脳卒中の一過性中大脳動脈閉塞モデル
Summary
このプロトコルは中間の大脳の動脈のintraluminal閉塞によってマウスの一時的な焦点の大脳の虚血のモデルを記述する。さらに、磁気共鳴画像法と行動テストを使用した結果評価の例が示されています。
Abstract
脳卒中は、世界的に死亡または慢性障害の主な原因となっています。それにもかかわらず、既存の最適な治療法は、虚血性脳卒中の急性期の再灌流療法に限定されています。脳卒中の生理病理学に関する洞察を得て、革新的な治療法を開発するために、脳卒中の in vivo げっ歯類モデルが基本的な役割を果たします。遺伝子改変動物が利用できるようになったことで、特にマウスが脳卒中の実験モデルとして利用されるようになった。
脳卒中患者では、中大脳動脈(MCA)の閉塞がよく見られます。その結果、最も一般的な実験モデルには、頭蓋切除術を必要としない低侵襲技術であるMCAの管腔内閉塞が含まれます。この手順では、モノフィラメントを外頸動脈(ECA)に挿入し、MCAの分岐点に達するまで内頸動脈(ICA)を通って進めます。45分間の動脈閉塞後、モノフィラメントを除去して再灌流を行います。プロセス全体を通して、脳血流がモニターされ、閉塞中の減少と再灌流後のその後の回復が確認されます。神経学的および組織の結果は、行動テストと磁気共鳴画像法(MRI)研究を使用して評価されます。
Introduction
WHOによると、脳卒中は世界中で年間約1,500万人が罹患する壊滅的な病気です。患者の約3分の1がこの症状に屈し、別の3分の1が永久的な障害を経験します。脳卒中は、神経細胞や末梢免疫細胞、血管系、全身反応など、さまざまな種類の細胞が関与する複雑な病態です1。脳卒中によって引き起こされる反応の複雑なネットワークは、システムレベルでは、現在のところin vitro モデルを使用して再現することはできません。したがって、実験動物モデルは、病気のメカニズムを掘り下げ、新しい治療法を開発およびテストするために不可欠です。現在、早期組織再灌流は、組織型プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)による血栓溶解または血管内血栓摘出術のいずれかによる唯一の承認された介入です1。
中大脳動脈(MCA)の閉塞は脳卒中患者によく見られます。その結果、一過性MCA閉塞(tMCAo)のげっ歯類モデルが最初にラットで開発されました2,3,4。現在、遺伝子改変マウスは、実験的な脳卒中モデルで最も一般的に使用されている動物です。本研究では、マウスにおける管腔内tMCAoの低侵襲モデルについて述べる。アプローチは、頭蓋切除術なしで、頸部レベルで頸動脈を介して行われます。
閉塞期間の期間は、虚血性病変の範囲を決定する重要な要素です。10分間の短い閉塞でも、明らかな梗塞を伴わずに選択的神経細胞死を引き起こす可能性がありますが、通常30〜60分続く長い閉塞は、ある程度の脳梗塞を引き起こします。皮質に供給し、側副を持つMCAの近位枝および遠位枝とは異なり、線条体に血液を供給するレンチキュロ線条体動脈は側副動脈を欠いている5。その結果、tMCAo後の皮質よりも線条体の血流が大幅に減少します。したがって、30分以下の閉塞は一般的に線条体に影響を与えますが、皮質には影響を与えませんが、45分以降の長い閉塞は、線条体と背外側皮質を含むMCA領域全体に虚血性病変を生成することがよくあります。
マウスの健康を確保するために、手術前に鎮痛剤を投与し、手術中は麻酔を使用します。それにもかかわらず、麻酔はマウスの生理機能に人為的な変化をもたらす可能性があり、いくつかの結果測定に影響を与える可能性があります6。外科的介入は、経験豊富な担当者によって行われた場合、MCAoを誘発するために通常約15分続きます。その後、麻酔下の合計時間は閉塞期間によって異なります。麻酔を最小限に抑えることが重要な実験では、閉塞期間中に麻酔を中止し、MCAを閉塞するフィラメントを挿入および引き抜くための外科的ステップのみに制限する手順の代替ステップがあります。このアプローチは、麻酔の期間を短縮し、実験モデルに対する潜在的な人工的影響を最小限に抑えます7,8。したがって、一過性限局性虚血を誘発する方法は、MCAの管腔内閉塞によって提示されます:閉塞期間全体を通してマウスを麻酔するか、この期間中にマウスを覚醒させるかの2つのバリアント。いずれの場合も、虚血マウスに実施される介入と並行して偽手術を行うべきである。さらに、再灌流後のさまざまな時点で行動テストとMRIによって測定された結果評価に関するデータが提供されます。最後に、実験手順を実施する際に考慮すべき主な要因について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
管腔内tMCAo手順は、基礎研究における再灌流を伴う限局性脳虚血の最も一般的に使用されるモデルです。現在、マウスは遺伝子組み換え株が入手可能なため、好ましい動物モデルです。しかし、遺伝子組み換えマウスとその遺伝的背景が脳の血管新生に影響を与える可能性があることを認識することが不可欠です。異なる動脈領域間の側副循環と吻合の存在は、実験手順の結果に大きな影響?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、 Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI)、 Gobierno de España/10.13039/501100011033および「欧州地域開発基金(ERDF)」が資金提供する助成金PID2020-113202RB-I00によって支援されています。ヨーロッパを作る方法」。NCCとMARには、MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033および「European Social Fund (ESF) Investing in your future」によって資金提供された博士課程前のフェローシップ(それぞれPRE2021-099481とPRE2018-085737)がありました。技術サポートをしてくれたFrancisca Ruiz-Jaén氏とLeonardo Márquez-Kisinousky氏に感謝します。我々は、Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer(IDIBAPS)のMRI画像施設の支援に感謝する。カタルーニャ州政府のカタルーニャ研究センター(CERCA)プログラムは、IDIBAPSをサポートしています。
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
References
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