التفكك الميكانيكي للأنسجة لتحليل الخلية المفردة باستخدام جهاز آلي
Summary
يتم توفير بروتوكول عام للتفكك الميكانيكي الأنزيمي وشبه الآلي المشترك للأنسجة لتوليد معلقات أحادية الخلية للتحليلات النهائية ، مثل قياس التدفق الخلوي. يتم تضمين تعليمات لتصنيع وتجميع وتشغيل الجهاز الميكانيكي منخفض التكلفة الذي تم تطويره لهذا البروتوكول.
Abstract
أصبحت القدرة على عزل الخلايا المفردة وإعدادها لتحليل عينات الأنسجة أمرا بالغ الأهمية للاكتشافات والأبحاث الطبية الحيوية الجديدة. تستغرق البروتوكولات اليدوية لعمليات عزل الخلية الواحدة وقتا طويلا للغاية وعرضة لتنوع المستخدم. البروتوكولات الميكانيكية الآلية قادرة على تقليل وقت المعالجة وتنوع العينات ولكن لا يمكن الوصول إليها بسهولة أو فعالة من حيث التكلفة في إعدادات البحث منخفضة الموارد. تم تصميم الجهاز الموصوف هنا لتفكك الأنسجة شبه الآلي باستخدام المواد المتاحة تجاريا كبديل منخفض التكلفة للمختبرات الأكاديمية. تم توفير تعليمات لتصنيع وتجميع وتشغيل تصميم الجهاز. ينتج بروتوكول التفكك بشكل موثوق معلقات أحادية الخلية مع إنتاجية خلايا مماثلة وصلاحية عينة للمستحضرات اليدوية عبر أنسجة الفئران المتعددة. يوفر البروتوكول القدرة على معالجة ما يصل إلى 12 عينة من الأنسجة في وقت واحد لكل جهاز ، مما يجعل الدراسات التي تتطلب أحجام عينات كبيرة أكثر قابلية للإدارة. يسمح البرنامج المصاحب أيضا بتخصيص بروتوكول الجهاز لاستيعاب الأنسجة المختلفة والقيود التجريبية.
Introduction
أصبح تحليل الخلية الواحدة سريعا أمرا بالغ الأهمية للاكتشافات الطبية الحيوية الجديدة ، سواء لتطبيقات مثل قياس التدفق الخلوي ، وتحديد أنواع الخلايا المختلفة ، أو تسلسل الخلية الواحدة ، أو لتحديد الاختلافات الجينومية أو النسخية بين الخلايا1. يتطلب إجراء عمليات عزل الخلايا هذه من الأنسجة ذات الأهمية فرم الأنسجة المقطعة ودفعها عبر مصفاة خلايا دقيقة لتصفية النسيج الضام من الخلايا المرغوبة (الشكل 1 أ). يتطلب عزل أنواع الخلايا الملتصقة ، مثل الخلايا المتغصنة أو الضامة ، أو الخلايا من الأنسجة الليفية بشكل خاص ، خطوات فصل ميكانيكية أو إنزيمية إضافية2،3،4. تتم هذه العملية يدويا بشكل عام ، مما يجعلها تستغرق وقتا طويلا وعرضة لتقلب المستخدم عند تقييم إنتاجية الخلايا وصلاحية العينة. لذلك ، من الأهمية بمكان تقديم خيارات قابلة للتخصيص لتفكك الأنسجة الآلي. في حين بذلت بعض المحاولات لتصميم مثل هذه الأنظمة ، فإن الخيارات الحالية لا يمكن الوصول إليها دائما بسهولة ، لا سيما في المختبرات الأكاديمية والإعدادات ذات الموارد المنخفضة ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى الطبيعة الباهظة التكلفة لهذه الأجهزة5. علاوة على ذلك ، لا تكون هذه الأجهزة قابلة للتخصيص دائما وفقا للاحتياجات الفردية لمجموعة البحث6.
هنا ، تم تصميم جهاز فك الأنسجة لأتمتة هضم الأنسجة الكاملة أو قطع الأنسجة في معلقات أحادية الخلية بمساعدة الإنزيمات الهاضمة والاضطراب الميكانيكي. يمكن تجميع هذا الجهاز بسهولة في المختبر ، ووضعه في غرف التدفئة أو التبريد لتنظيم درجة الحرارة ، وتخصيصه للعدد المطلوب من الأنسجة لفصلها ، وبرمجته ببروتوكولات التفكك المطلوبة. يمكن أن يؤدي الاستخدام الواسع لهذا الجهاز إلى تحسين إمكانية استنساخ بروتوكولات استخراج الخلايا بشكل كبير وتوفير بديل موفر للوقت للتفكك اليدوي.
يسمح التصميم بالهضم المتزامن لما يصل إلى 12 منديلا من خلال عملية آلية. يتكون الجهاز من 12 محركا فرديا سلكيا بالتوازي ويتم تشغيله بواسطة قابس حائط قياسي من خلال محول AC / DC مع قرص جهد قابل للتعديل للتحكم في دوران / سرعة المحركات. تقوم المحركات بتحويل مسمار سداسي يتناسب بشكل مريح مع الجزء العلوي من الأنابيب C. يتم تثبيت الأنابيب C في مكانها عن طريق الشد لأسفل على لوحة أكريليك تغلق على جانبي اللوحة العلوية حيث يتم تأمين المحركات (الشكل 1 ب). نظرا لأن المحركات سلكية بالتوازي ، يجب ألا تختلف سرعتها عند أي جهد معين كثيرا ، ولكن الحمل (عدد الأنابيب C المثبتة على الجهاز) سيؤثر على السرعة حتى عندما يظل الجهد ثابتا. لقياس الدورات في الدقيقة (rpm) ، تم دمج مقياس سرعة الدوران باستخدام مستشعر تأثير القاعة ومغناطيس ثابت على أحد أعمدة المحرك (الشكل التكميلي 1). يتم توفير ملفات CAD لبناء صفائف المحركات في ملف الترميز التكميلي 1. كما يشتمل على مفتاح قابل للبرمجة لعكس اتجاه الدوران عن طريق عكس الشحنات الموجبة / السالبة التي يتم تسليمها إلى المحركات. تم دمج كل هذه الميزات باستخدام برنامج مشفر (برنامج Arduino IDE ، انظر جدول المواد) على Arduino Nano (ملف الترميز التكميلي 2). باستخدام الأزرار المتصلة ولوحة LCD (الشكل التكميلي 2) ، من الممكن إنشاء وتشغيل بروتوكولات محفوظة ومخصصة ، وعكس اتجاه الدوران تلقائيا في أوقات محددة من البروتوكول ، وضبط السرعة باستخدام الجهد (الشكل التكميلي 3) ، وعرض سرعة المحرك الحالية والوقت المتبقي لإكمال بروتوكول مبرمج (الشكل التكميلي 4).
بالنسبة للدراسة الحالية ، تم تحضير معلقات أحادية الخلية باستخدام كل من تفكك الأنسجة الأنزيمية الميكانيكية مع هذا الجهاز وتفكك الأنسجة الأنزيمية اليدوية لتحديد الاختلافات ، إن وجدت ، في الخلايا المستعادة للتطبيقات النهائية. تم تقييم الاستعدادات الخلوية على أساس إجمالي غلة الخلايا لكل نسيج والنسبة المئوية لصلاحية الخلية. تم استخدام قياس التدفق الخلوي لمقارنة الاختلافات المحتملة في تعبير علامة السطح. تم تحليل البيانات باستخدام الرسوم البيانية وبرامج التحليل الإحصائي. تم استخدام اختبارات Welch t غير المزاوجة لمقارنة أزواج من العينات أو المجموعات ، مع أحجام العينات n > 4 الفئران التي تمثل 2 تجربة تكرار. يمكن العثور على تعليمات مفصلة لتصنيع وتجميع هذا الجهاز في الملف التكميلي 1. يتم سرد المواد اللازمة لهذا البروتوكول في جدول المواد.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم هذا الجهاز لسهولة التجميع في إعداد البحث لتوفير معلقات أحادية الخلية من الأنسجة الكاملة لتحليل الخلية الواحدة لاحقا. الميزات ، على الرغم من أنها أساسية ، كافية لتلبية احتياجات الباحثين في البيئات الأكاديمية وخارجها. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لاستخدام هذا الجهاز في قدرته على ت…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تلقي التمويل من قسم فيشيل للهندسة الحيوية (KM) ، و T32 GM080201 (MA) ، وزمالة Vogel الصيفية الممنوحة (MA) ، ومؤسسة LAM (KM) ، وجمعية الرئة الأمريكية (KM). يود المؤلفون أن يشكروا ميشيل كالوزينسكي على المساعدة في التحرير.
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
References
- Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).
- Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Rittié, L. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).
- Wang, J., et al. The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).
- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).
- McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells. Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).
- Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells. Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).
- Maisel, K., et al. Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation. Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).
- Karmakar, T., et al. A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).
- Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).
- Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. Carpal tunnel syndrome: a review of literature. Cureus. 12 (3), e7333 (2020).
