 산물의 메커니즘에 대한 자세한 연구를 크게 발전시켰습니다.
Introduction
세포 수준에서의 공간적 및 시간적 분석은 곰팡이-식물 상호 작용의 생리학 및 세포학을 이해하는 데 매우 중요합니다. 화학적으로 고정된1,2,3 또는 투명화 및 염색4된 엽면 조직(folar tissue)4과 인공 막(artificial membrane)5은 과거에 엽면 병원균 발달 및 식물-진균 상호작용의 세포학을 조사하기 위해 사용되었다. 그러나 고정이나 투명화 없이 살아있는 숙주 조직의 감염 사건을 실시간으로 조사하는 것은 이미징을 위한 광학적으로 투명한 샘플 준비와 관련된 기술적 문제로 인해 어렵습니다.
분리형 잎집 접종 프로토콜은 1940년대 후반에 벼 돌풍균 Magnaporthe oryza6에 대한 살아있는 벼 표피 세포의 내성에 대한 명시야 현미경 조사를 위해 개발되었습니다. 보다 최근에, Colletotrichum 및 Magnaporthe 종에 의한 숙주 집락화에 대한 상세한 분자, 생리학 및 세포학적 관찰은 형광 단백질을 발현하는 곰팡이 형질전환체와 이 잎집 방법의 변형된 버전, 및 epifluorescence 및 confocal microscopy를 포함한 고성능 살아있는 세포 이미징 프로토콜을 결합함으로써 크게 촉진되었습니다 7,8,9,10,11,12,13.
이 논문은 hemibiotrophic 및 necrotrophic foliar fungal pathogens에 의한 감염 과정을 관찰하기 위해 분리된 옥수수 잎 덮개를 사용하는 최적화된 접종 프로토콜을 자세히 설명합니다. 우리는 특히 탄저병 잎마름병과 줄기썩음병의 원인균인 콜레토트리쿰 그라미니콜라(C. graminicola)와 디플로디아 잎마름병과 줄기썩음병을 유발하는 스테노카펠라 마이디스를 연구하는 데 사용했습니다. 그러나 이 방법은 다른 반생물영양 및 괴사영양성 엽면 곰팡이 병원체에도 적용할 수 있어야 합니다. 이러한 절제된 잎초에서 감염 및 집락화 사건 동안의 세포학적 및 생리학적 반응은 전체 잎 잎의 반응과 유사하다12,14,15. 또한, C. graminicola에 의한 외피 피복 세포의 hemibiotrophic colonization은 stalk pith cell16,17의 colonization과 유사합니다. 분리된 외피는 잎 잎 또는 줄기 속조직보다 곰팡이 침투 및 집락화의 더 큰 동시성과 실험적 재현성을 보여준다14,16,17,18. 대부분의 옥수수 품종은 이 프로토콜에 사용할 수 있습니다. 그러나 외피에 과도한 보라색 안료가 있는 근친 교배나 잡종은 안료가 이미징을 방해하기 때문에 적합하지 않습니다. Golden Jubilee sweet corn은 처리되지 않은 씨앗이 상업적으로 이용 가능하고 식물이 많은 잎 질병에 매우 취약하며 온실에서 잘 자라기 때문에 우리 연구에 특히 유용했습니다. 미국에서 탄저병 줄기 썩음병의 첫 번째 전염병은 1970 년대 인디애나에서 옥수수 작물의 완전한 손실을 초래했습니다19,20. 이 잎집 접종 방법은 살아있는 식물 세포와 국소 사멸된 식물 세포에서 곰팡이 성장 및 발달을 직접 관찰 및 정량화하고, 곰팡이 감염에 대한 양립/비호환 반응의 내성 반응을 입증하고, 동일한 잎집에서 곰팡이 균주 간의 상호 작용을 실시간으로 테스트하는 데 적용할 수 있습니다.
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Protocol
참고: 이 방법의 작업 흐름은 그림 1에 나와 있습니다.
그림 1: 분리된 옥수수 잎 덮개를 사용한 최적화된 접종 프로토콜의 단계. 포자 현탁액 준비, 잎집 접종 및 살아있는 세포 현미경을 위한 샘플 준비는 각각 녹색(A), 보라색(B) 및 주황색(C) 상자로 강조 표시됩니다. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 식물 및 곰팡이 물질
- 식물 성장
- SC10 용기의 온실(14시간 조명/27°C 및 10시간 어두움/22°C)에서 옥수수 묘목( 재료 표 참조)을 재배합니다( 재료 표 참조). 상업용 화분용 흙 3개(재료 표 참조)와 2개 부분의 증기 멸균 표토로 구성된 성장 배지를 사용하십시오.
- 매일 아침에 한 번 오버 헤드 관개 시스템으로 묘목에 2 분 동안 물을줍니다.
- V2 단계에서 묘목을 토양 수준에서 잘라 수확합니다. V2 성장 단계는 묘목의 높이가 5-10cm이고 두 개의 눈에 보이는 고리 모양의 잎이 있을 때 도달한다21.
- 젖은 종이 타월로 식물을 감싸고 추가 처리를 위해 실험실로 운반하기 위해 비닐 봉지에 넣습니다.
- 곰팡이 문화
- 감염된 실리카의 약 50 과립을 적절한 한천 배지에 뿌려서 무균 조건 하에서 저장된 곰팡이 실리카 스톡 배양액을 재활성화시킨다22. 형태학적 변화와 병원성 손실을 피하기 위해 하위 배양 변형은 재활성화 후 3배 이하입니다. 감자 포도당 한천(PDA, 재료 표 참조)은 C. graminicola 를 배양하는 데 일상적으로 사용되는 반면 오트밀 한천(OA, 재료 표 참조)은 S. maydis에 사용됩니다.
- 곰팡이 스톡을 배양하기 위한 PDA를 준비하려면 상업적으로 제조된 탈수된 PDA 19.5g을 500mL의 탈이온수(DI)에 현탁시킵니다. 골관절염을 만들려면 시중에서 판매되는 탈수 골수염 36g을 탈이온수에 넣고 15-30분 동안 끓인 다음 무명천을 세 겹 걸러낸 다음 탈이온수로 여과액을 500mL로 만듭니다. 멸균할 오토클레이브 배지.
- 형질전환 균주로 작업할 때 적절한 항생제(예: hygromycin B, geneticin)로 용융되고 냉각된 배지를 보강합니다. 500mL의 배지에서 히그로마이신 또는 제네티신의 최종 농도는 각각 250μg/mL 및 100μg/mL입니다.
- 포자 균사체가 발달할 때까지 최적의 조건에서 배양물을 배양합니다. Colletotrichum graminicola 와 S. maydis 는 지속적인 형광등 및 주변 습도 수준에서 23 °C에서 잘 자랍니다. 포자 형성은 S. maydis 의 경우 접종 후 7일(dai), C. graminicola의 경우 14일 후에 발생합니다.
2. 잎집 접종
- 유리솜 필터 장치 어셈블리
- 튼튼한 가위나 가위를 사용하여 캡을 잘라내고 1.5mL 미세 원심분리기 튜브의 원뿔형 바닥에서 약 0.5mm를 잘라냅니다( 재료 표 참조).
- 그림 0.5와 같이 절단 튜브 안에 유리솜 조각(약 0.5cm x 2cm, 재료 표 참조)을 놓아 중앙 구멍을 덮습니다.
- 유리솜을 절단하는 동안 붕규산 유리는 자극을 유발할 수 있으므로 장갑을 착용하십시오.
- 잎집 지지대 준비
- 그림 3A와 같이 스커트가 없는 96웰 PCR 플레이트(재료 표 참조)를 6개의 2컬럼(8 x 2웰) 지지 랙으로 자릅니다.
- 웰의 원뿔형 바닥이 위를 향하고 평평한 상단이 아래를 향하도록 2열 랙을 뒤집습니다(그림 3B).
- 각 지지대를 축축한 여과지가 들어 있는 유리 페트리 플레이트에 놓고 뚜껑으로 덮습니다( 재료 표 참조). 이 장치는 덮개의 작은 습도 챔버 역할을 합니다.
- 접종 준비
- 각 곰팡이 균주에 대해 조립된 유리솜 필터 장치 하나를 그림 2와 같이 온전한 멸균 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 후자는 수집 튜브 역할을 합니다.
- 튜브에 라벨을 붙입니다.
- 먼저 각 플레이트에 3-4mL의 멸균 DI 물을 주입하여 포자 배양액에서 분생포자를 수확합니다. 어떤 경우에는 콜로니 표면에 액체 층을 생성하기 위해 더 많은 물이 필요할 수 있습니다. 이 시스템에는 습윤제가 필요하지 않습니다.
- 멸균 원뿔형 팁 유봉( 재료 표 참조)을 사용하여 한천에서 포자를 풀어 전체 접시를 고르게 긁어냅니다.
- 포자 현탁액 1mL를 유리솜 필터 장치에 무균 상태로 적용하고 포자가 중력에 의해 수집 튜브로 흐르도록 합니다.
- 여과된 포자 현탁액이 포함된 수집 튜브를 3,500 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 포자는 미세 원심분리기 튜브의 바닥에 펠릿화되어야 합니다.
참고: C. graminicola 포자를 여기에서 권장하는 것보다 더 빠른 속도로 원심분리하면 생존력이 크게 손실됩니다. - 액체를 오토클레이브 용기에 붓고 멸균 DI 물 1mL를 첨가한 다음 펠릿 포자를 재현탁하도록 부드럽게 저어줍니다. 2.3.6단계에서와 같이 원심분리기.
- 포자를 3번 씻어 발아 또는 침투를 감소시킬 수 있는 자동 억제제를 포함할 수 있는 원추형 매트릭스를 제거합니다.
- 세 번째 세척 후 300-500μL의 멸균 DI 물을 추가하여 정량을 위해 포자를 재현탁시킵니다.
- 포자 농도를 측정하기 위해 100x 배율의 복합 현미경 아래에서 혈구계를 사용합니다. 계산하기 전에 포자 염색이 필요하지 않습니다.
- 멸균 DI 워터로 5 x 105 포자/mL 현탁액을 준비합니다.
알림: C. graminicola 포자 현탁액은 생존력이 급격히 떨어지기 전에 실온에서 4시간 이상 보관할 수 없습니다. 분생포자를 냉장 보관한다고 해서 생존력이 증가하지는 않습니다.
- 시스 접종
- 곰팡이 균주를 식물에 접종하기 전에 관련 생물 안전 관행 및 절차를 확인하십시오.
- 외피의 겹치는 여백을 따라 엄지손톱을 실행하여 V2 묘목의 첫 번째 실제 잎에서 외피를 제거하고 싹에서 부드럽게 풉니다. 제거하기 전에 촬영의 양쪽에서 덮개를 풉니다.
- 회수된 잎 덮개를 3-5cm 조각으로 자릅니다. 접종 전에 칼집을 표면에서 소독할 필요는 없습니다.
- 각 세그먼트를 매우 부드럽게 풀어 안쪽(adaxial) 표피층을 노출시킵니다.
- 접종을 위해 칼집을 준비하는 동안 나머지 절제된 칼집은 젖은 종이 타월로 싸서 건조를 방지하십시오.
- 그림 20과 같이 곰팡이 포자 현탁액의 4μL를 중간 갈비뼈 바로 위의 외피 조각 중앙에 있는 내부 표면에 놓습니다.
- 그림 5와 같이 축축한 여과지가 들어 있는 유리 페트리 플레이트 내부의 지지대에 중간 갈비뼈가 바닥에 오도록 접종된 잎 덮개를 수평으로 놓습니다.
- 각 랙에는 최대 7개의 피복이 있습니다. 시료 전처리 또는 배양 중에 발생할 수 있는 복제 손실을 보상하기 위해 균주당 최소 5개의 칼집을 접종합니다.
- 작은 습도 챔버를 적신 발아지를 깐 투명한 보관 상자에 넣습니다( 재료 표 참조).
- 뚜껑으로 상자를 덮으십시오. 23 °C에서 상자를 의도 한 시간 동안 연속 조명으로 배양하며, 이는 곰팡이와 관찰 될 곰팡이 발달 단계에 따라 다릅니다. C. graminicola 를 접종한 옥수수 외피의 시간 경과에 대한 요약은 표 1에 나와 있습니다.
- 칼집에 질병의 징후/증상이 있는지 매일 확인하고 발아와 여과지를 모두 촉촉하게 유지하십시오. 잎초는 접종이 없을 때 명백한 식물 세포 사멸 또는 분해 없이 최대 6일 동안 유지될 수 있습니다.
그림 2: 유리솜 필터 장치 준비. (A) 0.5cm x 0.5cm 유리솜 볼을 원뿔형 바닥이 제거된 미세 원심분리기 튜브(1) 내부에 배치합니다. (비씨) 그런 다음 필터 튜브를 마이크로 원심 분리기 튜브 (2)에 배치하여 포자 현탁액 준비를 위해 조립 된 필터 장치를 생성합니다. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 스커트가 없는 96웰 PCR 플레이트를 절단하는 방법. (A) PCR 플레이트를 6개의 지지 랙, 8 x 2 웰로 절단합니다. 단일 피복 지지대의 예가 (B) 에 설명되어 있습니다. 잎 덮개는 지지대에 수평으로 놓여 있습니다. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 칼집 접종 방법. 접종물 한 방울을 외피 부분의 인접 표면에 직접 도포합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 시스 배양 방법. 접종된 잎 덮개는 축축한 여과지가 들어 있는 유리 페트리 플레이트 내부의 지지 랙에 수평으로 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 살아있는 세포 현미경 검사
- 현미경 검사를 위한 시료 전처리
- 칼집 조각을 멸균 DI 물로 부드럽게 헹구어 부착되지 않은 포자나 표재성 곰팡이 성장을 제거합니다.
- 외피 조각의 인접(내부) 표면이 아래를 향하고 축(외부) 표면이 가장 위에 있도록 깨끗한 유리 현미경 슬라이드( 재료 표 참조)에 외피를 놓습니다.
- 새로운 외날 면도날( 재료 표 참조)을 사용하여 외피 끝에서 약 1cm 잘라내고 중간 갈비뼈 양쪽에 있는 대부분의 라미나 조직을 제거합니다.
- 면도날을 칼집에 대해 90° 각도로 잡고 복축 중간 갈비뼈에서 조직을 면도하고 접종 부위 위의 부축 표면에 표피층을 노출시킵니다. 균일한 두께를 유지하십시오. 잎 덮개를 깎은 후에는 샘플이 손상될 수 있으므로 더 이상 다듬지 않는 것이 좋습니다.
- 면도한 부분의 크기가 1cm x 1cm를 넘지 않도록 하십시오. 이 과정에서 피복의 중앙을 누르지 마십시오. 다른 포자 현탁액이 접종 된 칼집으로 작업 할 때는 장갑을 소독하고 샘플 사이에 면도날을 교체하십시오.
- 깨끗한 유리 현미경 슬라이드를 준비하십시오. 한쪽 가장자리에서 피복 부분을 들어 올려 새 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 외피의 접종된(adaxial) 표면은 대물렌즈에 가장 가까운 맨 위에 있어야 합니다. 곰팡이 구조물의 손상을 방지하기 위해 섹션을 부드럽게 장착하십시오.
- 60μL의 멸균 DI 물을 섹션에 적용하고 24mm x 60mm 유리 커버슬립을 추가합니다( 재료 표 참조). 기포를 피하기 위해 천천히 수행하십시오.
- 현미경 검사를 할 준비가 되면 각 가장자리에 작은 방울을 떨어뜨린 다음 매니큐어 브러시로 방울을 연결하여 투명한 매니큐어( 재료 표 참조)로 커버슬립을 밀봉하여 매끄럽게 밀봉합니다.
참고: 이 시스 프로토콜은 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI), 중성 적색 또는 트리판 청색과 같은 세포학적 염색과 함께 사용하거나 식물 세포 생존율을 평가하기 위한 세포 형질 분해 관찰에 사용할 수 있습니다. 외피 염색 또는 세포 형질 분해 분석의 경우 커버슬립을 밀봉하지 마십시오. - 형질분해 분석의 경우 커버슬립의 한쪽 가장자리에 고긴장성 용액(0.75M 자당 또는 1M 염화나트륨)을 추가하고 접힌 보푸라기가 없는 티슈 페이퍼를 사용하여 샘플을 가로질러 커버슬립의 다른 쪽 가장자리로 용액을 그립니다. 염색의 경우 유사한 방법을 사용하여 염색 용액을 바르십시오.
- 광시야 현미경 검사
- 잎 덮개가 현미경 슬라이드에 장착되면 400x 배율의 광시야 광학 현미경을 사용하여 곰팡이 집락화를 검사합니다.
- 곰팡이 구조를 자세히 관찰하려면 샘플의 이미지 품질을 높이기 위해 오일 대신 물 침지 대물렌즈를 사용하십시오. 굴절률 불일치로 인한 구면 수차는 이미지 품질 저하를 유발할 수 있습니다. 물대물렌즈는 광시야 광학 현미경과 컨포칼 현미경에 사용할 수 있습니다.
- 외피당 집락화의 상대적 양을 결정하려면 광시야 광학 현미경을 사용하여 100x 배율로 각 곰팡이 침투 부위에서 침입한 옥수수 세포의 수를 계산합니다. 이 정량화는 균주, 치료 및/또는 발달 단계를 비교하는 통계 분석 전에 적절한 스크리닝 단계입니다.
- 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경
- 형질전환 진균 균주가 발달하는 동안 옥수수 조직의 형광 단백질을 관찰하려면 기본 이미지 획득 매개변수를 조정하십시오. 선택한 형광 마커를 기반으로 최상의 여기/방출 설정을 식별합니다.
참고: 분비된 단백질로 구성된 형광 융합체를 분석할 때는 60x 물 대물렌즈가 바람직합니다. 최신 컨포칼 현미경은 아티팩트와 형상 수차를 방지하기 위해 고도로 보정된 수액 대물렌즈를 갖추고 있습니다. - 형광 단백질의 살아있는 세포 이미징을 의도하는 경우, 자가형광을 위한 대조군으로 비형질전환된 진균 균주를 사용하십시오. 다음 이미지 획득 파라미터를 사용하여 도립 컨포칼 현미경과 mCherry 형광 단백질에서 진균-숙주 역학을 캡처할 수 있습니다. 레이저 출력을 최대 5%, 발현 수준에 따라 450-600 고전압(HV), 1.375 X 게인, 3% 오프셋, 섹션당 최대 5개의 옥수수 세포 분석을 위한 광학 줌 계수 1, 개별 균사에 대한 광학 줌 계수 2-5로 설정합니다.
참고: 고해상도 Z 스택 공초점 이미지는 3차원 데이터와 숙주와 병원체 간의 실시간 상호 작용에 대한 더 나은 보기를 제공합니다. - 분비된 융합 단백질에 해당하는 형광 강도를 정량화하려면 컨포칼 제조업체의 이미지 분석 소프트웨어 또는 온라인에서 무료로 다운로드할 수 있는 ImageJ와 같은 이미지 처리 프로그램을 사용하십시오. 그에 따라 형광 신호를 정량화하는 방법에 대한 자세한 내용은 설명서를 참조하십시오.
- 형질전환 진균 균주가 발달하는 동안 옥수수 조직의 형광 단백질을 관찰하려면 기본 이미지 획득 매개변수를 조정하십시오. 선택한 형광 마커를 기반으로 최상의 여기/방출 설정을 식별합니다.
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Representative Results
아래 예는 옥수수 잎 외피 접종 방법을 사용한 후의 대표적인 결과를 설명합니다. 이 예는 이 최적화된 분석을 통해 옥수수-곰팡이 상호 작용의 관찰 및 비교를 실시간으로 수행할 수 있는 용이성, 속도 및 정밀도를 보여줍니다. 또한 살아있는 세포 이미징을 통해 정량적 정보를 추출할 수 있어 비교 분자, 세포학 및 생리학적 연구에 유용한 도구를 제공합니다. 자세한 내용은 각 성공적인 출원에 대해 인용된 원본 간행물에서 확인할 수 있습니다.
예제 데이터 1: 곰팡이 상태 평가 및 곰팡이 감염에 대한 식물 반응 감지를 위해 접종된 잎초에서 염색 및 플라스몰분해 사용
옥수수 잎 덮개는 밝은 시야 현미경으로 살아있는 숙주 세포에서 Colletotrichum graminicola 및 Stenocarpella maydis 의 감염 과정을 시각화하고 비교하는 데 사용되어 집락화 패턴과 시간 경과에 대한 자세한 설명이 가능합니다(미발표 결과; 그림 6).
이 연구는 S. maydis가 멜라닌 압제증을 생성하는 C. graminicola와 달리 미분화 균사 팽창을 통해 표피 세포에 직접 빠르게 침입한다는 것을 밝혔습니다. 표피 세포 내부로 들어가면 두 병원체는 겉보기에 온전한 세포벽을 통과하여 세포에서 세포로 진행됩니다(그림 6A,B).
피복은 곰팡이 균사 군집의 특성과 정도를 보다 쉽게 평가하기 위해 트리판 블루 또는 DAPI로 염색할 수 있습니다(그림 6). 트리판 블루 염색은 C. graminicola가 처음에는 매우 좁은 연결을 통해 세포 사이를 이동하는 두꺼운 1차 균사를 통해 침입한다는 것을 보여줍니다. 나중에, 균류는 괴사 영양 단계로 전환하여 군체의 중앙에 더 얇은 2 차 균사를 생성합니다 (그림 6 CE) 12,14,16,17.
그림 6: 명시야 또는 epifluorescence 현미경으로 이미지화한 염색되지 않은 또는 염색된 접종 옥수수 잎 외피. (A) Stenocarpella maydis를 사용한 접종 후 48시간(hpi)의 세포 내 균사. 감염은 약간 부풀어 오른 균사 끝(화살표)을 통해 발생합니다. (B) Colletotrichum graminicola를 함유한 세포 내 균사 48 hpi. 감염은 흑색화 압제(화살표)를 통해 발생합니다. (C) C. graminicola의 균사, 트리판 블루로 염색, 좁은 연결부(화살표)를 통해 전진하는 콜로니 가장자리에서 세포 간 진행, 72hpi. (D) 좁은 연결(화살표)을 통해 옥수수 세포벽을 통과하는 72hpi에서 C. graminicola의 트리판-블루 염색 균사를 자세히 봅니다. (E) 콜로니 센터 72 hpi에서 trypan blue로 염색 된 C. graminicola의 균사. 더 좁은 2차 균사는 더 두꺼운 1차 균사(화살표)에서 나오는 것을 볼 수 있습니다. (F) C. graminicola 72 hpi의 균사, DAPI로 염색된 잎 덮개의 전진 군체 가장자리. 염색된 곰팡이와 식물 핵은 자외선 아래에서 형광을 발합니다. 각 패널의 스케일 바는 50μm입니다. 에피형광 현미경과 결합된 단색 디지털 카메라를 사용하여 얻은 현미경 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
외피는 중성 적색으로 염색하거나 병원성 곰팡이에 의한 감염 및 집락화 중 옥수수 세포의 발달 세포학 및 생존력을 연구하기 위해 형질 분해를 실시할 수 있습니다(그림 7).
콜레토트리쿰 그라미니콜라(Colletotrichum graminicola)는 막에 의해 숙주 세포질에서 분리된 두꺼운 1차 균사로 살아있는 옥수수 세포에 침입하는 반생물영양균(hemibiotrophic fungus)입니다(그림 7A-C)12,14,16,17). 반면에 Stenocarpella maydis는 괴사성 곰팡이로 식물 독소23을 생성하고 표피 세포(과립화되어 플라스몰분해에 실패함)를 침범하기 전에 죽입니다(그림 7D).
C. graminicola 및 기타 엽면 병원균에 대한 옥수수 방어는 활성 산소 종 (ROS), 특히 과산화수소 (H 2 O2 ) 12,15의 축적을 포함합니다. 식물-병원균 상호작용의 산화 화학을 조사하기 위해, 3,3′-디아미노벤지딘(DAB)을 세포 염색에 사용할 수 있다24. DAB는 H 2 O2에 의해 산화되어 옥수수 잎 덮개에서 볼 수있는 짙은 갈색 침전물을 생성합니다 (그림 7 E, F) 12,24. 안료의 생산은 숙주 저항 반응과 관련된 산화 폭발의 지표입니다.
그림 7: 명시야 현미경으로 이미징한 염색 및/또는 플라스몰라이즈된 접종된 옥수수 잎 외피. (A) C. graminicola 24 hpi를 접종하고 플라스몰분해를 거쳐 중성 적색으로 염색한 잎초. 압제(화살) 아래의 살아있는 옥수수 세포는 플라스몰분해 및 염색을 통해 병원균이 침입 전에 세포를 죽이지 않는다는 것을 보여줍니다. (B) C. graminicola가 함유 된 잎 칼집 48 hpi, plasmolysis를 거쳐 중성 적색으로 염색합니다. 1차 균사(화살)에 의해 식민지화된 옥수수 세포는 여전히 살아 있어 C. graminicola가 생물 영양 생물로 세포에 침입한다는 것을 입증합니다. (C) C. graminicola가 있는 잎집 48 hpi, 군체의 전진 가장자리에서 균사가 세포 간 이동을 보여줍니다. 외피는 플라스몰라이즈(plasmolyzed)되었지만 염색되지는 않았습니다. 콜로니 가장자리(화살표)에 인접한 콜로니화되지 않은 세포는 계속해서 플라스몰분해됩니다. (D) 침투 전에 S. maydis가 있는 잎집 24hpi. 발아된 포자(화살표) 아래의 세포는 과립화되어 있고 플라스몰분해에 실패하여 S. maydis가 침투 전에 세포를 죽이고 괴사로 행동한다는 것을 나타냅니다. (E) C. graminicola와 함께 Mp305 24 hpi를 근친 교배하고 DAB로 염색 한 저항성 옥수수의 잎 덮개. 어두운 염색은 이미지 중앙에서 단일 세포의 강한 산화 반응을 나타내는 반면, 갈색 색소의 후광은 대부분의 개별 압제증을 둘러싸고 볼 수 있으며 사진 상단의 세포에서 과립화를 관찰할 수 있습니다. (F) 압제증 주위에 축적된 갈색 색소의 후광과 근처의 옥수수 세포벽에 색소가 침착된 것을 자세히 본 것(화살표). 각 패널의 스케일 바는 20μm인 (F)를 제외하고 50μm입니다. 에피형광 현미경과 결합된 단색 디지털 카메라를 사용하여 얻은 현미경 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
예제 데이터 2: 형광 단백질을 발현하는 곰팡이를 사용한 살아있는 세포 이미징
세포질 형광 단백질을 발현하는 곰팡이 균사는 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 염색 없이 살아있는 수초 세포에서 고해상도로 시각화할 수 있습니다(그림 8).
형광 단백질은 식물의 살아있는 곰팡이 세포에서 위치와 활동을 추적하기 위해 미토콘드리아, 핵 또는 내막 시스템과 같은 다양한 진균 소기관을 표적으로 삼을 수 있습니다(그림 8C)25,26,27,28(미공개 결과). 형광 단백질은 또한 다양한 기능에 대한 리포터 역할을 하기 위해 다른 진균 프로모터에 의해 구동될 수 있습니다: 예를 들어, BiP 샤페론 분비 스트레스 반응 단백질에 의해 구동되는 RFP가 표시됩니다(그림 8D)29(미공개 결과). 잎 덮개를 사용하면 곰팡이 균사가 숙주 세포를 식민지화할 때 축적되고 분비되는 개별적으로 태그된 형광 융합 단백질을 시각화할 수 있습니다 8,9(그림 8E). 다양한 세포 구획, 예를 들어, 핵 또는 원형질막에 표적이 되는 형광 단백질을 발현하는 형질전환 옥수수 라인도 이용 가능하고(30,31), 옥수수 세포 구조, 예를 들어, 핵에 대한 감염의 영향을 평가하기 위한 접종에 사용될 수 있다. 이러한 형질전환 옥수수 계열의 사용은 침습되지 않은 옥수수 세포의 핵이 전형적으로 C. graminicola에 의해 이미 식민지화된 세포에 가장 가까운 세포벽으로 이동한다는 것을 입증했다(미발표 결과; 그림 8F).
그림 8: 형광 단백질을 발현하는 Colletotrichum graminicola의 형광(A, B) 또는 공초점(C, D, E, F) 이미징. (A) ToxA 프로모터34의 제어 하에 mRFP를 세포질적으로 발현하는 C. 그라미니콜라 균주를 가진 염색되지 않은, 플라스몰라이즈된 잎초(48hpi). 상당한 자가형광은 또한 이 잎 덮개에서 발견됩니다. (B) ToxA 프로모터의 제어 하에 SGFP를 세포질적으로 발현하는 C. 그라미니콜라 균주를 사용한 염색되지 않은 잎집 48hpi. (C) HDEL 앵커(35)로 내막 시스템을 표적으로 하는 SGFP를 발현하는 콜레토트리쿰 그라미니콜라. (D) BiP 샤페론의 C. graminicola 상동체에 대한 프로모터의 제어하에 mRFP로 형질전환된 C. graminicola를 함유한 염색되지 않은 잎초 24hpi. 1차 균사의 적색 형광은 분비 스트레스에 대한 반응으로 BiP 활성화를 나타내는 지표입니다. (E) 44hpi에서 옥수수 잎 외피 세포벽을 가로지르는 C. graminicola WT 1차 균사에서 아라비노푸라노시다아제::mCherry 융합 단백질의 축적. (F) ToxA 프로모터의 제어 하에 mRFP를 세포질적으로 발현하는 C. graminicola 균주를 사용하여 식물 핵30,31, 48 hpi를 표적으로 하는 YFP를 발현하는 형질전환 옥수수 계열의 잎초. 각 패널의 스케일 바는 50μm인 패널 A를 제외하고 20μm와 같습니다. 현미경 사진은 형광 현미경과 결합된 단색 디지털 카메라를 사용하여 획득했습니다. (C-F)의 이미지는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 캡처되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
예제 데이터 3: 옥수수 잎 덮개를 사용하여 곰팡이 균주 간의 양립가능/비양립 반응 및 상호 작용에 대한 자세한 세포학을 조사합니다.
비병원성 C. graminicola 돌연변이 균주(cpr1 MT)를 옥수수 잎초의 야생형(WT) 균주와 비교했습니다(그림 9A,B)12.
세포질 형광 단백질로 표지된 균주의 생세포 이미징은 돌연변이가 옥수수 잎 덮개 내에서 세포에서 세포로 이동할 때 특이적으로 손상되었음을 보여주었습니다. Sheath 프로토콜은 cpr1 MT가 95%의 시간 동안 첫 번째 집락화된 세포에 국한되어 있음을 보여주는 정확한 정량화를 가능하게 했습니다(그림 9C)12. 이는 WT와 현저한 대조를 이루는데, WT에서는 감염의 5% 미만이 같은 기간 동안 첫 번째 집락화된 세포 내에 머물렀다12. 흥미롭게도, cpr1 MT는 WT 균주와 같이 국소 동결 사멸 수초에서 처음 감염된 세포를 넘어 부생식학적으로 성장할 수 있었습니다(그림 9D). 이는 cpr1 MT의 집락화 불능이 살아있는 옥수수 세포의 적극적인 반응과 특이적으로 관련되어 있음을 나타냈다.
잎초 접종 분석법은 GFP-발현 cpr1 MT 및 RFP-발현 WT 균주를 동일한 잎초12에 병용함으로써 이들을 시험하기 위해 사용하였다. 균주를 서로 가깝게 접종했을 때(옥수수 세포를 8개 이하로 떨어뜨려 놓음) cpr1 MT는 세포에서 세포로 생물 영양 생물로서 정상적으로 성장할 수 있었습니다(그림 9E,F). 플라스몰 분해 분석은 cpr1 MT 곰팡이가 살아있는 세포에 들어간 것을 확인했다12. 이러한 모든 상세한 관찰은 외피 분석에 의해 가능해졌으며 C. graminicola의 WT 균주에 의해 생성되지만 cpr1 MT12에는 없는 호환성을 유도하는 확산성 인자의 존재를 암시했습니다.
그림 9: Colletotrichum graminicola의 WT 및 cpr1 MT 균주와 관련된 양립 및 비양립 상호 작용. 상이한 형광 단백질의 사용은 옥수수 잎 외피에 동시 접종되었을 때 두 균주를 구별할 수 있게 하였다12. (A) 48hpi에서 옥수수 잎 덮개에서 세포질 mRFP를 발현하는 WT C. graminicola 균주. (B) 72hpi의 옥수수 잎 외피에서 SGFP를 발현하는 C. graminicola cpr1 MT 균주. cpr1 MT는 접종 후 최대 6일까지도 처음 감염된 세포를 넘어 집락화하는 경우(<5%)만 드뭅니다. (C) 72dpi에서 SGFP를 발현하는 C. graminicola cpr1 MT 균주의 면밀한 보기. 이 경우 세포벽을 건너 다음 세포로 들어갈 수 있었지만 발달을 멈췄습니다. (D) SGFP를 발현하는 C. graminicola cpr1 MT 균주, 사멸된 외피 조직에서 48hpi. cpr1 MT 균주는 WT와 유사하게 무생물 옥수수 수초 세포를 빠르게 식민지화합니다. (E) WT-mRFP C. graminicola 및 cpr1 MT-GFP C. GRAMINICOLA 균주가 옥수수 잎 외피(48hpi)에 가깝게 함께 접종될 때, cpr1 MT-GFP 균주는 생물 영양 생물로서 살아있는 옥수수 수초 세포를 통해 정상적으로 진행할 수 있는 능력을 회복합니다. 살아있는 세포 내부의 생물 영양 성장은 plasmolysis assay에 의해 확인되었습니다. (F) SGFP를 발현하는 C. graminicola cpr1 MT 균주에 대한 면밀한 관찰, WT에 인접하여 접종할 때 세포에서 세포로 성장합니다(옥수수 세포 간격은 8개 이하). 스케일 바는 50μm(A, B, E) 또는 20μm(C, D, F)와 같습니다. 현미경 사진은 형광 현미경과 결합된 단색 디지털 카메라를 사용하여 획득했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
접종된 칼집은 또한 전사 활성 분석을 위한 RNA 추출을 위한 조직을 생산하는데 사용되어왔다 32,33. 이 외피는 감염 과정을 모니터링하기 위해 추출 전에 검사할 수 있어 여러 복제에서 시료 균일성을 보장할 수 있기 때문에 이러한 목적에 이상적이었습니다. 이 연구는 Colletotrichum 생활 방식 전환 단계32,33 사이에서 다르게 발현된 유전자의 파동을 식별할 수 있게 해주었습니다.
예제 데이터 4: 최적이 아닌 실험의 결과
불만족스러운 살아있는 세포 이미징은 잎초의 불충분한 트리밍의 결과일 수 있으며, 이로 인해 표피 세포층이 겹치고 샘플이 광학적으로 불투명해질 수 있습니다(그림 10).
그림 10: 잎초의 불충분한 트리밍으로 인한 차선의 실험 결과.( A) 생체 내 진균 발달 검사를 방해하는 여러 표피 세포층의 예. (B) 살아있는 세포 이미징에 영향을 미치는 중첩 세포층의 예. 20 μm와 같은 스케일 바. 현미경 사진은 형광 현미경과 결합된 단색 디지털 카메라를 사용하여 획득했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
또 다른 잠재적인 차선의 실험 결과는 포자의 수가 적거나(그림 11A) 많을 수 있는 조정되지 않은 접종 농도입니다: 후자는 발아 또는 압압 침투를 감소시킬 수 있습니다(그림 11B). 후자는 또한 각 곰팡이 침투 부위에 식민지화된 옥수수 세포의 정량화를 방해할 수 있습니다.
그림 11: 부적절하게 조정된 접종 농도로 인한 차선의 실험 결과. A. 아니요. 낮은 C. graminicola 포자 현탁액 농도가 칼집에 접종되어 곰팡이 침투 부위의 수가 적습니다. 나. 잎초에 높은 C. graminicola 접종 농도는 가까운 거리에서 여러 압제를 유발하고 숙주 세포 침투를 감소시킵니다. 20 μm와 같은 스케일 바. 현미경 사진은 형광 현미경과 결합된 단색 디지털 카메라를 사용하여 획득했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 현미경 관찰 시간(hpi) | 옥수수 잎 덮개에 접종 된 C. graminicola의 발달 단계 |
| 12 | 아프레소리아(Appressoria) |
| 24 | 1차 균사 |
| 36 | 2차 균사 |
| 48 | 2차 균사 |
| 60 | 아세르불리 |
| 72 | 아세르불리 |
| 108 | 아세르불리 |
표 1: Colletotrichum graminicola 감염 시간 경과: 생활 방식 전환 전반에 걸친 곰팡이 발달 이정표를 기반으로 C. graminicola 균주 M1.001을 접종한 옥수수 잎초의 시간 경과 요약. 현미경 관찰은 12시간마다 수행되었습니다.
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Discussion
여기에 설명된 최적화된 잎집 접종 방법은 쌀잎집6,8,36을 위해 개발되어 적용된 원래 프로토콜에서 수정되었습니다. 이를 통해 광시야 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 식물 세포의 곰팡이 성장 및 발달을 직접적이고 상세하게 관찰할 수 있습니다. 이 프로토콜은 옥수수 집락화 중 다양한 미세 현상의 특성화, 비교 및 정량화에 적합하며, 여기에는 양립 대 양립 상호 작용 중 곰팡이 발달 및 숙주 반응이 포함됩니다. Planta에서 특정 곰팡이 단백질의 생산 및 분비; 옥수수-곰팡이 상호 작용 중에 생성된 공통적이거나 새로운 병원성 인자의 세포학 및 생화학. 우리는 옥수수의 hemibiotrophic 및 necrotrophic 병원체와 함께 이 방법을 사용했습니다. 우리는 생물 영양 병원균(예: 녹 곰팡이)에 대한 접종을 시도하지 않았지만 칼집은 살아 있기 때문에 해당 응용 분야에도 유용할 것입니다. 우리는 또한 숙주와 품종 특이적 저항성의 세포학의 조사를 위해 이 방법을 수수 칼집에 적용했습니다 7,37. 수수 칼집의 경우 프로토콜에 대한 유일한 조정은 중앙에 한 방울을 적용하는 대신 전체 피복을 포자 현탁액으로 채우는 것이었습니다. 이것은 수수 외피의 직경이 더 작기 때문에 필요했습니다.
이러한 sheath assay의 사용은 병원성에 중요한 숙주 집락화 및 곰팡이 분자의 메커니즘에 대한 자세한 연구를 크게 발전시켰습니다. 예를 들어, 이 방법을 적용하면 옥수수에 의한 C. sublineola 와 수수에 의한 C. graminicola 의 비숙주 인식이 나타났으며, 두 경우 모두 과민성 내성 반응을 보였다7. 옥수수 잎 외피는 또한 동일한 외피에서 멀리 떨어진 곰팡이 균주 간의 상호 작용을 테스트하는 데 사용되었습니다. 이 경우, 병원성 WT 균주와 비병원성 cpr1 MT 균주를 생수막에 함께 접종한 결과, WT 균주에 의한 옥수수 세포의 감수성 유도가 입증되었고, 병원성에 관여하는 확산성 인자에 대한 증거가 제공되었다12. 외피는 서로 다른 형광 단백질을 발현하는 두 균주의 분화와 단독으로 또는 함께 접종된 균주에 대한 집락화 과정의 정량화 및 통계적 비교를 가능하게 했습니다.
이 옥수수 잎 외피 분석은 살아있는 세포 이미징을 위한 전체 식물 접종에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 이 프로토콜은 투명화나 고정이 필요 없이 실시간으로 살아있는 숙주 세포와 상호 작용하는 병원체에 대한 우수한 이미징을 제공합니다. 예를 들어, 옥수수 잎 외피를 사용한 연구는 hemibiotrophic C. graminicola에서 biotrophy에서 necrotrophy로의 뚜렷한 전환을 검출할 수 있었고 비병원성 돌연변이 7,12,16,17에 대한 기능적 비교를 용이하게 했습니다. M. oryzae를 접종한 절제된 벼잎초는 전체 벼에서 관찰된 것과 일치하지 않는 증상을 나타낼 수 있다고 보고되었지만36, 옥수수초에서 집락화, 조직 붕괴 및 병변 발생의 시기와 양상은 전체 잎에서 나타나는 것과 유사하다12,14. 칼집 분석의 두 번째 장점은 곰팡이 집락화의 복제 및 실험적 재현성에 걸쳐 더 큰 동시성을 보여준다는 것입니다12,18. 전체 식물 접종은 불규칙한 수준의 곰팡이 침투를 초래할 수 있지만(18), 칼집 접종의 보다 고도로 통제된 조건은 더 많은 동시성을 제공하고 상호 작용의 보다 정확한 조사 및 정량화를 가능하게 한다. 이러한 증가된 동시성은 전사체 분석에서 외피의 사용을 용이하게 하였다32,33. 또한, sheath 프로토콜은 transcriptome 분석에 필요한 샘플 준비 속도를 가능하게 했습니다: 각 sheath를 트리밍, 헹굼 및 스크리닝하는 데 RNA 추출을 위해 급속 냉동되기까지 2분 이상 걸리지 않았습니다32,33.
감염의 성공적인 생세포 이미징을 위한 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 절단 직후 칼집을 실험용으로 사용해야 합니다. 절제된 접종 칼집은 6일 이상 보관해서는 안 된다: 곰팡이 집락화가 심하면 더 빨리 분해된다12; 2) 보다 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 동일한 발달 연령의 외피를 선택하도록 주의하십시오. 3) 최대 포자 형성을 달성 한 배양액의 신선한 포자 현탁액을 사용하십시오. 4) 광학적으로 맑은 샘플을 생산하기 위해 보다 효율적인 트리밍을 위해 날카로운 면도날을 사용하십시오. 5) 이 프로세스는 살아있는 구조와 이미지 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 샘플의 과도하고 불필요한 조작을 최소화합니다. 6) 여과지가 충분히 촉촉한지 확인하기 위해 매일 습도 챔버를 확인하십시오. 7) 컨포칼 현미경에서 샘플을 이미징할 때 샘플 간에 형광 신호를 비교할 때 강도 변화나 편향이 발생하지 않도록 실험 중에 획득 설정을 고정하십시오. 형광 단백질은 레이저 강도와 지속 시간이 너무 높으면 광표백될 수 있으며, 조직 절편을 밀봉된 커버슬립 아래에 장시간 보관하면 더 약한 신호를 줄 수 있습니다. 가장 재현 가능한 결과를 위해 조건, 재료 및 일정을 표준화하고 최적화하기 위해 모든 적절한 대조군을 포함한 예비 실험을 수행해야 합니다.
문제 해결
손으로 다듬는 것만으로는 광학적으로 투명한 피복을 생산하기에 충분하지 않습니다
면도날이 무뎌졌을 수 있습니다. 이 경우 적절하게 폐기하고 새 외날 면도날로 전환하십시오. 적당한 압력을 가하고 칼날을 칼집과 90° 각도로 유지하십시오. 평평하고 반투명한 부분이 관찰될 때까지 샘플을 부드럽지만 일관되게 긁어냅니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 진행하기 전에 복합 현미경으로 피복을 확인하는 것이 좋습니다.
접종 된 옥수수 칼집은 매우 약합니다
이것은 곰팡이가 식물 조직의 대부분을 식민지화했을 때 발생합니다. 결과적으로 조직이 분해되고 붕괴됩니다. 이미 괴사 위영양 단계에 있는 샘플을 준비할 때 현미경 슬라이드에 대고 섹션을 부드럽게 누르고 멸균 DI 물 한 방울을 바르고 깨끗한 커버슬립으로 샘플을 1-2회 긁어냅니다.
낮은 포자 발아 및 in vivo 침투
이것은 발아 또는 침투를 억제하는 포자의 수가 많기 때문일 수 있습니다. 접종 농도가 5 x 105 포자/mL로 조정되었는지 확인하십시오. 문제가 지속되면 농도를 5 x 104 포자/mL로 조정하십시오. in vivo 실험을 위한 대조군으로, 동일한 포자 현탁액 50μL를 새 PDA 플레이트에 놓고 고르게 펴 바릅니다. 포자 생존력과 발아를 매일 확인하십시오.
외피에 걸친 비동기식 곰팡이 발달 단계
옥수수 식물이 동일한 성장 단계에 있고 피복 섹션이 동일한 노드에서 얻어졌는지 확인하십시오. 또한 포자가 생존 가능하고 진균 배양이 접종 준비를 위한 최적의 단계(예: C. graminicola의 경우 2주 이상 배양되지 않음)에 있는지 확인합니다.
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Disclosures
저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없으며 공개할 것이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 USDA-NIFA의 재정 지원에 감사드립니다(보조금 번호 2018-67013-28489 및 2020-70410-32901). 이 원고에 표현된 모든 의견, 결과, 결론 또는 권장 사항은 전적으로 저자의 것이며 미국 농무부의 견해를 반드시 반영하는 것은 아닙니다. 그림 6A 와 그림 7D에 나타난 이미지에 대해 브라질의 방문 학생인 국경 없는 과학의 방문 학생인 Mayara de Silva에게 감사드립니다. 또한 Olympus 컨포칼 현미경에 대한 액세스를 제공한 켄터키 대학의 식물 병리학과에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axiocam monochrome microscope camera | ZEISS | 426560-9010-000 | Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging |
| Axioplan 2 epifluorescence microscope | ZEISS | N/A | Allows live viewing and image/video capture of biological samples |
| Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g) |
| Falcon bacteriological Petri dish with lid | Fisher Scientific | 08-757-105 | Polystyrene material; hydrophobic surface |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers |
| FV 3000 laser scanning confocal microscope | Olympus | N/A | For visualization of fungal transformants' |
| Germination paper | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# heavy weight for plastic box moist chambers |
| Glass Petri dishes | VWR International | 75845-542 | Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass; complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers |
| Glass wool | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | For glass-wool filter units |
| Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glass | VWR International | 15170-172 | 0.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses |
| Microscope coverslips | Fisher Scientific | 12-553-457 | Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width |
| Maize cultivar Golden Jubilee seeds | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | Matures in 95-105 days; seed type: F1 |
| Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 1.5 mL capacity |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width |
| Oatmeal Agar (OA) | VWR International | 255210 | Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g |
| Nail polish | Revlon | 43671 | Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear |
| Non-skirted 96-well PCR plate | USA Sientific | 1402-9500 | 100 uL plate volume |
| Pestle for microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | Conical tip; polypropylene material |
| PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective | Olympus | 1-UB933 | Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope |
| Potato Dextrose Agar (PDA) | VWR International | 90000-758 | Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | Premium general-purpose growing medium formulated to provide a balance of water retention and proper drainage |
| SC10 cone-tainers | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL |
| SC10 cone-tainers tray | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers |
| Single edge razor blade | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade |
| Storage containers/boxes with latch closure | Target | 002-02-0405 | Clear view storage boxes for rmoist chamber; outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity |
References
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