نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر للسكتة الدماغية
Summary
يصف هذا البروتوكول نموذج نقص التروية الدماغية البؤري العابر في الفئران من خلال انسداد الشريان الدماغي الأوسط داخل اللمعة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض أمثلة لتقييم النتائج باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي والاختبارات السلوكية.
Abstract
تقف السكتة الدماغية كسبب رئيسي للوفاة أو الإعاقة المزمنة على مستوى العالم. ومع ذلك ، تقتصر العلاجات المثلى الحالية على علاجات إعادة التروية خلال المرحلة الحادة من السكتة الدماغية. لاكتساب نظرة ثاقبة في علم الأمراض الفسيولوجي للسكتة الدماغية وتطوير مناهج علاجية مبتكرة ، تلعب نماذج القوارض في الجسم الحي للسكتة الدماغية دورا أساسيا. وقد دفع توافر المعدلة وراثيا بشكل خاص استخدام الفئران كنماذج تجريبية للسكتة الدماغية.
في مرضى السكتة الدماغية ، يعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA) أمرا شائعا. وبالتالي ، فإن النموذج التجريبي الأكثر انتشارا يتضمن انسداد MCA داخل اللمعة ، وهي تقنية طفيفة التوغل لا تتطلب استئصال الجمجمة. يتضمن هذا الإجراء إدخال خيوط أحادية من خلال الشريان السباتي الخارجي (ECA) ودفعها عبر الشريان السباتي الداخلي (ICA) حتى تصل إلى نقطة التفرع من MCA. بعد انسداد الشرايين لمدة 45 دقيقة ، تتم إزالة الشعيرات الأحادية للسماح بإعادة التروية. طوال العملية ، يتم مراقبة تدفق الدم الدماغي لتأكيد الانخفاض أثناء الانسداد والتعافي اللاحق عند إعادة التروية. يتم تقييم النتائج العصبية والأنسجة باستخدام الاختبارات السلوكية ودراسات التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI).
Introduction
السكتة الدماغية هي مرض مدمر يصيب ما يقرب من 15 مليون شخص في جميع أنحاء العالم سنويا ، وفقا لمنظمة الصحة العالمية. حوالي ثلث المرضى يستسلمون لهذه الحالة ، بينما يعاني ثلث آخر من إعاقة دائمة. السكتة الدماغية هي أمراض معقدة تشمل أنواعا مختلفة من الخلايا ، مثل الخلايا المناعية العصبية والمحيطية ، والأوعية الدموية ، والاستجابات الجهازية1. لا يمكن حاليا تكرار الشبكة المعقدة من التفاعلات الناتجة عن السكتة الدماغية على مستوى الأنظمة باستخدام النماذج في المختبر . وبالتالي ، فإن النماذج الحيوانية التجريبية ضرورية للتعمق في آليات المرض وتطوير واختبار علاجات جديدة. حاليا ، إعادة تروية الأنسجة المبكرة هي التدخل الوحيد المعتمد ، إما من خلال انحلال الخثرة باستخدام منشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة (tPA) أو استئصال الخثرة داخل الأوعية الدموية1.
انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA) متكرر في مرضى السكتة الدماغية. وبالتالي ، تم تطوير نماذج القوارض من انسداد MCA العابر (tMCAo) في البداية في الفئران2،3،4. في الوقت الحاضر ، الفئران المعدلة وراثيا هي الأكثر استخداما في نماذج السكتة الدماغية التجريبية. في هذه الدراسة ، وصفنا نموذجا طفيف التوغل ل tMCAo داخل اللمعة في الفئران. يتم تنفيذ النهج عن طريق الشريان السباتي على مستوى الرقبة ، دون استئصال الجمجمة.
مدة فترة الانسداد هي عامل حاسم يحدد مدى الآفة الإقفارية. حتى الانسداد القصير لمدة 10 دقائق يمكن أن يسبب موتا عصبيا انتقائيا دون احتشاء واضح ، في حين أن الانسداد الطويل ، الذي يستمر عادة من 30 إلى 60 دقيقة ، يؤدي إلى درجة معينة من الاحتشاء الدماغي. على عكس الفروع القريبة والبعيدة من MCA التي تغذي القشرة ولها ضمانات ، فإن الشرايين العدسية المخططة التي توفر الدم للمخطط تفتقر إلى الضمانات5. نتيجة لذلك ، هناك انخفاض أكبر في تدفق الدم في المخطط منه في القشرة بعد tMCAo. وبالتالي ، فإن انسداد 30 دقيقة أو أقل يؤثر بشكل عام على المخطط ولكن ليس القشرة ، في حين أن الانسدادات الأطول ، من 45 دقيقة فصاعدا ، غالبا ما تولد آفة إقفارية في منطقة MCA بأكملها ، بما في ذلك المخطط والقشرة الظهرية الجانبية.
لضمان رفاهية الفئران ، نقوم بإدارة المسكنات قبل الإجراء واستخدام التخدير أثناء الجراحة. ومع ذلك ، يمكن للتخدير إدخال تغييرات اصطناعية في فسيولوجيا الفأر ويؤثر على بعض مقاييس النتائج6. عادة ما يستمر التدخل الجراحي ، عندما يتم إجراؤه من قبل موظفين ذوي خبرة ، حوالي 15 دقيقة لتحفيز MCAo. بعد ذلك ، يعتمد إجمالي الوقت تحت التخدير على فترة الانسداد. بالنسبة للتجارب التي يكون فيها تقليل التخدير أمرا بالغ الأهمية ، تتضمن الخطوة البديلة في الإجراء إيقاف التخدير خلال فترة الانسداد وقصره فقط على الخطوات الجراحية لإدخال وسحب الفتيل الذي يسد MCA. يقلل هذا النهج من مدة التخدير ويقلل من آثاره الأثرية المحتملة على النموذج التجريبي 7,8. لذلك ، يتم تقديم طريقة إحداث نقص التروية البؤري العابر عن طريق انسداد MCA داخل اللمعة مع نوعين مختلفين: مع تخدير الماوس خلال فترة الانسداد بأكملها أو مع استيقاظ الماوس خلال هذه الفترة. في كلتا الحالتين ، يجب إجراء جراحة وهمية بالتوازي مع التدخل الذي يتم إجراؤه على الفئران الإقفارية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير البيانات المتعلقة بتقييم النتائج كما تم قياسها بواسطة الاختبارات السلوكية والتصوير بالرنين المغناطيسي في نقاط زمنية مختلفة بعد إعادة التروية. أخيرا ، تتم مناقشة العوامل الرئيسية التي يجب مراعاتها عند تنفيذ الإجراء التجريبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
إجراء tMCAo داخل اللمعة هو النموذج الأكثر استخداما لنقص تروية الدماغ البؤري مع إعادة التروية في الأبحاث الأساسية. حاليا ، الفئران هي النموذج الحيواني المفضل بسبب توافر السلالات المعدلة وراثيا. ومع ذلك ، من الضروري الاعتراف بأن الفئران المعدلة وراثيا وخلفياتها الجينية يمكن أن تؤثر على الأو?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
دراسة مدعومة بالمنحة PID2020-113202RB-I00 الممولة من وزارة العلوم والابتكار (MCIN) / الوكالة الحكومية للتحقيق (AEI) ، Gobierno de España / 10.13039 / 501100011033 و “الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (ERDF). طريقة لصنع أوروبا”. حصل NCC و MAR على زمالات ما قبل الدكتوراه (PRE2021-099481 و PRE2018-085737 ، على التوالي) بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ومن قبل “الصندوق الاجتماعي الأوروبي (ESF) الاستثمار في مستقبلك”. ونشكر فرانسيسكا رويز – جيان وليوناردو ماركيز – كيسينوسكي على دعمهما التقني. نحن نقر بدعم مرفق التصوير بالرنين المغناطيسي التابع لمعهد التحقيقات الحيوية في أغسطس بي إي سونير (IDIBAPS). يدعم برنامج مراكز أبحاث كاتالونيا (CERCA) التابع ل Generalitat de Catalunya IDIBAPS.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
References
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
