Summary
在这里,我们描述了一种用于大规模生产内体衍生纳米囊泡的磁分离辅助高速均质化方法,作为一种新型的外泌体模拟物 (EM),它们具有相同的生物学起源和相似的结构、形态和蛋白质组成天然细胞外囊泡 (EVs)。
Abstract
细胞外囊泡(EVs)在生理病理研究、疾病诊断和治疗中备受关注;然而,由于缺乏放大生产方法,它们的临床转化受到限制。因此,该协议为大规模生产内体衍生的纳米囊泡提供了一种磁分离辅助的高速均质化方法,作为一种源自内体的新型外泌体模拟物(EMs),其产率比传统的超速离心方法高出约100倍。在这种方法中,磁性纳米颗粒(MNPs)通过内吞作用被亲本细胞内化,随后在其内体中积累。然后,收集负载MNPs的内体,并通过低渗处理和磁分离进行纯化。使用高速均质器将负载MNP的内体分解成单分散的纳米囊泡。由此产生的内体衍生囊泡具有相同的生物起源和结构,其特征是纳米颗粒跟踪分析、透射电子显微镜和蛋白质印迹。它们的形态和蛋白质组成与天然 EV 相似,表明 EM 可能作为天然 EV 的低成本和高产量替代品,用于临床转化。
Introduction
细胞外囊泡 (EV) 是几乎所有细胞分泌的小囊泡,大小范围为 30-150 nm,含有丰富的生物活性物质。根据来源细胞的不同,EV 表现出高度异质性,具有亲本细胞特异性的多种成分1。EV 被释放到体液中并运输到远处,在那里它们被靶细胞吸收以发挥作用2,可用于递送用于组织修复、肿瘤诊断和治疗以及免疫调节的各种生物活性分子和药物 3,4。然而,体液中具有相似生物物理特性的其他生物纳米颗粒(例如脂蛋白)和纳米囊泡(例如,来自非内体途径的 EV)不可避免地会影响 EV 的分离和纯化。迄今为止,超速离心仍然是 EV 分离的金标准,并且已经开发了其他分离方法,包括蔗糖密度梯度离心、超滤、聚乙二醇沉淀、色谱和免疫磁珠分离5。目前限制 EV 疗法临床转化和商业化的瓶颈是严重缺乏能够实现 EV 高度可扩展和可重复分离的分离技术 6,7,8。传统的EV分离技术(如超速离心和尺寸排阻色谱)产量低(1 x 107-1 x 108/1 x 106个细胞)、生产周期长(24-48 h)、产品质量重现性差,需要昂贵且能源密集型的生产设备,无法满足目前对EV的临床需求6。
外泌体模拟物 (EM) 是天然电动汽车的合成替代品,由于它们在生产中的结构、功能和可扩展性高度相似,因此引起了人们的广泛关注。EM 的主要来源是连续切片的整个亲本细胞的直接挤出 9,10,显示出作为天然 EV 的强大生物学功能11,12。例如,源自人脐带间充质干细胞 (hUCMSCs) 的 EM 具有与天然 EV 相似的伤口愈合作用,并且蛋白质组成更丰富13。虽然来自全细胞的EM具有EV的生物学复杂性,但它们的主要缺点是产物的异质性,因为它们不可避免地受到各种细胞器和细胞碎片的污染。蛋白质定位分析进一步表明,源自全细胞挤出的 EM 含有许多来自线粒体和内质网的非 EVs 特异性蛋白质13。此外,大多数制造电磁镜的方法仍然需要超速离心,这是一个非常耗时和耗能的过程14。考虑到外泌体完全来源于细胞内体这一事实,我们假设与全细胞挤出方法产生的成熟细胞膜衍生的 EM 相比,生物工程内体衍生的纳米囊泡可能更好地概括外泌体和 EM 之间的生物学同源性14。然而,由于缺乏可行的方法,内体衍生的纳米囊泡的制造是困难的。
临床研究是利用EV作为无细胞疗法的替代品和用于治疗各种疾病的纳米级药物递送系统进行的。例如,源自骨髓间充质干细胞的 EV 已被用于治疗由 COVID-19 引起的严重肺炎,并取得了可喜的结果。最近,携带 CD24 蛋白的基因工程 EV 也显示出治疗 COVID-19 患者的有效治疗效果15,16。然而,由于产量低、成本低,传统分离方法仍无法满足EV治疗的临床需求。本研究报道了通过磁分离辅助高速均质化方法大规模生产内体衍生的纳米囊泡。它利用MNPs的内吞途径,通过磁分离分离MNP负载的内体,然后进行高速匀浆,将内体配制成单分散的纳米囊泡。由于该协议收集的内体类型多种多样,因此仍需要进一步深入研究以建立行业内的良好生产规范(GMP)。这种新颖的EM制备方法更省时(5分钟的高速均质化),以获得与天然EV同源的纳米囊泡。与超速离心相比,它从相同数量的细胞中产生更多的囊泡,超速离心通常可以应用于各种细胞类型。
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Protocol
注:该方法的示意图如 图1所示。
1. 电磁脉冲制备与隔离
- MNP的细胞内化
- 细胞培养
- 将 1 × 106 只大鼠骨髓间充质干细胞 (BMSC)、293T 细胞或小鼠卵巢上皮癌细胞 (ID8) 悬浮在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 5% 青霉素-链霉素溶液 (P/S) 的 DMEM 完全培养基中,溶于 2 mL 每 6 孔板(参见 材料表)。
- 将细胞在37°C和5%CO2下培养过夜。
注意:粘附后的细胞数约为 1 ×10 6。
- MNP的内吞作用
- 将每个六孔板的培养基体积减小至 1 mL。用浓度为100μg/ 1×106个细胞的10nm聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒(IONP)(参见材料表)共同培养细胞,并在37°C下在含有5%CO2的气氛中孵育12小时,以使细胞完全内吞IONPs。
- 细胞培养
- 内体的分离和均质化
- 细胞低渗治疗
- 用 0.5 mL/孔胰蛋白酶消化已完全内化 IONP 的细胞 3 分钟,并通过加入 1 mL/孔完全培养基终止消化。
- 以1000× g 离心5分钟,弃去上清液。将细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中并离心,重复两次以洗掉残留的培养基和未吸收的 IONP。
- 最后,将沉淀重悬于预先制备的低渗溶液(71.4mM氯化钾,1.3mM柠檬酸钠,pH 7.2-7.4)中15分钟(参见 材料表)。
- 通过低速均质化释放细胞器
- 将低渗溶液中的细胞悬浮液转移到玻璃试管中,并使用玻璃匀浆器(参见 材料表)以1000rpm的速度冲击20次释放细胞器。
- 磁分离以获得内体
- 将 1 mL 匀浆细胞溶液转移到 1.5 mL 微量离心管中,并置于磁性分离器中 1 小时,以将负载 IONP 的内体与其他细胞器(如细胞核和线粒体)和细胞碎片完全分离。
- 将棕色颗粒收集在磁架旁边的微量离心管的接触表面上(参见 材料表),即IONP负载的内体。丢弃微量离心管中的液体,加入 3 mL PBS 以重悬内体。
- 细胞低渗治疗
- 高速均质化
- 将含有内体的溶液转移到液体体积在 3-10 mL 之间的 15 mL 离心管中。
- 将高速均质机的 10 毫米探头(参见材料表)伸至离心管底部,不要接触底部。调整屏幕下方的速度按钮,将速度设置为 140 x g,调整时间按钮设置为 5 分钟的时间,然后按 OK 按钮。
- 按下 开始 按钮,在样品下方放置冰盒后进行均质化。
- 电磁场的磁性分选
- 将含有高速均质化获得的纳米囊泡的溶液转移到1.5mL微量离心管中,并将其置于磁选机中1小时。
- 收集含有所需 EM 的液体。小心不要触摸磁性框架旁边的管子表面,磁性框架吸附了游离的 IONP 和 IONP 负载的 EM。
2. EM表征(图2和图3)
- 动态光散射 (DLS) 分析
- 沿壁将 1 mL EMs 样品 (20 μg/mL) 注入比色皿中,并将其放入 DLS 仪器的仪器样品槽中(参见 材料表)。
- 打开DLS软件,选择 粒度测试,然后开始测试。
- 使用BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白质浓度(参见 材料表)。
- 纳米颗粒跟踪分析(NTA)
- 用PBS稀释EM至1×107-1×108 颗粒/mL的溶液,然后使用1mL注射器以500-1000μL/min的流速将其注入NTA仪器的腔室(参见 材料表)。
- 打开 488 个激光通道,确保软件界面中的 EM 数量在 100-300 个以内且呈布朗运动。
- 根据制造商的协议,选择合适的 SOP (EV-488) 以确保仪器的灵敏度适合 EM 检测。
- 透射电子显微镜(TEM)
- 用等体积的5%戊二醛固定EM(1mg / mL)30分钟,并通过BCA蛋白测定试剂盒将EM的浓度定量为1mg / mL。
- 将 10 μL 的 EM 滴在铜网的碳侧,并在 10 分钟后用滤纸从侧面去除多余的液体。加入 10 μL PBS 并立即用滤纸吸干。重复两次以去除多余的戊二醛。
- 滴入 5 μL 醋酸铀酰造影剂并负染色 1 分钟,然后去除多余的造影剂。用去离子水洗涤三次,并在室温 (RT) 下干燥。
- 在100 kV的加速电压下通过TEM记录图像。
- 蛋白质印迹
- 向样品中加入 100 μL 细胞裂解缓冲液和 5 μL 50 倍蛋白酶抑制剂混合物(参见 材料表)。用移液枪轻轻混合,放在冰上30分钟。
- 将溶液在4°C下以1000× g 离心10分钟,用BCA蛋白测定试剂盒定量上清液的蛋白质浓度,并收集。
- 将100μL上清液与25μL5x蛋白上样缓冲液混合,并在95°C下加热10分钟。
- 根据预制凝胶的说明制备凝胶。每孔加载15μg蛋白质,并在80 V下通过凝胶电泳运行,等待样品运行到分离凝胶,更改为100 V,然后将蛋白质转移到100 V的硝酸纤维素膜上,在冰浴下60分钟。
- 通过蛋白质印迹检测非 EV 特异性标志物 (Calnexin) 和 EV 生物标志物 (Annexin 和 CD63)(参见 材料表)。
注意:根据制造商的建议稀释抗体。
3. 体外EM 功能检测
- EM 标签
- 将 1 μL PKH26 与 250 μL 稀释剂 C (1:250) 混合,制成 2x 染色溶液(4 × 10-6 M)(参见 材料表)。
- 将 250 μL EM (1 mg/mL) 与 250 μL 2x 染色溶液混合,并用移液枪快速吹气。
- 在室温下孵育2-5分钟,同时轻轻倒置离心管。
- 加入等体积的血清或 1% 牛血清蛋白并孵育 1 分钟以终止消化。
- 用1000 KD超滤管以3000× g 超滤除去多余的PKH26 30分钟,并通过加入PBS重复三次。用PBS将剩余液体重悬至500μL,并通过0.22μm过滤器过滤。
- 细胞摄取检测
- 细胞接种:在含有10%FBS和5%P/S的1mLDMEM中,在35mm共聚焦培养皿中接种1个×10个6 个细胞,并在37°C和5%CO2 下孵育过夜。
- 用 0.22 μm 无菌针式过滤器过滤 EM 以去除潜在的污染。
- 用PKH26标记的EM(109 粒/ mL)处理细胞8小时。
- 用 PBS 洗涤 3 次,加入 DAPI (10 ng/mL),并在室温下孵育 10 分钟。
- 使用 405 nm 和 561 nm 激光通道在共聚焦激光扫描荧光显微镜中获取荧光图像(参见 材料表)。
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Representative Results
通过磁分离辅助高速均质制备EM的工作流程如 图1所示。细胞内化 10 nm 聚赖氨酸修饰的 IONP,其通过内吞作用特异性积累在内体中(图 3A)。在用低渗缓冲液处理并匀浆后,负载IONP的内体从细胞中释放出来,随后通过磁分离收集。通过高速均质化,分离的内体进一步重组为单分散纳米囊泡,也称为 EM。我们探索了多个关键参数(例如,均质化速度和时间),以确定优化的 EM 制备条件(图 2)。最后,通过考虑所生产电镜的粒径和产率,选择140 x g 的均质速度5 min作为优化条件。游离 IONP 和 IONP 负载的 EM 最终通过第二轮磁分离从最终产品溶液中去除,以获得不含 IONP 的 EM。该方法从亲本细胞内体产生高度均匀和单分散的纳米囊泡,与天然 EV 具有相同的生物来源。
为了比较超速离心得到的EV与该方法产生的EM,为EV和EM制备了BMSC和293T。采用NTA和TEM分析了EMs的直径和形貌。BMSC-EM的形态具有典型的碗状囊泡状结构的特征,并由脂质双层界定(图3A)。根据 NTA 的分析,BMSC-EM 和 293T-EM 都具有与原生 EV(BMSC-EV 和 293T-EV)相似的流体动力学直径(图 3B)。高速均质化BMSC-EMs×10 8-1.42×10 9/1×106个电池的得率为8.16个,超速离心制备的天然EVs得率仅为7.2×107-1.12×108/1×106个电池。同样,高速均质化的293T-EMs产率为3.71 ×10 8-7.58 × 108/1 ×10 6个电池,比通过传统超速离心法制备的天然293T-EVs(≈5.5×106/1×106个电池)高出约100倍(图4A)。
此外,蛋白质印迹结果显示,BMSC-EMs含有与EVs相同的蛋白质生物标志物(CD63和Annexin)。EM 和 EV 的钙联蛋白表达均呈阴性,表明该方法产生的 EM 几乎没有质膜污染(图 3C)。EM 和 EV 之间的蛋白质浓度没有显着差异,BMSC-EMs 和 BMSC-EVs 表现出相似的总蛋白质浓度,分别为 11.15 μg/1 × 10 9 颗粒和 14.71 μg/1 ×10 9 颗粒通过 BCA 蛋白检测试剂盒。此外,293T-EMs 和 293T-EVs 的总蛋白质浓度分别约为 31.8 μg/1 × 10 9 颗粒和 9.95 μg/1 ×10 9 颗粒(图 4B)。这些结果表明,EM具有与天然EV相似的蛋白质组成。为了检测EM是否可以内吞,将PKH26标记的EM和EV与BMSC和ID8以1×109颗粒/mL的浓度共孵育8小时,并在共聚焦荧光显微镜下观察细胞,以确认EM可以很容易地被细胞吸收以发挥作用,以及EV(图5)。
图1:磁辅助高速均质化方法示意图。 第 1 步:细胞通过内吞作用将 IONP 内化为内体。第 2 步:在低渗处理和匀浆后收集细胞器,包括 IONP 负载的内体。第 3 步:通过磁分离纯化负载 IONP 的内体。第 4 步:将内体均质化并重组为单分散纳米囊泡。第 5 步:通过磁分离去除游离的 IONP 和负载 IONP 的 EM,以收集不含 IONP 的 EM。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2:EM制备条件的优化 。 (A)利用DLS分析了当时间设置为5 min时,BMSC-EMs响应均质化速度变化的直径和PDI。(B)利用DLS分析了均质速度设置为140 x g 时BMSC-EMs响应均质时间变化的直径和PDI。(C)利用DLS分析了BMSC-EMs在不同储存时间点的直径和PDI。(D)NTA分析了当时间设置为5 min时,BMSC-EMs响应均质化速度变化的直径和浓度。(E)NTA分析了均质速度设置为140 x g 时BMSC-EMs响应均质时间变化的直径和浓度。(F) NTA分析BMSC-EMs响应BMSC细胞与不同浓度IONP共孵育的直径和产量。p < 0.0001。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:EM 的表征 。 (A) 具有内吞 IONP、内体和 EM 的亲本细胞形态的 TEM 表征。比例尺代表 500 nm。(B) 采用NTA表征了BMSC-EM、BMSC-EV、293T-EM和293T-EV的水动力直径。(C) BMSC-EMs、BMSC-EVs和BMSC细胞裂解物的蛋白质印迹分析结果。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4:EM的良率高于EV 。 (A)NTA分析了BMSC和293T制备的EM和EV的良率。(B) BMSC和293T制备的EMs和EVs的蛋白质产量,**p<0.01。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:BMSC 和 ID8 内化的 PKH26 标记的 EV 和 EM 的代表性荧光显微镜图像。 比例尺代表 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
作为无细胞疗法和纳米级药物递送系统的替代品,EV尚未达到其临床预期,主要障碍是缺乏可扩展和可重复的生产和纯化方法6。因此,各种类型的 EM 已被开发为具有相似生物复杂性的 EV 类似物14。迄今为止,最常用的EM例子是细胞质膜衍生的纳米囊泡。通过直接挤出整个母体细胞17,这种纳米囊泡的制备相对容易和直接。然而,由于两个缺点,细胞质膜衍生的纳米囊泡不能概括天然 EV:首先,这些纳米囊泡的生物来源来自细胞质膜,与天然 EV 相比,细胞质膜含有不同的脂质和蛋白质组成;其次,污染,包括来自非EV细胞器和细胞碎片的蛋白质、核酸和脂质,导致不可避免的EM异质性。在这种方法中,我们用IONPs孵育细胞,并通过磁分离收集IONP负载的内体,然后通过高速均质化产生单分散纳米囊泡,最终通过第二轮磁分离获得无IONP的EM。此外,我们通过探索均质化速度和时间等不同参数对EM尺寸和产量的影响,优化了EM制备条件。该方案利用了一个有趣的生物学现象:MNP(例如,10nm IONP)可以通过内吞作用被几乎所有细胞有效地内化,并且仅积累在内体中,而不是其他细胞器中。这种独特的生物工艺能够通过磁分离分离负载MNP的内体,而不会受到非EV污染。作为回报,由这些纯化的细胞内体制备的纳米囊泡可以更忠实地概括天然EV的生物学复杂性。
此外,EV分离方法的黄金标准是超速离心,它需要大量的细胞培养基和超过5小时的长处理时间,并且只能从1 x 106细胞中产生1 × 107-1 × 10 8个颗粒6。传统的全亲本细胞挤出方法包括涉及超高压膜挤出和超速离心的多个步骤,这些步骤的收率相对较高,但需要昂贵的设备17。然而,通过使用我们的协议,EM生产产量、效率、成本和人力都得到了显着提高。高速均质机是一种常见且低成本的设备,处理时间短,为5分钟,与原生EV相比,这种方法可以从1×106个电池中产生高达100倍的EM。然而,这种方法有一些局限性,例如在高速匀浆过程中内体蛋白的损失,并且已经表明细胞内吞的MNP可以转移到溶酶体上,这将是潜在的污染18。
从这个角度来看,EM可以被设计成发挥其天然对应物的重要生物学功能,这可能是一种新颖且有前途的生物疗法。生物活性物质(例如,蛋白质和核酸)可以通过选择特定的亲本细胞(例如,干细胞19)或基因修饰(例如,融合蛋白20)整合到 EM 中。例如,通过挤出活胚胎干细胞的细胞衍生的纳米囊泡对恢复或伤口愈合过程具有积极影响19。基因改造是产生具有特定生物学功能的 EM 的替代方法。例如,当用与糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定信号肽融合的抗表皮生长因子受体 (EGFR) 纳米抗体转染细胞时,EGFR 纳米抗体可以锚定在 EV 表面以靶向表达 EGFR 的肿瘤细胞20。在多项临床前研究中,EM 作为无细胞疗法和纳米级药物递送系统的替代品表现良好14,但对 EM 或基于 EV 的疗法缺乏全面的机制理解,担心 EV 和 EM 在临床研究中的异质性和可重复性。综上所述,EM的生物学功能及其临床意义值得进一步研究。
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Disclosures
D.W.和P.G.是中国科学院基础医学与肿瘤研究所(IBMC)提交的一项专利申请的共同发明人。另一位作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者承认在中国科学院基础医学与肿瘤研究所(IBMC)的共享仪器核心设施中使用仪器。本研究得到了国家自然科学基金(NSFC;82172598)、浙江省自然科学基金(LZ22H310001)、浙江省卫生健康委员会551卫生人才培养项目、杭州市科技局农业与社会发展研究项目(2022ZDSJ0474)和钱塘交叉学科研究基金的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
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