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Biochemistry

Métabolomique artérioveineuse pour mesurer l’échange de métabolites in vivo dans le tissu adipeux brun

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/66012
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 3, 2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences, Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University
* These authors contributed equally

Summary

Dans ce protocole, les méthodes pertinentes pour la métabolomique artérioveineuse optimisée pour les MTD utilisant la GC-MS dans un modèle murin sont décrites. Ces méthodes permettent d’acquérir des informations précieuses sur l’échange de métabolites médié par les MTD au niveau de l’organisme.

Abstract

Le tissu adipeux brun (MTD) joue un rôle crucial dans la régulation de l’homéostasie métabolique grâce à un processus unique de dépense énergétique connu sous le nom de thermogenèse sans frisson. Pour y parvenir, BAT utilise un menu diversifié de nutriments circulants pour répondre à sa forte demande métabolique. De plus, la MTD sécrète des facteurs bioactifs dérivés de métabolites qui peuvent servir de carburants métaboliques ou de molécules de signalisation, facilitant la communication intratissulaire et/ou intertissulaire médiée par les MTD. Cela suggère que la MTD participe activement à l’échange systémique de métabolites, une caractéristique intéressante qui commence à être explorée. Ici, nous présentons un protocole pour la métabolomique artérioveineuse BAT optimisée in vivo au niveau de la souris. Le protocole se concentre sur des méthodes pertinentes pour les stimulations thermogéniques et une technique de prélèvement sanguin artérioveineux utilisant la veine de Sulzer, qui draine sélectivement le sang veineux interscapulaire dérivé de MTD et le sang artériel systémique. Ensuite, un protocole métabolomique basé sur la chromatographie en phase gazeuse utilisant ces échantillons de sang est démontré. L’utilisation de cette technique devrait permettre d’élargir la compréhension de l’échange de métabolites régulés par les MTD au niveau inter-organes en mesurant l’absorption et la libération nettes de métabolites par les MTD.

Introduction

Le tissu adipeux brun (MTD) possède une propriété unique de dépense énergétique connue sous le nom de thermogenèse sans frisson (NST), qui implique à la fois des mécanismes dépendants de la protéine de découplage mitochondrial 1 (UCP1) et indépendants de l’UCP1 1,2,3,4,5. Ces caractéristiques distinctives impliquent la MTD dans la régulation du métabolisme systémique et la pathogenèse des maladies métaboliques, notamment l’obésité, le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires et la cachexie cancéreuse 6,7,8. Des études rétrospectives récentes ont montré une association inverse entre la masse MTD et/ou son activité métabolique avec l’obésité, l’hyperglycémie et la santé cardiométabolique chez l’homme 9,10,11.

Récemment, la MTD a été proposée comme un puits métabolique responsable du maintien de la NST, car elle nécessite des quantités substantielles de nutriments circulants comme carburant thermogénique 6,7. De plus, la MTD peut générer et libérer des facteurs bioactifs, appelés adipokines brunes ou BATokines, qui agissent comme des signaux endocriniens et/ou paracrines, indiquant son implication active dans l’homéostasie métabolique au niveau des systèmes 12,13,14,15. Par conséquent, la compréhension du métabolisme des nutriments de la MTD devrait améliorer notre compréhension de sa signification physiopathologique chez l’homme, au-delà de son rôle conventionnel en tant qu’organe thermorégulateur.

Des études métabolomiques utilisant des traceurs d’isotopes stables, en combinaison avec des études classiques d’absorption des nutriments utilisant des radiotraceurs non métabolisables, ont considérablement amélioré notre compréhension des nutriments qui sont préférentiellement absorbés par les MTD et de la manière dont ils sont utilisés 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Par exemple, des études de traceurs radioactifs ont démontré que les MTD activés par le froid absorbent le glucose, les acides gras liés aux lipoprotéines et les acides aminés à chaîne ramifiée 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Le traçage isotopique récent combiné à des études métabolomiques nous a permis de mesurer le devenir métabolique et le flux de ces nutriments dans les tissus et les cellules en culture 24,25,26,28,29,30. Cependant, ces analyses se concentrent principalement sur l’utilisation individuelle des nutriments, ce qui nous laisse avec une connaissance limitée des rôles systémiques des MTD dans l’échange de métabolites organiques. Les questions concernant la série spécifique de nutriments circulants consommés par les MTD et leurs contributions quantitatives en termes de carbone et d’azote restent insaisissables. De plus, l’exploration de la capacité de la MTD à générer et à libérer des BATokines dérivées de métabolites (par exemple, des lipokines) à l’aide de nutriments ne fait que commencer 12,13,14,15,31,32.

L’analyse sanguine artérioveineuse est une approche physiologique classique utilisée pour évaluer l’absorption ou la libération spécifique de molécules circulantes dans les organes/tissus. Cette technique a déjà été appliquée à la MTD interscapulaire de rats pour mesurer l’oxygène et plusieurs métabolites, établissant ainsi la MTD comme le site majeur de la thermogenèse adaptative avec son potentiel catabolique 33,34,35,36,37. Récemment, une étude artérioveineuse utilisant la MTD interscapulaire de rat a été couplée à une approche transomique, conduisant à l’identification de BATokines non découvertes libérées par la MTD38 stimulée thermiquement.

Les progrès récents de la métabolomique basée sur la chromatographie en phase gazeuse à haute sensibilité et la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (GC-MS et LC-MS) ont ravivé l’intérêt pour les études artérioveineuses pour l’analyse quantitative de l’échange de métabolites spécifiques à un organe 39,40,41. Ces techniques, avec leur pouvoir de résolution élevé et leur précision de masse, permettent l’analyse complète d’une large gamme de métabolites à partir de petites quantités d’échantillons.

Dans le cadre de ces avancées, une étude récente a réussi à adapter la métabolomique artérioveineuse à l’étude de la MTD au niveau de la souris, permettant l’analyse quantitative des activités d’échange de métabolites dans la MTD dans différentes conditions42. Cet article présente un protocole de métabolomique artérioveineuse ciblant les MTD en utilisant la GC-MS dans un modèle murin C57BL/6J.

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Protocol

Toutes les expériences ont été menées avec l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Sungkyunkwan (IACUC). Les souris ont été hébergées dans une animalerie approuvée par l’IACUC, située dans une salle blanche réglée à 22 °C et 45 % d’humidité, après un cycle jour/lumière de 12 heures. Ils ont été gardés dans des racks ventilés et ont eu accès à un régime alimentaire standard ad libitum (comprenant 60 % de glucides, 16 % de protéines et 3 % de matières grasses). La litière et le matériel de nidification ont été changés chaque semaine. Pour cette étude, des souris mâles C57BL/6J âgées de 12 semaines et pesant entre 25 g et 30 g ont été utilisées. Ces animaux provenaient d’un fournisseur commercial (voir le tableau des matériaux).

1. Modulation de l’activité métabolique du tissu adipeux brun par acclimatation à la température et stimulation pharmacologique

REMARQUE : L’acclimatation à la température sur plusieurs jours ou semaines ou la stimulation pharmacologique à l’aide d’agonistes des récepteurs β-adrénergiques sont des méthodes couramment utilisées pour moduler l’activité des MTD1. Par conséquent, un aperçu concis de la méthode est fourni ci-dessous pour permettre aux lecteurs de choisir l’approche appropriée selon les besoins. Pour obtenir une MTD métaboliquement inactive (moins thermogénique), une température chaude de base, appelée thermoneutralité (28-30 °C), est sélectionnée pour les souris C57BL/6J. Cette plage garantit que les souris n’ont pas besoin de dépenser de l’énergie supplémentaire pour maintenir une température corporelle constante. Pour obtenir des MTD métaboliquement modestes ou très actives (thermogéniques), il est possible de choisir des températures froides douces (20-22 °C) ou très froides (6 °C). Pour les besoins de cette expérience, des souris ont été élevées dans des conditions de logement standard à 22 °C, qui, bien que légèrement froides pour les souris, n’ont impliqué aucune stimulation pharmacologique.

  1. Acclimatation à la température
    1. Séparez les souris pour qu’elles abritent 1 ou 2 souris par cage au moins 1 semaine avant le début de l’acclimatation à la température. Préparez des incubateurs de rongeurs équipés d’un système de ventilation de l’air, de contrôle de la température et de l’humidité dans les conditions souhaitées.
    2. Déplacez les cages dans leurs incubateurs de rongeurs respectifs aux jours appropriés pour le type d’acclimatation à la température choisi.
    3. Assurez-vous que la répartition du nombre de souris est égale dans tous les groupes, avec 1 ou 2 souris par cage. Le logement individuel est préféré car il est plus sensible aux changements physiologiques induits par la température que le logement de groupe43. Voici les conditions d’hébergement spécifiques à chaque groupe :
      1. Groupe de thermoneutralité (30 °C) : Maintenez les souris de ce groupe en continu à une température de 30 °C pendant quatre semaines maximum.
      2. Groupe de froid sévère : Dans un premier temps, logez les souris de ce groupe à 18 °C sans aucun matériel de nidification. Ils connaîtront une diminution progressive de la température hebdomadaire, atteignant 6 °C à la quatrième semaine. La progression de la température est la suivante : 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
      3. Groupe à froid doux (20-22 °C) : Hébergez les souris de ce groupe dans des incubateurs pour rongeurs dans les mêmes conditions que les conditions de logement standard mentionnées précédemment.
      4. Défis de froid aigu : Pour les défis de froid aigu, placez 1 à 2 souris par cage sans aucun matériel de nidification et exposez-les à un incubateur de rongeurs réglé à 6 °C pendant 8 h maximum.
        REMARQUE : Ces conditions de logement et les variations de température sont essentielles pour étudier les effets de différents environnements de température sur l’activité et le métabolisme des MTD.
    4. Changez les cages et faites le plein de nourriture et d’eau chaque semaine. Pré-acclimater les cages au moins 24 h avant la supplémentation, à leur température respective (incubateur de rongeurs).
      REMARQUE : Pour éviter de perturber le stimulus de température approprié, il est important de ne pas fournir d’enrichissements de souris qui pourraient conduire à la construction de nids. En réponse à un froid intense, les souris dépensent plus d’énergie pour maintenir la température corporelle, ce qui entraîne une augmentation de l’apport alimentaire et des taux d’excrétion plus élevés. Par conséquent, il est crucial de vérifier les cages au moins deux à trois fois par semaine (en suivant les directives institutionnelles locales) pour s’assurer que les souris disposent d’un approvisionnement suffisant en nourriture et en eau, et que les cages ne sont pas excessivement humides. Cette surveillance est essentielle pour maintenir le bien-être et la santé des souris pendant l’étude.
  2. Stimulation pharmacologique1 à l’aide de l’agoniste des récepteurs β3-adrénergiques CL316,243
    1. Pour maximiser l’effet stimulant, pré-logez les souris à la thermoneutralité (30 °C) pendant 2 à 4 semaines avant les injections.
    2. Après la période d’acclimatation, injecter par voie intrapéritonéale 1 mg/kg CL316,243.
      REMARQUE : Pour la stimulation chronique avec l’agoniste des récepteurs β3-adrénergiques (par exemple de 3 jours à la semaine 1,44,45), des injections quotidiennes sont nécessaires en raison de la stabilité du médicament. Le CL316,243 dilué doit être préparé le jour de l’injection en raison de sa stabilité.

2. Prélèvement sanguin artérioveineux

REMARQUE : Les souris de plus de 12 à 14 semaines sont recommandées pour les prélèvements sanguins artérioveineux. Les souris plus jeunes peuvent ne pas avoir des veines de Sulzer suffisamment dimensionnées, un vaisseau sanguin distinct qui draine spécifiquement le sang veineux de l’interscapulaire BAT46.

  1. Anesthésiez doucement à l’aide du vaporisateur calibré avec 3 % d’isoflurane pour l’induction (dans une chambre de 205 x 265 x 200 mm) et 2 % d’isoflurane pour l’entretien (avec un masque d’anesthésie gazeuse).
    REMARQUE : L’ensemble de la procédure de prélèvement sanguin artérioveineux doit être effectué rapidement après l’anesthésie. Un coussin chauffant chauffé à l’eau peut être utilisé pendant l’anesthésie pour maintenir la température corporelle centrale.
    ATTENTION : L’isoflurane est très volatil et toxique lorsqu’il est inhalé. Par conséquent, l’anesthésie primaire doit être effectuée sous une hotte.
  2. Vérifiez les réflexes de l’animal, comme la rétraction de la patte, pour confirmer que l’anesthésie a atteint une profondeur appropriée.
  3. Collecte de sang veineux dans la veine de Sulzer
    1. Positionnez la souris de manière à exposer la peau dorsale, confirmez la profondeur de l’anesthésie par un pincement des orteils juste avant de faire l’incision. Humidifiez la peau dorsale avec suffisamment d’éthanol à 70 % pour éviter le décollement des poils et faites une incision le long du dos de la partie inférieure du thorax jusqu’au cou.
      REMARQUE : La MTD interscapulaire est située juste sous la peau, composée de deux coussinets adipeux recouverts de minces tissus adipeux blancs. Il est important de s’assurer que la souris reste sous anesthésie à travers le masque d’anesthésie gazeuse.
    2. Soulevez doucement la MTD interscapulaire à l’aide d’une pince à pointe pliée et coupez soigneusement les tissus attachés, dont la plupart sont des muscles. Soulevez le coussinet adipeux vers la tête, continuez à couper les tissus attachés et ouvrez soigneusement la région jusqu’à ce que la veine de Sulzer (un grand vaisseau rouge foncé en forme de « Y » relié aux deux coussinets adipeux de la MTD interscapulaire) soit exposée.
      REMARQUE : Veillez à ne pas couper les vaisseaux capillaires des tissus musculaires qui sont connectés à la région frontale et latérale de la MTD interscapulaire, car cela réduirait considérablement la quantité et la qualité du sang qui s’écoule de la veine de Sulzer.
    3. Coupez soigneusement la veine de Sulzer et prélevez environ 40 μL de sang à l’aide d’embouts de pipette de 200 μL et d’une pipette P100. Conservez le sang dans un tube de prélèvement sanguin et conservez le tube sur de la glace jusqu’au processus de prélèvement de sérum.
      REMARQUE : Il est important de prélever du sang juste en dessous du point de division en forme de Y de la veine de Sulzer, afin d’éviter la contamination du sang par la veine cave supérieure47. Recueillir trop de sang diminuera les caractéristiques de la veine de Sulzer. Ainsi, assurez-vous de prélever la quantité minimale de sang nécessaire dans la veine de Sulzer pour l’analyse. Soyez prudent lors de la sélection des tubes de prélèvement sanguin, car le sérum et le plasma donnent des profils de métabolites différents 48,49,50. Pour le prélèvement de plasma, il est nécessaire d’utiliser des tubes recouverts d’héparine. Dans cette expérience, des tubes recouverts d’un activateur de coagulation ont été choisis pour obtenir le sérum. En aucun cas, des tubes revêtus d’EDTA ne doivent être utilisés, car l’EDTA a un impact significatif sur les signaux de spectrométrie de masse51,52.
  4. Collecte de sang artériel dans le ventricule gauche
    1. Retournez la souris sans perdre le contact avec le cône nasal, pour exposer la peau ventrale. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par un pincement de l’orteil avant de faire l’incision. Humidifiez la peau ventrale avec une quantité suffisante d’éthanol à 70 % pour éviter le décollement des poils, et ouvrez soigneusement la cavité thoracique avec des ciseaux pour exposer le cœur sans endommager la structure interne.
    2. Ponctionner avec précision la zone apex du ventricule gauche à l’aide d’une seringue de 1 ml munie d’une aiguille de 29 G (1/2 po). Insérez les deux tiers d’une aiguille de 1/2 po à une distance de 3 à 5 mm à l’horizontale droite de l’apex du cœur (Figure 1B) et tirez la seringue vers l’arrière pour recueillir le sang du ventricule gauche (50 à 100 μL). Le sang du ventricule gauche est du sang artériel oxygéné qui est rouge vif. Conservez le sang dans un tube de prélèvement sanguin et conservez le tube sur de la glace jusqu’au processus de prélèvement de sérum.
      REMARQUE : Une incision minimale doit être pratiquée dans la cavité thoracique pour accéder au cœur. Une incision excessive peut entraîner des saignements locaux, qui peuvent par la suite entraîner une pression artérielle basse. Cela pourrait affecter la qualité du sang artériel recueilli dans le ventricule gauche. Évitez de faire pivoter ou de retourner le cœur, car il sera difficile de déterminer la position précise du ventricule gauche.
    3. Pratiquer l’euthanasie et l’assurer avec une méthode appropriée en suivant les directives des institutions locales. Par exemple, l’euthanasie peut être pratiquée par luxation cervicale et confirmée par l’arrêt des battements cardiaques.
  5. Centrifuger des échantillons de sang à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Prélever délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette. Le surnageant doit contenir du sérum ou du plasma, selon le type de tube de prélèvement sanguin utilisé. On peut s’arrêter ici et stocker les échantillons à -20 °C jusqu’au traitement du sérum pour l’analyse GC-MS.
    REMARQUE : Une hémolyse peut s’être produite si un surnageant de couleur rouge est observé. Pour éviter l’hémolyse, faites vortex l’échantillon avant la fin de la coagulation. Certains métabolites enrichis en globules rouges, notamment la glutamine et le lactate, pourraient entraîner une mauvaise interprétation des données, bien que la plupart des métabolites ne soient pas affectés de manière significative par l’hémolyse. Il est recommandé d’analyser le sérum/plasma dans un délai d’une semaine.

3. Extraction des métabolites à partir du sérum et de la dérivation chimique

  1. Préparation à l’extraction
    NOTE : Toutes les méthodes, y compris l’extraction des métabolites, la dérivation et l’analyse des données, sont des versions légèrement modifiées des méthodes décrites précédemment53,54.
    1. Préparer le tampon d’extraction en ajoutant une solution de 100 μM de DL-norvaline, étalon interne (voir le tableau des matériaux), au méthanol de qualité MS.
    2. S’assurer que toutes les procédures expérimentales sont effectuées sur la glace.
  2. Transférez 10 μL de sérum de souris extrait de la veine de Sulzer ou du ventricule gauche dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 40 μL de tampon d’extraction.
  3. Pour éliminer les débris cellulaires et les protéines, faites un bref vortex dans les échantillons de sérum, puis centrifugez à la vitesse maximale (18 000 x g) pendant 30 minutes à 4 °C.
  4. Après centrifugation, transférer délicatement 40 μL de surnageant dans un flacon en verre suivi de 3 h de séchage dans une centrifugeuse sous vide à 4 °C.
    REMARQUE : Un insert en verre (voir le tableau des matériaux) est recommandé au lieu de tubes en plastique en raison des produits chimiques réactifs au plastique utilisés tout au long de l’étape de dérivation suivante.
  5. Soumettre les échantillons séchés à deux étapes consécutives de dérivatisation pour l’analyse GC-MS des métabolites sériques.
    REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées sous une hotte en raison des risques d’irritation des solvants.
    1. Remettre en suspension les extraits de sérum séché dans 30 μL de chlorhydrate de méthoxyamine à 10 mg/mL (voir tableau des matériaux) dissous dans de la pyridine et incuber à 37 °C pendant 30 min.
    2. Dérivation d’échantillons pour la silylation des métabolites avec 70 μL de N-méthyl-N-tert-butyldiméthylsilylrifluoroacétamide (MTBSTFA, voir Tableau des matériaux) à 70 °C pendant 1 h.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser une seringue en verre plutôt qu’un embout en plastique dans les étapes suivantes en raison des solvants de dérivation qui réagissent avec le plastique.

4. Analyse métabolomique par GC-MS

NOTA : La GC-MS quadruple simple (voir le tableau des matériaux) a été utilisée pour mesurer les divers métabolites sériques, y compris les glucides, les acides aminés et les intermédiaires du cycle du TCA, dans des échantillons dérivatisés de la veine de Sulzer et du ventricule gauche. D’autres colonnes peuvent également être utilisées, bien que les paramètres expérimentaux, y compris le programme de température, puissent varier en fonction des types de colonnes utilisés.

  1. Injecter 1 μL de l’échantillon dérivé dans le GC en mode splitless à 280 °C (température d’entrée), en utilisant l’hélium comme gaz vecteur avec un débit de 1.500 mL/min (point de consigne).
  2. Réglez le quadripôle à 200 °C avec l’interface GC-MS à 300 °C.
    REMARQUE : Le programme de l’étuve pour toutes les analyses de métabolites commence à 60 °C, est maintenu pendant 1 min, puis est augmenté à un taux de 10 °C / min jusqu’à ce que la température atteigne 320 °C.
  3. Collectez des données par ionisation électronique (EI) réglée à 70 eV et acquérez les données de l’échantillon en mode balayage (50-550 m/z)53. Tous les métabolites utilisés dans cette étude ont été préalablement validés à l’aide d’étalons pour confirmer les spectres de masse et les temps de rétention.
  4. Effectuez l’intégration de la zone de pointe à l’aide d’un logiciel d’analyse disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
  5. Faites correspondre les composés avec l’ion produit de chaque dérivé de TBMDS. Ensuite, obtenez le chromatogramme d’ions d’extraction (EIC) en intégrant la valeur m/z de l’ion fragment dans la zone de pic correspondante, puis exportez-le. Les ions fragments sont indiqués dans le tableau 1.
    NOTA : L’EIC de chaque composé a été normalisé par celui de la DL-norvaline dans chaque échantillon. Les données sont représentées par Log2 de la veine de Sulzer jusqu’au ventricule gauche (Log2(SV/LV)) en utilisant chaque valeur EIC normalisée.

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Representative Results

La figure 1 illustre le schéma expérimental de la métabolomique AV optimisée pour les MTD. Comme mentionné dans la section Protocole, pour obtenir des tissus adipeux bruns stimulés de manière différentielle, les souris subissent une acclimatation à la température à l’aide d’incubateurs pour rongeurs ou reçoivent une administration pharmacologique telle que des agonistes des récepteurs β-adrénergiques. Par la suite, les souris sont anesthésiées et des échantillons de sang sont prélevés pour une analyse métabolomique (Figure 1A). Pour les prélèvements sanguins, le sang veineux qui s’écoule spécifiquement de la MTD interscapulaire est recueilli par la veine de Sulzer, tandis que le sang artériel est directement recueilli dans le ventricule gauche du cœur (Figure 1B).

La figure 2 représente les schémas de la métabolomique sérique à l’aide de la GC-MS (Figure 2). Brièvement, la solution de méthanol est ajoutée aux échantillons de sérum, suivie d’une centrifugation pour éliminer les protéines sériques. Le surnageant contenant les métabolites a été séché dans un SpeedVac et les échantillons séchés ont été soumis à une dérivation en deux étapes à l’aide de méthoxyamine (MOX) et de MTBSTFA (N-tert-butyldiméthylsilyl-N-méthyltrifluoroacétamide). L’étape de dérivation vise à remplacer les groupes fonctionnels polaires des métabolites par l’ester TBDMS, permettant la détection GC-MS des métabolites en tant que dérivés TBDMS. Les échantillons dérivatisés ont été analysés à l’aide d’une simple quadruple GC-MS. Les métabolites sont séparés dans la colonne en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. L’ionisation électronique (EI) est utilisée pour décomposer les métabolites en ions fragmentaires uniques détectés par un détecteur de masse. L’identification des composés est effectuée par la détection d’ions de fragments spécifiques aux composés. La valeur m/z et le temps de rétention des ions de fragments spécifiques au composé dans l’expérience sont indiqués dans le tableau (tableau 1). Un chromatogramme ionique extrait (EIC) est utilisé pour intégrer le signal d’un ion fragment spécifique au composé dans la zone de crête du métabolite, qui définit l’abondance des métabolites.

Pour déterminer si la MTD libère ou absorbe une série de métabolites, il est possible de calculer les rapports Log2 du nombre d’ions entre la veine de Sulzer et le ventricule gauche (Log2(SV/LV)) (Figure 3). Si la valeur de Log2 (SV/LV) pour un métabolite particulier est de >0, cela indique que le métabolite est plus abondant dans le SV que dans le LV, ce qui suggère que le filet de MTD interscapulaire libère le métabolite. Inversement, si la valeur de Log2(SV/LV) pour un certain métabolite est de <0, cela suggère que le métabolite est absorbé par la MTD interscapulaire.

À l’aide de cette approche, il a été constaté que la MTD légère stimulée par le froid consomme de manière significative du glucose, du lactate, du 3-hydroxybutyrate (3-HB), des BCAA, de l’aspartate, de la lysine et du tryptophane, tandis que la MTD libère de manière significative du succinate et du palmitate (Figure 3A). La plupart de ces phénomènes ont été observés dans nos études précédentes sur la MTD42 froide chronique, ce qui suggère que la MTD froide légère ressemble métaboliquement à la MTD froide chronique, bien que dans une moindre mesure. Pour donner un aperçu visuel rapide des données, une carte thermique affichant les valeurs Log2 (SV/LV) est représentée (figure 3B). Il est essentiel d’interpréter les données avec prudence, car la carte thermique représente les scores Z au sein du groupe.

Figure 1
Figure 1 : Schéma expérimental de la métabolomique artérioveineuse (AV) optimisée pour les MTD. (A) Schéma montrant le flux de travail de la métabolomique AV. (1) Pour induire différentes versions de tissu adipeux brun (MTD) stimulé métaboliquement, les souris sont acclimatées à différentes températures ou reçoivent des injections de médicaments pharmacologiques. (2) Par la suite, les échantillons de sang artériel et veineux sont prélevés respectivement dans le ventricule gauche et dans la veine de Sulzer des souris. (3) Les échantillons de sérum obtenus sont soumis à l’extraction des métabolites, suivie d’une analyse métabolomique. (B) Images représentatives fournissant des conseils pour les procédures de prélèvement sanguin. Le sang artériel est collecté dans le ventricule gauche, tandis que le sang veineux est obtenu à partir de la veine de Sulzer car il draine spécifiquement le sang des MTD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Métabolomique ciblée basée sur la GC/MS. Schéma expérimental de métabolomique ciblée basée sur la GC/MS. TBDMS : tert-butyldiméthylsilyle, EI : ionisation électronique, EIC : chromatogramme d’extraction ionique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Données métabolomiques représentatives de l’AV. (A) L’absorption et la libération subséquente de certains métabolites de carburant circulants répandus et très actifs par les MTD, classés en fonction de leurs groupes respectifs. Les données montrent les rapports veine/ventricule gauche (SV/VG) de Log2 de Sulzer. Les barres indiquant les métabolites avec une moyenne de Log2 (SV/LV) <0 sont colorées en rouge et Log2 (SV/LV) >0 sont colorées en bleu. Les points de données individuels représentent chaque souris ; n = 11. Les données sont moyennes ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Les BCAA ; acide aminé à chaîne ramifiée ; CEA; acide aminé essentiel ; NEAA ; acide aminé non essentiel. (B) Une carte thermique illustrant l’abondance différentielle des métabolites entre le sang de la veine de Sulzer (SV) et celui du ventricule gauche (LV). Chaque colonne affiche un score Z des valeurs moyennes au sein du groupe ; n = 11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composé m/z d’ions Fragment Durée de conservation Formulaire Formule dérivée TBDMS
Pyruvate 174.1 8.72 C3H4O3 C15H33O3NSi2
Aspartate 418.2 18.45 C4H7NO4 C22H49NO4Si3
α-cétoglutarate 346.2 17.27 C5H6O5 C18H37NO5Si2
C16 :0 (palmitate) 313.3 19.72 C16H32O2 C22H46O2Si
Lactate 261.2 11.66 C3H6O3 C15H34O3Si2
Leucine 200.2 14 C6H13NO2 C18H41NO2Si2
Isoleucine 200.2 14.34 C6H13NO2 C18H41NO2Si2
Valine 186.2 13.53 C5H11NO2 C17H39NO2Si2
Alanine 260.2 12.17 C3H7NO2 C15H35NO2Si2
Sérine 390.2 17.04 C3H7NO3 C21H49NO3Si3
Glycine 218.1 12.43 C2H5NO2 C14H33NO2Si2
Lysine 300.2 20.48 C6H14N2O2 C24H56N2O2Si3
Succinate 289.1 14.65 C4H6O4 C16H34O4Si2
Proline 258.2 14.73 C5H9NO2 C17H37NO2Si2
Phénylalanine 336.2 18 C9H11NO2 C21H39NO2Si2
Méthionine 320.2 16.84 C5H11NO2S C17H39NO2SSi2
Cystéine 406.2 19 C3H7NO2S C21H49NO2SSi3
Asparagine 417.2 19.86 C4H8N2O3 C22H50N2O3Si3
3-hydroxybutyrate (3HB) 275.2 12.81 C4H8O3 C16H36O3Si2
Tryptophane 375.2 22.97 C11H12N2O2 C23H40N2O2Si2
Malate 419.2 18.19 C4H6O5 C22H48O5Si3
Glutamate 432.3 19.59 C5H9NO4 C23H51NO4Si3
Glutamine 431.3 20.85 C5H10N2O3 C23H52N2O3Si3
Citrate 459.2 22.38 C6H8O7 C30H64O7Si4
Glucose 476.3 22.7 C6H12O6 C30H68O6Si4

Tableau 1 : Ions de fragments composés GC/MS utilisés pour l’intégration. Ce tableau contient une liste de 25 métabolites sériques identifiés dans la présente méthode, avec le temps de rétention et les ions fragmentaires correspondant à chaque composé.

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Discussion

Une étape essentielle pour comprendre le potentiel métabolique de la MTD dans l’équilibre énergétique de l’ensemble du corps consiste à définir les nutriments qu’elle consomme, comment ils sont métaboliques et quels métabolites sont libérés dans la circulation. Ce protocole introduit une technique spécialisée de prélèvement artérioveineux qui permet d’accéder à la vascularisation veineuse de la MTD interscapulaire et à la vascularisation artérielle systémique chez les souris C57BL/6J, qui a été récemment développée et validée par Park et al42. Vous trouverez ci-dessous les points clés que vous devez prendre en compte lors du suivi du protocole.

Pour la stimulation thermogénique, il est essentiel de choisir le type de stimulation thermogénique le plus approprié pour votre environnement expérimental. Par exemple, lors de l’utilisation d’un groupe expérimental (par rapport au groupe témoin) et visant à observer des différences dans la capacité d’adaptation métabolique (cruciale pour son potentiel thermogénique maximal sans frisson) de la MTD, l’acclimatation chronique au froid ou la stimulation des récepteurs β-adrénergiques (d’une durée supérieure à 3 jours à 4 semaines) convient 1,45. Lorsque la MTD est exposée à une exposition aiguë au froid (quelques heures moins de 24 h), plutôt que de s’adapter métaboliquement, la MTD métabolise ses carburants intrinsèquement stockés et communique métaboliquement avec les muscles frissonnants pour une thermogenèse optimale1. Un agoniste des récepteurs β-adrénergiques représente une réponse neuronale pour déclencher la thermogenèse BAT 1,14, et il existe d’autres facteurs endocriniens qui améliorent le programme thermogénique 55,56,57,58,59,60. Lors de l’exécution d’une stimulation thermogénique comme mentionné ci-dessus, il devrait être utile d’avoir un contrôle de base à la thermoneutralité (30 °C) pour confirmer si la stimulation a fonctionné correctement.

Comme mentionné dans la section sur le protocole, l’obtention de sang artérioveineux de la plus haute qualité est essentielle pour déterminer la réussite de l’établissement. Pour y parvenir, il est essentiel de prévenir l’hémolyse (voir étape 2.5) et de prélever une quantité constante de sang pour éviter la dilution des caractéristiques distinctes du sang veineux de la veine de Sulzer (moins de 40 μL de la veine de Sulzer). À cette fin, lors de la mise en place initiale, les auteurs recommandent fortement de réaliser une expérience pilote pour la mesure des métabolites en utilisant non seulement le sang de la veine de Sulzer, mais aussi le sang du sang veineux drainant non BAT (par exemple, la veine cave inférieure). Cela aidera à confirmer si le sérum de la veine de Sulzer révèle un profil métabolitique distinct par rapport aux vaisseaux veineux non BAT. En ce qui concerne le prélèvement sanguin artériel dans le ventricule gauche, il est important de ponctionner systématiquement la même zone du ventricule gauche afin de minimiser les variations des niveaux de cardiokines61,62. De telles variations pourraient donner des résultats déroutants en métabolomique artérioveineuse ou en protéomique.

La chromatographie couplée à la spectrométrie de masse est l’un des outils les plus puissants pour la métabolomique, l’une des méthodes étant GC-MS63. En effet, la mesure des métabolites biologiquement pertinents à l’aide de la GC-MS a été considérée comme difficile en raison du problème de couverture ; L’application de la GC-MS est généralement limitée à l’analyse de métabolites ayant des propriétés hautement volatiles et non polaires, par opposition aux nombreux métabolites polaires dans les tissus et les fluides biologiques. Cependant, le développement de diverses méthodes d’extraction et de dérivation, ainsi que les avantages de la GC-MS, notamment une excellente résolution des pics, la reproductibilité et de vastes bibliothèques spectrales de masse permettant une identification pratique des pics, ont conduit à une telle plate-forme comme une option attrayante pour l’analyse des métabolites biologiquement pertinents64,65.

Dans ce protocole, la plateforme GC-MS est utilisée pour l’analyse de 25 métabolites dans le sérum prélevé à l’aide de la technique susmentionnée. À cette fin, l’extraction des métabolites a été réalisée à l’aide d’une solution de méthanol à 80 %. Il convient de noter qu’au cours de cette étape, il est recommandé d’utiliser certains types de tubes, y compris les tubes d’Eppendorf, afin d’obtenir les niveaux les plus bas de contamination par des substances organiques dans les échantillons. Une séparation soigneuse du surnageant des pastilles après l’extraction est également nécessaire pour éliminer les débris protéiques du sérum, ce qui est essentiel pour le maintien des performances de la source d’ions MS.

L’étape de dérivatisation peut être diversifiée en fonction des types de dérivation, y compris les dérivés aryles, la silylation et l’acylation66. Les auteurs ont utilisé la dérivation en deux étapes avec le N-méthyl-N-tert-butyldiméthylsilylrifluoroacétamide (MTBSTFA) pour la sialylation des métabolites, qui est une méthode couramment utilisée avec l’avantage d’une détection stable des métabolites polaires biologiquement pertinents, y compris les sucres, mais avec un inconvénient concernant la perte occasionnelle du groupe N-triméthylsilyle des amines et des acides aminés au cours de l’étaped’analyse 64. Il convient de noter que les échantillons doivent être complètement séchés avant l’étape de dérivation, en raison de la sensibilité à l’humidité des réactifs et des dérivés.

L’une des principales limites de l’analyse GC, en général, se résume toujours à la gamme de métabolites détectables malgré les étapes de dérivation susmentionnées qui améliorent la capacité GC-MS en ce qui concerne la détection des métabolites polaires, en particulier par rapport à l’analyse basée sur LC-MS. La métabolomique quantitative à l’aide de la LC-MS peut grandement aider à mieux comprendre le spectre métabolique des MTD en ce qui concerne l’échange systémique de métabolites24,42.

Bien que le calcul utilisé dans le protocole-mesure du gradient de concentration de métabolites entre l’artère et l’artériel. sang veineux ; Log2(SV/LV) - quantifie l’absorption fractionnaire et le changement de libération par la MTD, la prudence est nécessaire pour l’interprétation des données. En particulier, pour les métabolites dont la valeur d’échange nette fractionnaire est de « 0 » (par exemple, le citrate, le αKG, le malate, la méthionine, l’alanine, la glutamine), le résultat pourrait être attribué soit à l’absence d’absorption/libération, soit à un catabolisme et à une synthèse tout aussi actifs (où l’absorption et la libération sont élevées). Pour vérifier laquelle des deux possibilités est correcte, des expériences supplémentaires de flux métabolique utilisant le traçage isotopique in vivo avec le métabolite absorbé et/ou son substrat sont nécessaires39.

La limite du calcul fractionnaire est qu’il ne fournit pas le paysage quantitatif de l’absorption et de la libération de ces métabolites42,67. Par exemple, bien que la valeur de Log2 (SV/LV) indique une absorption nette relative comparable entre le glucose et le 3-hydroxybutyrate (3HB), la contribution réelle du glucose aux sources de carbone devrait être beaucoup plus élevée que celle du 3-HB en raison du fait que la concentration sanguine de glucose est beaucoup plus élevée que celle du 3HB, et parce que le glucose contient quatre carbones de plus (le glucose a six carbones ; 3HB a deux carbones). Si nécessaire, une analyse complète intégrant des paramètres supplémentaires, tels que le débit sanguin, les concentrations sanguines réelles de chaque métabolite et leurs équations chimiques, devrait nous renseigner sur les contributions quantitatives des métabolites absorbés/libérés et leurs contributions dans le flux total de carbone ou d’azote42,67.

Un avantage majeur de cette méthodologie miniaturisée pour le prélèvement de sang artérioveineux et l’analyse métabolomique au niveau de la souris est sa combinaison synergique avec divers modèles génétiques pour étudier le métabolisme et la physiologie du tissu adipeux brun (par exemple, UCP1-KO, UCP1-Cre modèles de perte de fonction spécifiques à la BAT, modèles transgéniques). L’analyse métabolomique récente, qui ne nécessite que des traces de sérum pour le profilage métabolomique, rend cette approche plus réalisable avec des organismes plus petits (voir protocole 3)39. Cependant, l’analyse protéomique, qui peut fournir de meilleures informations lorsqu’elle est considérée avec la métabolomique, peut nécessiter de plus grandes quantités d’échantillons. À cet égard, un prélèvement artérioveineux conventionnel sur des rats peut être plus approprié. Nous renvoyons les lecteurs au protocole le plus récent pour le prélèvement de sang artérioveineux pour la MTD chez le rat, écrit par Mestres-Arenas et ses collègues47.

Bien que le protocole actuel adopte la procédure d’anesthésie à l’isoflurane telle que décrite dans Park et al.42, cette approche peut avoir un impact négatif sur le métabolisme thermogénique des adipocytes bruns et/ou du tissu adipeux brun in vivo 68,69,70,71. Par conséquent, la métabolomique artérioveineuse future utilisant le pentobarbital justifie une enquête.

En résumé, ce protocole fournit une méthodologie fondamentale pour mesurer l’activité métabolique nette spécifique aux MTD (consommation par rapport à la production) lors de diverses stimulations thermogéniques. Cela devrait nous donner des informations précieuses sur le rôle de la MTD en tant que puits de nutriments systémique ainsi qu’en tant que fournisseur en répertoriant quantitativement les principaux carburants métaboliques ainsi que les métabolites sécrétés. De plus, cela peut également être utile pour identifier des adipokines brunes dérivées de métabolites qui n’ont pas encore été étudiées, en particulier lorsqu’elles sont utilisées avec des plates-formes métabolomiques basées sur la découverte.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts à signaler.

Acknowledgments

Nous remercions tous les membres des laboratoires Choi et Jung pour la discussion méthodologique. Nous remercions C. Jang et D. Guertin pour leurs conseils et leurs commentaires. Nous remercions M.S. Choi pour sa lecture critique du manuscrit. Ces travaux ont été financés par NRF-2022R1C1C1012034 à S.M.J. ; NRF-2022R1C1C1007023 à D.W.C ; NRF-2022R1A4A3024551 à S.M.J. et D.W.C. Ce travail a été soutenu par l’Université nationale de Chungnam pour W.T.K. Figure 1 et Figure 2 ont été créées à l’aide de BioRender (http://biorender.com/).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 200 Tissu adipeux brun BAT Thermogenèse sans frisson Homéostasie métabolique Nutriments circulants Processus de dépense énergétique Facteurs bioactifs Carburants métaboliques Molécules de signalisation Communication intratissulaire Communication intertissulaire Métabolomique artérioveineuse BAT optimisée au niveau de la souris Stimulations thermogéniques Technique de prélèvement sanguin artérioveineux Veine de Sulzer Protocole métabolomique basé sur la chromatographie en phase gazeuse Échange de métabolites au niveau inter-organes
Métabolomique artérioveineuse pour mesurer l’échange de métabolites <em>in vivo</em> dans le tissu adipeux brun
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Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H.,… More

Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).

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