Dissociazione meccanica dei tessuti per l'analisi di singole cellule mediante dispositivo motorizzato
Summary
Viene fornito un protocollo generale per la dissociazione meccanica enzimatica e semiautomatica combinata dei tessuti per generare sospensioni a singola cellula per analisi a valle, come la citometria a flusso. Sono incluse le istruzioni per la fabbricazione, l’assemblaggio e il funzionamento del dispositivo meccanico a basso costo sviluppato per questo protocollo.
Abstract
Essere in grado di isolare e preparare singole cellule per l’analisi di campioni di tessuto è diventato rapidamente cruciale per le nuove scoperte e ricerche biomediche. I protocolli manuali per gli isolamenti a singola cellula sono molto dispendiosi in termini di tempo e soggetti a variabilità dell’utente. I protocolli meccanici automatizzati sono in grado di ridurre i tempi di elaborazione e la variabilità dei campioni, ma non sono facilmente accessibili o convenienti in contesti di ricerca con risorse ridotte. Il dispositivo qui descritto è stato progettato per la dissociazione semiautomatica dei tessuti utilizzando materiali disponibili in commercio come alternativa a basso costo per i laboratori accademici. Sono state fornite le istruzioni per fabbricare, assemblare e utilizzare il design del dispositivo. Il protocollo di dissociazione produce in modo affidabile sospensioni a singola cellula con rese cellulari e vitalità del campione paragonabili alle preparazioni manuali su più tessuti di topo. Il protocollo offre la possibilità di elaborare fino a 12 campioni di tessuto contemporaneamente per dispositivo, rendendo più gestibili gli studi che richiedono campioni di grandi dimensioni. Il software di accompagnamento consente inoltre di personalizzare il protocollo del dispositivo per adattarsi ai diversi tessuti e vincoli sperimentali.
Introduction
L’analisi di singole cellule è diventata rapidamente cruciale per le nuove scoperte biomediche, sia per applicazioni come la citometria a flusso, l’identificazione di diversi tipi di cellule, il sequenziamento di singole cellule o per l’identificazione di variazioni genomiche o trascrittomiche tra le cellule1. L’esecuzione di tali isolamenti cellulari dai tessuti di interesse richiede la triturazione dei tessuti sezionati e la loro spinta attraverso un filtro cellulare fine per filtrare il tessuto connettivo dalle cellule desiderate (Figura 1A). L’isolamento di tipi di cellule aderenti, come le cellule dendritiche o i macrofagi, o di cellule provenienti da tessuti particolarmente fibrosi, richiede ulteriori passaggi di separazione meccanica o enzimatica 2,3,4. Questo processo viene generalmente eseguito manualmente, il che lo rende molto dispendioso in termini di tempo e soggetto a variabilità dell’utente quando si valutano le rese cellulari e la vitalità del campione. Pertanto, è fondamentale introdurre opzioni personalizzabili per la dissociazione automatizzata dei tessuti. Sebbene siano stati fatti alcuni tentativi per progettare tali sistemi, le opzioni esistenti non sono sempre facilmente accessibili, in particolare nei laboratori accademici e in ambienti con risorse ridotte, in gran parte a causa della natura proibitiva dei costi di questi dispositivi5. Inoltre, questi dispositivi non sono sempre personalizzabili in base alle esigenze individuali di un gruppo di ricerca6.
Qui, un dispositivo di dissociazione tissutale è stato progettato per automatizzare la digestione di interi tessuti o pezzi di tessuto in sospensioni unicellulari con l’aiuto di enzimi digestivi e interruzioni meccaniche. Questo dispositivo può essere facilmente assemblato in laboratorio, collocato in camere di riscaldamento o raffreddamento per la regolazione della temperatura, personalizzato per il numero richiesto di tessuti da dissociare e programmato con i protocolli di dissociazione desiderati. L’ampio uso di questo dispositivo potrebbe migliorare significativamente la riproducibilità dei protocolli di estrazione cellulare e fornire un’alternativa che consente di risparmiare tempo alla dissociazione manuale.
Il design consente la digestione simultanea di un massimo di 12 tessuti attraverso un processo automatizzato. Il dispositivo è composto da 12 singoli motori cablati in parallelo e alimentati da una presa a muro standard tramite un adattatore AC/DC con un quadrante di tensione regolabile per controllare la rotazione/velocità dei motori. I motori ruotano un bullone esagonale che si inserisce perfettamente nella parte superiore dei tubi a C. I tubi a C sono tenuti in posizione da una tensione verso il basso su una piastra acrilica che si aggancia su entrambi i lati alla piastra superiore dove sono fissati i motori (Figura 1B). Poiché i motori sono cablati in parallelo, la loro velocità a una data tensione non dovrebbe variare molto, ma il carico (il numero di tubi a C montati sul dispositivo) influenzerà la velocità anche quando la tensione viene mantenuta costante. Per misurare le rotazioni al minuto (giri/min), è stato incorporato un tachimetro che utilizza un sensore ad effetto Hall e un magnete fisso su uno degli alberi motore (Figura 1 supplementare). I file CAD per la costruzione di array di motori sono forniti nel file di codifica supplementare 1. È incluso anche un interruttore programmabile per invertire il senso di rotazione invertendo le cariche positive/negative erogate ai motori. Tutte queste funzionalità sono integrate utilizzando un software codificato (software Arduino IDE, vedi Table of Materials) su un Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Utilizzando i pulsanti collegati e un pannello LCD (Figura supplementare 2), è possibile creare ed eseguire protocolli salvati e personalizzati, invertire automaticamente il senso di rotazione a orari specificati di un protocollo, regolare la velocità utilizzando la tensione (Figura supplementare 3) e visualizzare la velocità corrente del motore e il tempo rimanente per completare un protocollo programmato (Figura supplementare 4).
Per il presente studio, sono state preparate sospensioni a singola cellula utilizzando sia la dissociazione tissutale meccanico-enzimatica con questo dispositivo che la dissociazione tissutale manuale-enzimatica per determinare le differenze, se presenti, nelle cellule recuperate per applicazioni a valle. Le preparazioni cellulari sono state valutate in base alla resa cellulare totale per tessuto e alla percentuale di vitalità cellulare. La citometria a flusso è stata utilizzata per confrontare le differenze di potenziale nell’espressione dei marcatori di superficie. I dati sono stati analizzati utilizzando software di analisi grafica e statistica. I t-test Welch non accoppiati sono stati utilizzati per confrontare coppie di campioni o gruppi, con dimensioni del campione n > 4 topi che rappresentavano 2 esperimenti replicati. Istruzioni dettagliate per la fabbricazione e il montaggio di questo dispositivo sono disponibili nel file supplementare 1. I materiali necessari per questo protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo dispositivo è stato progettato per un facile assemblaggio in ambito di ricerca per fornire sospensioni unicellulari da tessuti interi per la successiva analisi di singole cellule. Le caratteristiche, sebbene di base, sono sufficienti per soddisfare le esigenze dei ricercatori in ambito accademico e non solo. Un vantaggio chiave dell’utilizzo di questo dispositivo è il suo potenziale per migliorare la preparazione di sospensioni a singola cellula riducendo la variabilità. Inoltre, la capacità di elaborare 12+ c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I finanziamenti sono stati ricevuti dal Dipartimento di Bioingegneria di Fischell (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) e American Lung Association (KM). Gli autori desiderano ringraziare Michele Kaluzienski per l’aiuto con l’editing.
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
References
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