דיסוציאציה מכנית של רקמות לאנליזה של תא בודד באמצעות מכשיר ממונע
Summary
פרוטוקול כללי לדיסוציאציה מכנית אנזימטית ואוטומטית למחצה של רקמות ליצירת מתלים חד-תאיים לאנליזות במורד הזרם, כגון ציטומטריית זרימה, מסופק. הוראות לייצור, הרכבה ותפעול של המכשיר המכני בעלות נמוכה שפותח עבור פרוטוקול זה כלולות.
Abstract
היכולת לבודד ולהכין תאים בודדים לניתוח דגימות רקמה הפכה במהירות לחיונית לתגליות ומחקרים ביו-רפואיים חדשים. פרוטוקולים ידניים לבידודים של תא בודד גוזלים זמן רב ומועדים לשונות המשתמש. פרוטוקולים מכניים אוטומטיים מסוגלים להפחית את זמן העיבוד ואת השתנות הדגימה, אך אינם נגישים בקלות או חסכוניים בסביבות מחקר בעלות משאבים נמוכים יותר. המכשיר המתואר כאן תוכנן לדיסוציאציה חצי-אוטומטית של רקמות תוך שימוש בחומרים זמינים מסחרית כחלופה זולה למעבדות אקדמיות. הוראות לייצר, להרכיב ולהפעיל את עיצוב המכשיר סופקו. פרוטוקול הדיסוציאציה מייצר באופן אמין מתלים חד-תאיים עם תפוקת תאים דומה וכדימות דגימה להכנות ידניות על פני רקמות עכבר מרובות. הפרוטוקול מספק את היכולת לעבד עד 12 דגימות רקמה בו זמנית לכל מכשיר, מה שהופך מחקרים הדורשים דגימות גדולות לקלים יותר לניהול. התוכנה הנלווית מאפשרת גם התאמה אישית של פרוטוקול המכשיר כדי להתאים לרקמות משתנות ואילוצים ניסיוניים.
Introduction
אנליזה של תא בודד הפכה במהירות לחיונית לתגליות ביו-רפואיות חדשות, בין אם עבור יישומים כגון ציטומטריית זרימה, זיהוי סוגי תאים שונים, ריצוף תא בודד, או לזיהוי שינויים גנומיים או שעתוק בין תאים1. ביצוע בידוד תאים כזה מרקמות מעניינות דורש טחינת רקמות מנותחות ודחיפתן דרך מסננת תאים עדינה כדי לסנן רקמת חיבור מהתאים הרצויים (איור 1A). בידוד סוגי תאים דבקים, כגון תאים דנדריטיים או מקרופאגים, או תאים מרקמות סיביות במיוחד, דורש שלבי הפרדה מכניים או אנזימטיים נוספים 2,3,4. תהליך זה נעשה בדרך כלל באופן ידני, מה שהופך אותו לגוזל זמן רב ונוטה לשונות המשתמש בעת הערכת תפוקת התאים וכדאיות הדגימה. לכן, חיוני להציג אפשרויות הניתנות להתאמה אישית עבור דיסוציאציה אוטומטית של רקמות. בעוד שנעשו ניסיונות מסוימים לתכנן מערכות כאלה, האפשרויות הקיימות אינן תמיד נגישות, במיוחד במעבדות אקדמיות ובמסגרות דלות משאבים, בעיקר בשל האופי היקר של מכשירים אלה5. יתר על כן, מכשירים אלה אינם תמיד ניתנים להתאמה אישית לצרכים האישיים של קבוצת מחקר6.
כאן, מכשיר דיסוצייאטור רקמות תוכנן כדי להפוך את העיכול של רקמות שלמות או חתיכות רקמה לאוטומטי לתרחיפים חד-תאיים בעזרת אנזימי עיכול ושיבוש מכני. ניתן להרכיב מכשיר זה בקלות במעבדה, להכניס אותו לתאי חימום או קירור לצורך ויסות טמפרטורה, להתאים אותו למספר הרקמות הדרוש לניתוק, ולתכנת אותו עם פרוטוקולי הדיסוציאציה הרצויים. השימוש הנרחב במכשיר זה יכול לשפר באופן משמעותי את יכולת השחזור של פרוטוקולי מיצוי תאים ולספק חלופה חוסכת זמן לדיסוציאציה ידנית.
העיצוב מאפשר עיכול בו זמנית של עד 12 רקמות בתהליך אוטומטי. המכשיר מורכב מ -12 מנועים נפרדים המחוברים במקביל ומופעלים על ידי תקע קיר סטנדרטי באמצעות מתאם AC/DC עם חוגת מתח מתכווננת לשליטה על סיבוב / מהירות המנועים. המנועים מסובבים בורג משושה שמתאים היטב לחלק העליון של צינורות C. צינורות C מוחזקים במקומם על-ידי מתח כלפי מטה על לוח אקרילי שנצמד משני הצדדים ללוח העליון שבו מאובטחים המנועים (איור 1B). מכיוון שהמנועים מחווטים במקביל, מהירותם בכל מתח נתון לא אמורה להשתנות הרבה, אך העומס (מספר צינורות C המותקנים על המכשיר) ישפיע על המהירות גם כאשר המתח נשמר קבוע. כדי למדוד סיבובים לדקה (סל”ד), שולב טכומטר באמצעות חיישן אפקט הול ומגנט קבוע על אחד מפירי המנוע (איור משלים 1). קבצי CAD לבניית מערכים מוטוריים מסופקים בקובץ קידוד משלים 1. כלול גם מתג הניתן לתכנות כדי להפוך את כיוון הסיבוב על ידי היפוך המטענים החיוביים / שליליים המועברים למנועים. כל התכונות הללו משולבות באמצעות תוכנה מקודדת (תוכנת Arduino IDE, ראה טבלת חומרים) על Arduino Nano (קובץ קידוד משלים 2). באמצעות לחצנים מחוברים ופאנל LCD (איור משלים 2), ניתן ליצור ולהריץ פרוטוקולים שמורים ומותאמים אישית, להפוך אוטומטית את כיוון הסיבוב בזמנים מוגדרים של פרוטוקול, להתאים את המהירות באמצעות המתח (איור משלים 3), ולהציג את מהירות המנוע הנוכחית ואת הזמן שנותר להשלמת פרוטוקול מתוכנת (איור משלים 4).
עבור המחקר הנוכחי, תרחיפים חד-תאיים הוכנו באמצעות דיסוציאציה מכנית-אנזימטית של רקמות עם מכשיר זה ודיסוציאציה ידנית-אנזימטית של רקמות כדי לקבוע הבדלים, אם בכלל, בתאים שנמצאו עבור יישומים במורד הזרם. תכשירי התא הוערכו בהתבסס על סך תפוקת התאים לרקמה ואחוז הכדאיות של התא. ציטומטריית זרימה שימשה להשוואת הבדלים פוטנציאליים בביטוי סמן פני השטח. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת גרפים וניתוח סטטיסטי. מבחני t וולשיים לא מזווגים שימשו להשוואה בין זוגות דגימות או קבוצות, כאשר גודל הדגימה n > 4 עכברים המייצגים 2 ניסויים משוכפלים. הוראות מפורטות לייצור והרכבה של התקן זה ניתן למצוא בקובץ משלים 1. החומרים הדרושים לפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכשיר זה תוכנן להרכבה קלה בסביבת המחקר כדי לספק תרחיפים חד-תאיים מרקמות שלמות לניתוח תא בודד לאחר מכן. התכונות, למרות שהן בסיסיות, מספיקות כדי לענות על הצרכים של חוקרים במסגרות אקדמיות ומחוצה לה. יתרון מרכזי של שימוש במכשיר זה הוא הפוטנציאל שלו לשפר את הכנת המתלים של תא בודד על ידי הפחתת הש?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המימון התקבל מהמחלקה לביו-הנדסה ע”ש פישל (KM), T32 GM080201 (MA), מלגת הקיץ של ווגל (MA), קרן LAM (KM) ואיגוד הריאות האמריקאי (KM). המחברים מבקשים להודות למישל קלוז’ינסקי על עזרתו בעריכה.
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
References
- Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).
- Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Rittié, L. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).
- Wang, J., et al. The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).
- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).
- McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells. Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).
- Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells. Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).
- Maisel, K., et al. Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation. Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).
- Karmakar, T., et al. A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).
- Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).
- Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. Carpal tunnel syndrome: a review of literature. Cureus. 12 (3), e7333 (2020).
