Voorbijgaand occlusiemodel van de middelste cerebrale slagader van een beroerte
Summary
Dit protocol beschrijft het model van voorbijgaande focale cerebrale ischemie bij muizen door intraluminale occlusie van de middelste hersenslagader. Daarnaast worden voorbeelden van uitkomstbeoordeling getoond met behulp van magnetische resonantiebeeldvorming en gedragstests.
Abstract
Beroerte is wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak of chronische invaliditeit. Desalniettemin zijn de bestaande optimale behandelingen beperkt tot reperfusietherapieën tijdens de acute fase van ischemische beroerte. Om inzicht te krijgen in de fysiopathologie van beroertes en innovatieve therapeutische benaderingen te ontwikkelen, spelen in vivo knaagdiermodellen van beroerte een fundamentele rol. De beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde dieren heeft met name het gebruik van muizen als experimentele beroertemodellen gestimuleerd.
Bij patiënten met een beroerte komt occlusie van de middelste hersenslagader (MCA) vaak voor. Bijgevolg omvat het meest voorkomende experimentele model intraluminale occlusie van de MCA, een minimaal invasieve techniek die geen craniectomie vereist. Deze procedure omvat het inbrengen van een monofilament door de externe halsslagader (ECA) en het door de interne halsslagader (ICA) naar voren brengen totdat het het vertakkingspunt van de MCA bereikt. Na een arteriële occlusie van 45 minuten wordt het monofilament verwijderd om reperfusie mogelijk te maken. Gedurende het hele proces wordt de cerebrale bloedstroom gecontroleerd om de vermindering tijdens occlusie en het daaropvolgende herstel na reperfusie te bevestigen. Neurologische en weefselresultaten worden geëvalueerd met behulp van gedragstests en MRI-onderzoeken (magnetic resonance imaging).
Introduction
Beroerte is een verwoestende ziekte die volgens de WHO jaarlijks wereldwijd ongeveer 15 miljoen mensen treft. Ongeveer een derde van de patiënten bezwijkt aan de aandoening, terwijl nog eens een derde blijvende invaliditeit ervaart. Beroerte is een complexe pathologie waarbij verschillende celtypen betrokken zijn, zoals neurale en perifere immuuncellen, vasculatuur en systemischereacties1. Het ingewikkelde netwerk van reacties die worden veroorzaakt door een beroerte op systeemniveau kan momenteel niet worden gerepliceerd met behulp van in-vitromodellen . Proefdiermodellen zijn dus essentieel om de mechanismen van de ziekte te onderzoeken en nieuwe therapieën te ontwikkelen en te testen. Momenteel is vroege weefselreperfusie de enige goedgekeurde interventie, hetzij door trombolyse met weefseltype plasminogeenactivator (tPA) of endovasculaire trombectomie1.
Occlusies van de middelste hersenslagader (MCA) komen vaak voor bij patiënten met een beroerte. Bijgevolg werden knaagdiermodellen van voorbijgaande MCA-occlusie (tMCAo) aanvankelijk ontwikkeld bij ratten 2,3,4. Tegenwoordig zijn genetisch gemodificeerde muizen de meest gebruikte dieren in experimentele beroertemodellen. In deze studie beschrijven we een minimaal invasief model van intraluminale tMCAo bij muizen. De aanpak wordt uitgevoerd via de halsslagader ter hoogte van de nek, zonder craniectomie.
De duur van de occlusieperiode is een kritische factor die de omvang van de ischemische laesie bepaalt. Zelfs korte occlusies van 10 minuten kunnen selectieve neuronale dood veroorzaken zonder een duidelijk infarct, terwijl langere occlusies, die meestal 30 tot 60 minuten duren, resulteren in een zekere mate van herseninfarct. In tegenstelling tot de proximale en distale takken van de MCA die de cortex voeden en collateralen hebben, missen de lenticulo-striatale slagaders die bloed naar het striatum leveren collateralen5. Als gevolg hiervan is er een grotere vermindering van de bloedstroom in het striatum dan in de cortex na tMCAo. Occlusies van 30 minuten of minder hebben dus over het algemeen invloed op het striatum, maar niet op de cortex, terwijl langere occlusies, vanaf 45 minuten, vaak een ischemische laesie veroorzaken in het hele MCA-gebied, inclusief het striatum en de dorsolaterale cortex.
Om het welzijn van de muizen te garanderen, dienen we voorafgaand aan de ingreep pijnstillers toe en gebruiken we anesthesie tijdens de operatie. Desalniettemin kan anesthesie mogelijk kunstmatige veranderingen in de fysiologie van de muis introduceren en sommige uitkomstmaten beïnvloeden6. De chirurgische ingreep, uitgevoerd door ervaren personeel, duurt meestal ongeveer 15 minuten voor het induceren van MCAo. Vervolgens is de totale tijd onder narcose afhankelijk van de occlusieperiode. Voor experimenten waarbij het minimaliseren van anesthesie cruciaal is, is een alternatieve stap in de procedure het stopzetten van de anesthesie tijdens de occlusieperiode en het beperken tot alleen de chirurgische stappen voor het inbrengen en terugtrekken van het filament dat de MCA afsluit. Deze benadering verkort de duur van de anesthesie en minimaliseert de potentiële artefactische effecten op het experimentele model 7,8. Daarom wordt de methode voor het induceren van voorbijgaande focale ischemie gepresenteerd door intraluminale occlusie van de MCA met twee varianten: met de muis verdoofd tijdens de gehele occlusieperiode of met de muis wakker tijdens deze periode. In beide gevallen moet een schijnoperatie worden uitgevoerd parallel aan de ingreep die wordt uitgevoerd op de ischemische muizen. Bovendien worden gegevens over de uitkomstbeoordeling verstrekt, zoals gemeten door gedragstests en MRI op verschillende tijdstippen na reperfusie. Ten slotte worden de belangrijkste factoren besproken waarmee rekening moet worden gehouden bij de uitvoering van de experimentele procedure.
Protocol
Representative Results
Discussion
De intraluminale tMCAo-procedure is het meest gebruikte model van focale hersenischemie met reperfusie in fundamenteel onderzoek. Momenteel zijn muizen het geprefereerde diermodel vanwege de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen. Het is echter essentieel om te erkennen dat genetisch gemodificeerde muizen en hun genetische achtergrond van invloed kunnen zijn op de vascularisatie van de hersenen. De aanwezigheid van collaterale circulatie en anastomosen tussen verschillende arteriële gebieden kan de uitkoms…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studie ondersteund door subsidie PID2020-113202RB-I00 gefinancierd door Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 en “Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO). Een manier om Europa te maken”. NCC en MAR hadden predoctorale beurzen (respectievelijk PRE2021-099481 en PRE2018-085737) gefinancierd door MCIN/AEI/10.13039/501100011033 en door “Europees Sociaal Fonds (ESF) Investeren in je toekomst”. Wij danken Francisca Ruiz-Jaén en Leonardo Márquez-Kisinousky voor hun technische ondersteuning. We erkennen de steun van de MRI-beeldvormingsfaciliteit van het Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Het Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) programma van de Generalitat de Catalunya ondersteunt IDIBAPS.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
References
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
