Transienter mittlerer Hirnarterienverschluss Modell des Schlaganfalls
Summary
Dieses Protokoll beschreibt das Modell der transienten fokalen zerebralen Ischämie bei Mäusen durch intraluminalen Verschluss der mittleren Hirnarterie. Darüber hinaus werden Beispiele für die Ergebnisbewertung mit Hilfe von Magnetresonanztomographie und Verhaltenstests gezeigt.
Abstract
Schlaganfälle sind weltweit eine der Hauptursachen für Tod oder chronische Behinderungen. Nichtsdestotrotz beschränken sich die bestehenden optimalen Behandlungen auf Reperfusionstherapien während der akuten Phase des ischämischen Schlaganfalls. Um Einblicke in die Schlaganfallphysiopathologie zu gewinnen und innovative Therapieansätze zu entwickeln, spielen in vivo Nagetiermodelle des Schlaganfalls eine grundlegende Rolle. Die Verfügbarkeit von genetisch veränderten Tieren hat insbesondere den Einsatz von Mäusen als experimentelle Schlaganfallmodelle vorangetrieben.
Bei Schlaganfallpatienten ist ein Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCA) ein häufiges Ereignis. Folglich ist das am weitesten verbreitete experimentelle Modell die intraluminale Okklusion des MCA, eine minimalinvasive Technik, die keine Kraniektomie erfordert. Bei diesem Verfahren wird ein Monofilament durch die Arteria carotis externa (ECA) eingeführt und durch die Arteria carotis interna (ICA) vorgeschoben, bis es den Verzweigungspunkt des MCA erreicht. Nach einem 45-minütigen arteriellen Verschluss wird das Monofilament entfernt, um eine Reperfusion zu ermöglichen. Während des gesamten Prozesses wird der zerebrale Blutfluss überwacht, um die Verringerung während der Okklusion und die anschließende Erholung nach der Reperfusion zu bestätigen. Die neurologischen und gewebebezogenen Ergebnisse werden mit Hilfe von Verhaltenstests und Magnetresonanztomographie (MRT) bewertet.
Introduction
Der Schlaganfall ist eine verheerende Krankheit, von der nach Angaben der WHO jährlich etwa 15 Millionen Menschen weltweit betroffen sind. Etwa ein Drittel der Patienten erliegt der Erkrankung, ein weiteres Drittel erleidet eine dauerhafte Behinderung. Der Schlaganfall ist eine komplexe Pathologie, an der verschiedene Zelltypen beteiligt sind, wie z. B. neuronale und periphere Immunzellen, Gefäße und systemische Reaktionen1. Das komplizierte Netzwerk von Reaktionen, die durch Schlaganfälle auf Systemebene ausgelöst werden, kann derzeit nicht mit In-vitro-Modellen repliziert werden. Daher sind experimentelle Tiermodelle unerlässlich, um die Mechanismen der Krankheit zu erforschen und neue Therapien zu entwickeln und zu testen. Derzeit ist die frühe Gewebereperfusion die einzige zugelassene Intervention, entweder durch Thrombolyse mit Gewebeplasminogenaktivator (tPA) oder endovaskuläre Thrombektomie1.
Verschlüsse der mittleren Hirnarterie (MCA) sind bei Schlaganfallpatienten häufig. Folglich wurden zunächst Nagetiermodelle für transiente MCA-Okklusion (tMCAo) bei Ratten entwickelt 2,3,4. Genetisch veränderte Mäuse sind heute die am häufigsten verwendeten Tiere in experimentellen Schlaganfallmodellen. In dieser Studie beschreiben wir ein minimal-invasives Modell des intraluminalen tMCAo in Mäusen. Der Zugang erfolgt über die Halsschlagader auf Höhe des Halses, ohne Kraniektomie.
Die Dauer der Okklusionsperiode ist ein kritischer Faktor, der das Ausmaß der ischämischen Läsion bestimmt. Selbst kurze Okklusionen von 10 Minuten können einen selektiven neuronalen Tod ohne offensichtlichen Infarkt verursachen, während längere Okklusionen, die typischerweise 30 bis 60 Minuten dauern, zu einem gewissen Grad an Hirninfarkt führen. Im Gegensatz zu den proximalen und distalen Ästen des MCA, die den Kortex versorgen und Kollateralen haben, fehlen den lentikulo-striatalen Arterien, die das Striatum mit Blut versorgen, Kollateralarterien5. In der Folge kommt es nach tMCAo zu einer stärkeren Verminderung des Blutflusses im Striatum als im Kortex. So betreffen Okklusionen von 30 Minuten oder weniger in der Regel das Striatum, aber nicht den Kortex, während längere Okklusionen ab 45 Minuten oft eine ischämische Läsion im gesamten MCA-Territorium, einschließlich des Striatums und des dorsolateralen Kortex, hervorrufen.
Um das Wohlbefinden der Mäuse zu gewährleisten, verabreichen wir vor dem Eingriff Analgetika und verwenden während der Operation eine Narkose. Nichtsdestotrotz kann die Anästhesie möglicherweise künstliche Veränderungen in der Physiologie der Maus bewirken und einige Ergebnismaße beeinflussen6. Der chirurgische Eingriff, wenn er von erfahrenem Personal durchgeführt wird, dauert in der Regel etwa 15 Minuten, um MCAo zu induzieren. Anschließend hängt die Gesamtdauer unter Narkose von der Okklusionszeit ab. Bei Experimenten, bei denen die Minimierung der Anästhesie von entscheidender Bedeutung ist, besteht ein alternativer Schritt des Verfahrens darin, die Anästhesie während der Okklusionsperiode abzubrechen und sie nur auf die chirurgischen Schritte zum Einführen und Herausziehen des Filaments zu beschränken, das den MCA verschließt. Dieser Ansatz verkürzt die Dauer der Anästhesie und minimiert ihre potenziellen artifaktischen Auswirkungen auf das experimentelle Modell 7,8. Daher wird die Methode zur Induktion einer transienten fokalen Ischämie durch intraluminalen Verschluss des MCA mit zwei Varianten vorgestellt: mit der Maus während der gesamten Okklusionsperiode anästhesiert oder mit der Maus wach während dieser Periode. In beiden Fällen sollte parallel zu dem Eingriff an den ischämischen Mäusen eine Scheinoperation durchgeführt werden. Darüber hinaus werden Daten zur Ergebnisbewertung bereitgestellt, die durch Verhaltenstests und MRT zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Reperfusion gemessen werden. Abschließend werden die wichtigsten Faktoren diskutiert, die bei der Durchführung des experimentellen Verfahrens zu berücksichtigen sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das intraluminale tMCAo-Verfahren ist das in der Grundlagenforschung am häufigsten verwendete Modell der fokalen Hirnischämie mit Reperfusion. Derzeit sind Mäuse aufgrund der Verfügbarkeit genetisch veränderter Stämme das bevorzugte Tiermodell. Es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass genetisch veränderte Mäuse und ihr genetischer Hintergrund die Vaskularisierung des Gehirns beeinflussen können. Das Vorhandensein von Kollateralzirkulation und Anastomosen zwischen verschiedenen arteriellen Territorien kann die Er…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde unterstützt durch den Zuschuss PID2020-113202RB-I00, finanziert durch das Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 und den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE). Eine Art, Europa zu machen”. NCC und MAR hatten Stipendien für Doktoranden (PRE2021-099481 bzw. PRE2018-085737), die von MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 und von “European Social Fund (ESF) Investing in your future” finanziert wurden. Wir danken Francisca Ruiz-Jaén und Leonardo Márquez-Kisinousky für ihre technische Unterstützung. Wir danken der MRT-Bildgebungseinrichtung des Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Das Programm der Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) der Generalitat de Catalunya unterstützt IDIBAPS.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
References
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