Summary
Dit protocol beschrijft een gedragstest voor het registreren van door suiker uitgelokt zoekgedrag met behulp van Drosophila melanogaster. De test kan worden gebruikt om voedings- en foerageergerelateerd gedrag te bestuderen, evenals de onderliggende neuronale mechanismen.
Abstract
Foerageergedrag is essentieel voor het voortbestaan van organismen, omdat het hen in staat stelt essentiële voedselbronnen te lokaliseren en te verwerven. Bij Drosophila veroorzaakt honger een duidelijk zoekgedrag na de consumptie van kleine hoeveelheden van een suikeroplossing. Dit rapport presenteert een eenvoudige experimentele opzet om door suiker uitgelokt zoekgedrag te bestuderen met als doel de onderliggende mechanismen bloot te leggen. Minieme hoeveelheden geconcentreerde suikeroplossing lokken aanhoudend zoekgedrag uit bij vliegen. De betrokkenheid van padintegratie bij dit gedrag is vastgesteld, aangezien vliegen hun baan gebruiken om terug te keren naar de suikerlocatie. De meest recente bevindingen leveren bewijs van temporele modulatie in de initiatie en intensiteit van het zoekgedrag na suikerinname. We hebben deze opstelling ook gebruikt voor kunstmatige activatie van specifieke smaakreceptorneuronen in de keelholte, die het zoekgedrag uitlokt. De neurogenetische toolkit van Drosophila biedt een breed scala aan hulpmiddelen en technieken die kunnen worden gecombineerd met het door suiker opgewekte zoekgedragparadigma om de neurale en genetische mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan foerageren. Het begrijpen van de neurale basis van hongergedreven zoekgedrag bij vliegen draagt bij aan het gebied van de neurobiologie als geheel en biedt inzicht in de regulerende mechanismen die het voedingsgedrag bepalen, niet alleen bij andere organismen, maar ook bij mensen.
Introduction
Voedselzoekend en foeragerend gedrag is een fundamentele overlevingsstrategie die door organismen in verschillende taxa wordt vertoond. Er zijn twee soorten foerageergedrag geïdentificeerd bij insecten: door honger veroorzaakt zoeken naar voedsel en lokaal zoeken na de maaltijd1. Als insecten honger hebben, vertrouwen ze op zintuiglijke signalen om voedselbronnen te lokaliseren. Bij het tegenkomen en consumeren van een klein voedselveld, initiëren ze een lokaal zoekgedrag dat wordt gekenmerkt door ingewikkelde paden en cirkelen rond de voedsellocatie.
Sugar-uitgelokt zoekgedrag, een bijzondere vorm van lokaal zoeken, werd meer dan 60 jaar geleden voor het eerst bestudeerd door de Amerikaanse bioloog Vincent Dethier in blowflies2. Wanneer ze uitgehongerd zijn, krijgen vliegen een kleine hoeveelheid suiker voorgeschoteld, zodat ze niet verzadigd raken, ze beginnen een lokale zoektocht. Typisch zoekgedrag wordt gekenmerkt door een zeer kronkelige wandeling met een lage motoriek en een hoge draaisnelheid en het maken van terugkeer naar de locatie van de suikerdruppel. Latere studies hadden dit gedrag onderzocht bij huisvliegen en fruitvliegen 3,4. De initiatie, intensiteit en duur van de zoektocht wordt bepaald door de interne toestand van het dier (bijv. ontbering en motivatie) en externe factoren zoals beschikbaarheid van hulpbronnen en kwaliteit 1,5,6.
Vooruitgang in trackingtechnologieën heeft onderzoekers waardevolle hulpmiddelen geboden om gedrag binnen gecontroleerde arena's vast te leggen en te analyseren. Hier presenteren we een gedragsparadigma voor het volgen van vrij rondlopende vliegen na inname van suiker. Deze eenvoudige opstelling maakt het mogelijk om het door suiker opgewekte zoekgedrag in Drosophila te bestuderen door de beweging van de vlieg vast te leggen en te analyseren als reactie op een geconcentreerde suikeroplossing die in een arena wordt geleverd. Met behulp van geavanceerde trackingtechnologie en data-analysetechnieken zijn de bewegingspatronen, ruimtelijke verkenning en responsdynamiek op suikerstimuli met succes gekwantificeerd.
Met behulp van deze test is experimenteel aangetoond dat de door suiker opgewekte zoektocht het gebruik van padintegratie omvat en ruimtelijk-temporeel kan worden gescheiden van suikerinname 7,8. Verder is aangetoond dat het gedrag kan worden uitgelokt door de activering van faryngeale smaakneuronen9. Recente resultaten tonen aan dat suikerstimulus geen aangeboren afgiftemechanisme is, maar ook modulerend en de initiatie van het gedrag tijdelijk regelt8. Aan de hand van dit paradigma hebben we dit gedrag ook bestudeerd bij honingbijen (Apis mellifera)7,8.
Het uiteindelijke doel van dit onderzoek is het ontrafelen van neurale circuits en nieuwe genetische componenten die betrokken zijn bij het reguleren van zoekgedrag door middel van gerichte genetische manipulaties en neuroimaging-technieken. Voedselzoekgedrag is zeer effectieve experimentele paradigma's gebleken voor het bestuderen van navigatie en ruimtelijk geheugen bij insecten. Dit gedrag biedt een unieke kans om de zintuiglijke waarneming, besluitvormingsprocessen en motorische coördinatie te onderzoeken die betrokken zijn bij het zoeken naar lonende voedselbronnen bij vliegen. Bovendien hebben de bevindingen van deze onderzoeken bredere implicaties voor het begrijpen van voedingsgedrag bij andere organismen, waaronder mensen, aangezien veel fundamentele genetische en neurale mechanismen evolutionair behouden blijven. Ontregeling van voedingsgedrag wordt in verband gebracht met verschillende neurologische en metabole aandoeningen10. Daarom kunnen de neurale en genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan het zoekgedrag bij vliegen nieuwe wegen bieden om deze complexe uitdagingen op het gebied van de menselijke gezondheid te begrijpen en mogelijk aan te pakken.
Protocol
Volwassen mannelijke vliegen van de Drosophila melanogaster Canton-S (CS) wild-type stam werden gebruikt voor de huidige studie.
1. Experimentele voorbereiding
- Vliegenopfok
- Verzamel volwassen mannetjesvliegen die binnen een periode van 12 uur tevoorschijn komen en bewaar ze gedurende 48 uur op standaard vliegenmedia (zelf voorbereid) bij 25 °C met een relatieve vochtigheid van 75% in een licht/donkercyclus van 12 uur.
OPMERKING: De gebruikte Drosophila-mediasamenstelling was (voor 1 L media) maïsmeel (80 g), D-glucose (20 g), suiker (40 g), agar (8 g), gistpoeder (15 g), propionzuur (4 ml), methyl-4-hydroxybenzoaat (1,25 g in 3 ml ethanol) en orthofosforzuur (600 μl) (zie materiaaltabel). De eerste voedingsperiode zorgt ervoor dat de vliegen toegang hebben tot voldoende voedsel en voedingsstoffen vóór de hongerfase. Terwijl zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen het zoekgedrag uitlokken, is de uithongeringstijd consistenter bij mannelijke vliegen. Bovendien veranderen vrouwelijke vliegen hun voedingsvoorkeur na het paren11.
- Verzamel volwassen mannetjesvliegen die binnen een periode van 12 uur tevoorschijn komen en bewaar ze gedurende 48 uur op standaard vliegenmedia (zelf voorbereid) bij 25 °C met een relatieve vochtigheid van 75% in een licht/donkercyclus van 12 uur.
- Uithongering procedure
- Na de voederperiode verhonger je de vliegen van voedsel, maar met toegang tot water.
OPMERKING: Om de hongertoestand in alle proeven en stammen te standaardiseren, wordt voorgesteld om de duur van 90% overleving van de populatie onder voedselarme omstandigheden te bepalen. Op basis van dit resultaat werden CS-vliegen gedurende 28 uur uitgehongerd (Figuur 1A) omdat circadiane ritmes en andere factoren het zoekgedrag kunnen beïnvloeden12. Circadiane veranderingen van vliegzoekactiviteiten op verschillende tijdstippen van de dag werden ook gemeten (Figuur 1B). We merkten een verminderde relatieve zoekactiviteit 's nachts in vergelijking met de lichtfase bij vliegen. - Bereken de tolerantie voor voedselgebrek door vliegen van twee dagen oud voedsel te ontnemen. Doe 15-20 vliegen in een injectieflacon met geweekt vloeipapier op de bodem. Dit dient als substraat en zorgt ervoor dat de vliegen gedurende de hele hongerperiode toegang hebben tot water.
- Tel het aantal vliegen tijdens de voedselhongerperiode met regelmatige tussenpozen van 1 uur. De duur waarin 90% van de uitgehongerde vliegen overleefde, werd gebruikt als de uithongeringsperiode (figuur 1A). Gebruik meerdere replicaten (3-4 voor elke stam) om de impact van individuele variaties te minimaliseren en een betrouwbaardere beoordeling van de hongertolerantie te geven.
OPMERKING: De voedselhongertolerantie van elke stam werd bepaald om een gestandaardiseerde hongertoestand vast te stellen tussen verschillende stammen en experimenten. Door de overlevende vliegen met deze tussenpozen te tellen, kan men het overlevingspercentage in de loop van de tijd volgen en bepalen hoe lang elke stam voedselgebrek kan verdragen voordat hij bezwijkt aan de hongerdood.
- Na de voederperiode verhonger je de vliegen van voedsel, maar met toegang tot water.
- Procedure voor het vastleggen van het gedrag
- Breng individuele uitgehongerde vliegen over in kleine buisjes (Figuur 2A). Doe dit in batches van 5-6 vliegen om de isolatietijd te minimaliseren. Door enkele vliegen te testen en elke vlieg te isoleren, kunnen alle waargenomen veranderingen of acties worden toegeschreven aan de specifieke vlieg die wordt waargenomen, in plaats van te worden beïnvloed door interacties met andere vliegen.
- Gebruik petrischalen van 90 mm als arena voor gedragstesten (grotere petrischalen kunnen worden gebruikt. Er was geen verschil in gedrag in petrischalen met een grotere diameter). Verlicht de arena van onderaf door een paneel met koelwitte LED's op het oppervlak (Figuur 2B,C). Om een uniforme visuele omgeving te behouden en afleiding van buitenaf tot een minimum te beperken, omringt u de experimentele arena met een witte polyvinylchloridebuis (51,5 mm hoog, 114 mm binnendiameter).
OPMERKING: Deze pijp fungeert als een barrière en voorkomt dat visuele prikkels van buiten de arena het gedrag van de vlieg beïnvloeden. Door afleiding van buitenaf te verminderen, kan men zich uitsluitend concentreren op de interactie van de vlieg met de voedselbron, waardoor de consistentie tijdens het experiment behouden blijft. - Gebruik een lichtintensiteit van 320 lux in het midden van de arena.
- Plaats 0,2 μL suikeroplossing in het midden van de arena. In de gerapporteerde experimenten werd 500 mM sucrose-oplossing gebruikt, maar dit kan worden gevarieerd. Introduceer de vlieg in de arena met behulp van een microcentrifugebuisje van 2 ml (binnendiameter 8,7 mm, lengte teruggebracht tot 5 mm door katoen aan de onderkant te vullen; Figuur 2A) met een enkele vlieg omgekeerd over de suikerdruppel.
- Zodra de vlieg de druppel begint op te nemen, verwijdert u de vliegencontainer, zodat de vlieg onbeperkte toegang heeft tot de voedselbron.
- Film de 2D-positie van de arena met een overheadcamera.
OPMERKING: Flea3 (Point Grey, 1214 mm lens, zie Tabel met materialen) werd gebruikt voor het huidige onderzoek en opgenomen met 40 frames per seconde (fps). Elke camera die een goed contrast met de achtergrond biedt, kan echter worden gebruikt. Men kan opnemen met 30-60 fps, afhankelijk van de aard van het experiment. Neem op in .avi formaat, omdat het compatibel is met de trackingsoftware. - Neem de proef op tot het moment dat de vlieg uit de arena ontsnapte. De vliegen liepen vrij rond en er was geen deksel op de arena.
- Door de vlieg te laten beslissen wanneer hij stopt met zoeken, wegvliegt of naar de rand van de arena loopt, observeer je het natuurlijke gedrag en de voedselzoekstrategie van de vlieg. Veeg de petrischaaltjes tussen de proeven door af met 70% ethanol en droog ze volledig af of gebruik anders een nieuwe petrischaal.
OPMERKING: Het is belangrijk om alle experimenten uit te voeren tussen 2 uur en 6 uur nadat de lichten zijn gebrand, wanneer de vliegen constant hoge activiteitsniveaus vertonen. Dit tijdsbestek zorgt ervoor dat de vliegen zich in een actieve toestand bevinden, waardoor de kans op het observeren van hun natuurlijke voedselzoekgedrag wordt gemaximaliseerd en de impact van andere factoren die hun gedrag kunnen beïnvloeden, zoals circadiane ritmes, wordt verminderd. De gedragsopstelling was gehuisvest in een ruimte met temperatuur- en vochtigheidsregeling. De arena werd op een trillingsvrije tafel geplaatst. Deze experimentele opstelling omvatte het isoleren en testen van individuele vliegen op hun reactie op suiker. De uitgehongerde vliegen kregen een suikerdruppel en hun gedrag werd op video opgenomen (Figuur 2B,C, Video 1). De experimenten werden uitgevoerd gedurende een specifiek tijdsbestek waarin de vliegen consistent hoge activiteitsniveaus vertoonden.
- Analyseer de trajecten na stap 2 om het zoekgedrag te bepalen.
2. Analyse van trajecten voor lokaal zoeken
- Analyseer de opgenomen video's met behulp van Ctrax-software11 (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De software volgt en converteert de positie van de vlieg in de video in x- en y-coördinaten, waardoor nauwkeurige tracking en analyse van zijn bewegingen mogelijk is. Raadpleeg Aanvullend bestand 1 voor meer informatie over het gebruik van Ctrax. - Verdeel de trajecten in twee fasen: de initiële voerfase en de zoekfase. Definieer het einde van het voeden en het begin van het lopen als vliegen die bewegen met een snelheid >4 mm s-1 in drie opeenvolgende frames.
OPMERKING: Nadat het voeren voorbij was, werd de rest van het traject gebruikt als zoekreactie van de vliegen. Deze studie maakte gebruik van VirtualDub (zie Tabel met materialen) om de voedingsfase uit de video's te verwijderen voordat ze werden gevolgd. - Kwantificeer de zoekopdracht aan de hand van de volgende parameters:
- Padlengte: Deze parameter vertegenwoordigt de afstand die de vlieg heeft afgelegd vanaf het startpunt tijdens het zoeken naar voedsel (in mm).
- Verblijfstijd: De tijd die de vliegen besteden aan het lopen tijdens het zoeken (in s). Het geeft de duur van de zoektocht aan en de volharding van de vlieg in het zoeken naar voedsel.
- Meander: Bereken dit als een verhouding door de beeline (de afstand tussen het eerste en het laatste punt van het pad) van het pad te delen door de totale padlengte en af te trekken van 1. Hoge meanderwaarden duiden op meer kronkeligheid in het traject.
- Aantal retourzendingen: Gebruik het ontwikkelde algoritme om het aantal retouren te identificeren en te tellen met behulp van twee concentrische cirkels.
OPMERKING: Een binnenste cirkel die de oorsprong van het zoeken aangeeft, Rin (2,5 mm) en de buitenste cirkel die de minimale afstand van de vlucht (4 mm) aangeeft die de vlieg van de oorsprong moest verwijderen. Een terugkeer werd gedefinieerd als een beweging uit de buitenste cirkel (Rout) en dan weer terugkomen in de binnenste cirkel (Rin). - Activiteitssnelheid: Bereken de activiteitssnelheid uitgedrukt als een percentage door de tijd te bepalen tijdens het zoeken naar voedsel wanneer de loopsnelheid van de vlieg hoger is dan 2 mm/s. Deze parameter weerspiegelt het activiteitsniveau en de betrokkenheid van de vlieg bij het zoeken naar voedsel. Het onderscheidt actieve foerageerders van minder actieve individuen.
OPMERKING: MATLAB en Python werden in de huidige studie gebruikt voor verdere analyse van de trajecten. De scripts zijn hier te vinden: https://github.com/eagermeagre/sugar_elicited_search. De analyseprocedure omvat het gebruik van de Ctrax-software om de bewegingen van de vlieg te volgen en parameters te bepalen zoals de duur van het zoeken naar voedsel, de totale lengte van het pad, de zoektijd, de meander, het aantal retourzendingen en de activiteitssnelheid. Deze parameters bieden waardevolle inzichten in het gedrag en de foerageerefficiëntie van de vlieg tijdens de geregistreerde experimenten met het zoeken naar voedsel.
Representative Results
De vliegen moesten worden uitgehongerd gedurende de periode die werd geschat door de voedselverhongeringstolerantie en de respons op suiker werd individueel getest (Figuur 1A en Figuur 2A). Het gedrag werd geregistreerd in een ruimte met temperatuur- en vochtigheidsregeling. 0,2 μL 500 mM sucrose-oplossing werd gebruikt voor de gerapporteerde experimenten. De suikerdruppel werd in het midden van de arena geplaatst en de vliegen werden aan de suiker geïntroduceerd (Figuur 2B). Het gedrag werd geregistreerd totdat vliegen uit de arena ontsnapten. De video's werden geanalyseerd om x,y-coördinaten en trajecten van de vliegen te extraheren. Verschillende parameters werden gebruikt om de gedragsrespons te kwantificeren: padlengte, verblijftijd, meander, aantal retouren en activiteitsgraad.
Suikerinname bij uitgehongerde vliegen leidt tot een lokale zoektocht met een meanderend pad en lussen (Figuur 3A,C). Als negatieve controle werden uitgehongerde vliegen geregistreerd diegeen suiker kregen 8. Toen deze vliegen in de arena werden geïntroduceerd en leegliepen, begonnen ze niet te zoeken en ontsnapten ze uit de arena (Figuur 3B,D). Deze groep wordt aangeduid als niet-gevoede vliegen. De parameters van het zoeken: padlengte, verblijftijd, meander en aantal retouren waren significant lager bij niet-gevoerde vliegen in vergelijking met de vliegen die een suikerdruppel kregen (Figuur 4A-D).
Figuur 1: Uithongeringscurven van wildtype stam CS. (A) Hongercurve die de overlevingskans van wildtype CS mannelijke en vrouwelijke vliegen laat zien. (B) Circadiane veranderingen van vliegzoekactiviteiten op verschillende tijdstippen van de dag. Foutbalken staan voor S.E.M. (n = 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimentele opstelling inclusief berekening van de hongertolerantie, procedures voor het registreren van gedrag en trajectanalyse. (A) Voedselhongertolerantie werd bepaald om een gestandaardiseerde hongertoestand vast te stellen. Voor het vastleggen van gedrag werden individuele vliegen vóór het experiment geïsoleerd in kleine buisjes. De gedragsarena, een petrischaal van 90 mm, werd vanaf de onderkant gelijkmatig verlicht. Een druppel suikeroplossing werd in het midden geplaatst en vliegen kregen onbeperkte toegang tot de voedselbron. (B) Het gedrag werd geregistreerd totdat vliegen uit de arena ontsnapten. Video-analyse gebruikte Ctrax-software voor tracking en MATLAB/Python voor trajectanalyse. (C) Foto van de experimentele opstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Noodzaak van de suikerinname voor het initiëren van lokale zoekopdrachten. (A) Individuele trajecten van vliegen gevoed met 500 mM, 0,2 μL suikeroplossing. (B) Individuele banen van vliegen die geen suiker kregen. (C) Overlay van zoektrajecten vliegt uit de controlegroep (n = 11). (D) Bedekking van de banen van de vliegen (n = 11) die geen suiker kregen. Alle trajecten zijn genormaliseerd naar het beginpunt van het lopen. Deze figuur is een bewerking van Shakeel en Brockmann8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Reductie van gedragsparameters bij niet-gevoede vliegen. (A-D) Padlengte, verblijftijd, meander en aantal retouren waren kleiner voor hongerige vliegen die geen suikerbeloning kregen in vergelijking met controlevliegen die gestimuleerd met suiker werden gegeven. **p < 0,001, ***p < 0,0001, ****p < 0,00001, Wilcoxon Rank Sum Test. Deze figuur is een bewerking van Shakeel en Brockmann8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Zoekgedrag van een vlieg met real-time traject van het pad. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Stapsgewijze instructies voor het volgen van het videobestand met behulp van CTRAX. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De huidige studie introduceert een eenvoudig paradigma voor het onderzoeken van door suiker uitgelokt zoekgedrag in Drosophila, voor het eerst beschreven door Dethier2. Dit aangeboren gedrag stelt de vliegen in staat om lokaal op zoek te gaan naar extra voedselbronnen na de ontmoeting met een voedselbeloning. Het meest cruciale aspect van het experimentele protocol is het op de juiste manier motiveren van de vliegen. Ten eerste moeten de vliegen honger lijden, omdat ze geen voedsel hebben gekregen terwijl ze nog steeds toegang hebben tot water, om ervoor te zorgen dat ze suiker binnenkrijgen. Om de uniforme hongertoestand in alle experimentele proeven te hebben, werd de duur waarin 90% van de bevolking overleeft gebruikt als de uithongeringsperiode. Cruciaal is dat de inductie van een zoekreactie na het voeren de toediening van een voedselprikkel vereist die van voldoende kwaliteit is, maar niet voldoende om de vliegen volledig te verzadigen. Daarom kan het standaardiseren van de concentratie en hoeveelheid suiker en de uithongeringsduur tijdrovend zijn, maar het is absoluut noodzakelijk voor robuust en betrouwbaar gedrag.
In deze studie werd een sucrose-oplossing van 500 mM, 0,2 μL gebruikt als stimulans voor uitgehongerde vliegen. Suikerinname roept een karakteristiek lokaal zoekgedrag op dat wordt gekenmerkt door verhoogd draaigedrag en frequente terugkeer naar de locatie van de suikerdruppel (video 1). Omgekeerd vertonen hongerige vliegen die geen suiker krijgen geen zoekreactie. Met name alle gedragsgerelateerde parameters, waaronder padlengte, verblijftijd, meander en aantal retourzendingen, waren significant lager bij niet-gevoede vliegen. We hebben eerder aangetoond dat de inname van water alleen geen zoekreactie uitlokt9.
Deze opstelling biedt een kosteneffectieve en onderhoudsarme aanpak voor het bestuderen van dit aangeboren gedrag. Hoewel in dit onderzoek een arena met achtergrondverlichting wordt gebruikt, kan ook topverlichting worden gebruikt, zolang er voldoende contrast is tussen de vlieg en de achtergrond. De gebruikte volgsoftware is gebaseerd op de detectie van vliegbewegingen tegen een statische achtergrond13. De camera- en resolutie-instellingen kunnen worden aangepast op basis van de specifieke schaal van het gedrag dat wordt onderzocht. Belangrijk is dat deze methodologie de studie van verschillende componenten van foerageergedrag mogelijk maakt, waaronder sensorische aandacht tijdens het foerageren, voedselbetrokkenheid en voeding, locomotorische controle van zoeken en besluitvormingsprocessen die verband houden met exploitatie en exploratie, onder andere. Bovendien vergemakkelijkt dit paradigma het onderzoek naar lokaal zoeken, een gedrag dat vaak wordt waargenomen bij verschillende taxa in verschillende ecologische contexten6. Het bestuderen van dit gedrag in Drosophila opent wegen voor wetenschappelijk onderzoek gericht op het begrijpen van de neurale paden die betrokken zijn bij foerageren. We hebben lokaal zoeken bij honingbijen bestudeerd en hebben aangetoond dat het gedrag gelijkenis vertoont met vliegen 7,8.
Recente studies hebben aangetoond dat lokaal zoekgedrag kan worden veroorzaakt door optogenetische activering van verschillende suikersensorische neuronen in vliegen 14,15,16. Het blijft echter onduidelijk in hoeverre de lokale zoekopdrachten die in deze onderzoeken zijn waargenomen, nauwkeurig het natuurlijke gedrag van vliegen weergeven als reactie op de werkelijke suikerinname. Het voedingsgedrag is bij vliegen streng gereguleerd en deze bevindingen geven aan dat de activering van faryngeale suikerreceptoren het zoekgedrag initieert. Tarsale smaaksensilla zijn verantwoordelijk voor het detecteren van suiker en het induceren van de proboscis-extensiereflex, terwijl faryngeale smaakneuronen bepalen of het voeden moet doorgaan17,18. Eenmaal ingenomen, reist de suikeroplossing door de slokdarm naar de proventriculus en komt het gewas binnen, waarbij de expansie wordt gecontroleerd door een terugkerende zenuw19. Bovendien is het vermeldenswaard dat sommige van de bovengenoemde onderzoeken betrekking hadden op het in het leven roepen of opsluiten van vliegen, terwijl deze methode de dieren in staat stelt vrij rond te lopen tijdens het experiment. De vliegen in onze experimenten waren voldoende gemotiveerd om binnen de arena te blijven en te zoeken zonder een deksel op te leggen.
Inzicht in de ingewikkelde wisselwerking tussen neurale paden, genetische factoren en omgevingssignalen die het zoekgedrag bij vliegen bepalen, kan licht werpen op de fundamentele principes van informatieverwerking, leren en geheugenvorming. Bovendien is ontregeling van het foerageergedrag betrokken bij verschillende menselijke aandoeningen, waaronder eetstoornissen en obesitas. Het uitgebreide scala aan neurogenetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila biedt een waardevolle bron voor het onderzoeken van het door suiker opgewekte zoekgedrag en het ontrafelen van de neurale en genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan foerageren. In combinatie met optogenetische manipulatie en functionele beeldvorming presenteert dit paradigma een krachtige en veelbelovende benadering 20,21,22. Het aanpassen van de opstelling voor real-time manipulatie van neuronale activiteit met optogenetica kan echter een uitdaging zijn. Om de neuronale activiteit in de hersenen te monitoren terwijl een vlieg het zoekgedrag uitvoert, is een andere opstelling nodig, zoals de vastgebonden vlieg op een loopvlakbal. Veel aspecten van foerageergedrag, zoals voedselregulatie en besluitvormingsprocessen, zijn sterk geconserveerd bij alle soorten. Daarom kunnen inzichten die zijn verkregen door het bestuderen van de neurale mechanismen van foerageren bij vliegen waardevolle inzichten opleveren in vergelijkbare processen in andere organismen, waaronder mensen.
Disclosures
De auteur(s) verklaren geen mogelijke belangenconflicten met betrekking tot het onderzoek, het auteurschap en/of de publicatie van dit artikel.
Acknowledgments
We danken Ravikumar Boyapati voor zijn hulp bij het opzetten van de arena. Dit werk wordt gefinancierd door Wellcome Trust DBT Intermediate India Alliance-subsidie (subsidienummer IA / I / 15 / 2 / 502074) aan PK MS werd gefinancierd door een fellowship van de Indian Council of Medical Research (ICMR). AB werd gefinancierd door NCBS-TIFR institutionele fondsen (nr. 12P4167) en het ministerie van Atoomenergie, regering van India (nr. 12-R& D-TFR-5.04-0800 en 12-R& D-TFR-5.04-0900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Eppendorf tube | Sigma Aldrich | BR780546 | Used to introduce the fly to the sugar drop |
| Agar | SRL | 9002-18-0 | |
| Azure lens | https://www.rmaelectronics.com/azure-photonics-azure-1214mm/ | ||
| Camera | Logicool, Japan | ||
| Corn flour | locally available | ||
| Ctrax software | https://ctrax.sourceforge.net/ | ||
| D-glucose | SRL | 50-99-7 | |
| Flea3 | Sony | https://www.flir.com/products/flea3-usb3/?vertical=machine+vision&segment=iis | |
| glass tube | Borosil | Used to house the flies individually | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34155 | Used to provide access to water for flies during food starvation |
| LED light panel | custom-made in the workshop | ||
| Light Meter | TENMARS | TM-203 | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Fisher Scientific | 99-76-3 | |
| Orthophosphotic acid | SRL | 7664-38-2 | |
| Petri dish (90 mm) | Tarsons | 460090 | |
| Propionic acid | SRL | 79-09-4 | |
| Sucrose | Qualigens | Q28105 | |
| Sugar | locally available | ||
| VirtualDub | https://www.virtualdub.org/ | ||
| White polyvinyl chloride pipe (67 mm inner diameter × 100 mm height) | custom-made in the workshop | ||
| Yeast powder | SRL | REF-34266 |
References
- Jander, R.
- Dethier, V. G. Communication by insects: Physiology of dancing. Science. 125 (3243), 331-336 (1957).
- White, J., Tobin, T. R., Bell, W. J. Local search in the housefly Musca domestica after feeding on sucrose. J. Insect Physiol. 30 (6), 477-487 (1984).
- Bell, W. J., Cathy, T., Roggero, R. J., Kipp, L. R., Tobin, T. R. Sucrose stimulated searching behaviour of Drosophila melanogaster in a uniform habitat: modulation by period of deprivation. Animal Behav. 33, 436-448 (1985).
- Dethier, V. G.
- Bell, W. J.
- Brockmann, A., et al. Sugar intake elicits intelligent searching behavior in flies and honey bees. Front Behav Neurosci. 12, 280 (2018).
- Shakeel, M., Brockmann, A. Temporal effects of sugar intake on fly local search and honey bee dance behaviour. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. , (2023).
- Murata, S., Brockmann, A., Tanimura, T. Pharyngeal stimulation with sugar triggers local searching behavior in Drosophila. J Exp Biol. 220 (Pt 8), 3231-3237 (2017).
- Nishijo, H., Ono, T. Neural mechanisms of feeding behavior and its disorders new insights into metabolic syndrome. IntechOpen. , (2021).
- Carvalho, G. B., Kapahi, P., Anderson, D. J., Benzer, S. Allocrine modulation of feeding behavior by the sex peptide of Drosophila. Curr Biol. 16 (7), 692-696 (2006).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Corfas, R. A., Sharma, T., Dickinson, M. H. Diverse food-sensing neurons trigger idiothetic local search in Drosophila. Curr Biol. 29 (10), 1660-1668.e4 (2019).
- Behbahani, A. H., Palmer, E. H., Corfas, R. A., Dickinson, M. H. Drosophila re-zero their path integrator at the center of a fictive food patch. Curr Biol. 31 (20), 4534-4546.e5 (2021).
- Titova, A. V., et al. Displacement experiments provide evidence for path integration in Drosophila. J Exp Biol. 226 (12), jeb245289 (2023).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
- LeDue, E. E., Chen, Y. C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat Commun. 6, 6667 (2015).
- Gelperin, A. Abdominal sensory neurons providing negative feedback to the feeding behavior of the blowfly. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 72 (1), 17-31 (1971).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Gonzalez-Suarez, A. D., Clark, D. A. Spatiotemporally precise optogenetic activation of sensory neurons in freely walking Drosophila. Elife. 9, e54183 (2020).
- Grover, D., Katsuki, T., Li, J., Dawkins, T. J., Greenspan, R. J. Imaging brain activity during complex social behaviors in Drosophila with Flyception2. Nat Commun. 11 (1), 623 (2020).
