Dimostrazione della coltura di fogli cellulari autoassemblati e generazione manuale di un organoide 3D simile a tendine/legamento mediante l'utilizzo di fibroblasti dermici umani
Summary
Qui, dimostriamo un modello di organoide in tre fasi (espansione bidimensionale [2D], stimolazione 2D, maturazione tridimensionale [3D]) che offre uno strumento promettente per la ricerca fondamentale sui tendini e un potenziale metodo senza scaffold per l’ingegneria tissutale tendinea.
Abstract
Tendini e legamenti (T/L) sono strutture forti organizzate gerarchicamente che uniscono il sistema muscolo-scheletrico. Questi tessuti hanno una matrice extracellulare ricca di collagene (ECM) di tipo I e cellule del lignaggio T/L posizionate principalmente in file parallele. Dopo l’infortunio, T/L richiede molto tempo per la riabilitazione con un alto rischio di fallimento e risultati di riparazione spesso insoddisfacenti. Nonostante i recenti progressi nella ricerca biologica sul T/L, una delle sfide rimanenti è che il campo T/L manca ancora di un protocollo di differenziazione standardizzato in grado di ricapitolare il processo di formazione del T/L in vitro. Ad esempio, la differenziazione ossea e grassa delle cellule precursori mesenchimali richiede solo una coltura cellulare bidimensionale (2D) standard e l’aggiunta di specifici mezzi di stimolazione. Per la differenziazione in cartilagine, è necessaria la coltura tridimensionale (3D) in pellet e l’integrazione di TGFß. Tuttavia, la differenziazione cellulare al tendine necessita di un modello di coltura 3D molto ordinato, che idealmente dovrebbe essere anche soggetto a stimolazione meccanica dinamica. Abbiamo stabilito un modello di organoide in 3 fasi (espansione, stimolazione e maturazione) per formare una struttura 3D simile a un bastoncino da un foglio cellulare autoassemblato, che fornisce un microambiente naturale con i propri fattori ECM, autocrini e paracrini. Questi organoidi a bastoncino hanno un’architettura cellulare multistrato all’interno di una ricca ECM e possono essere maneggiati abbastanza facilmente per l’esposizione a sollecitazioni meccaniche statiche. Qui, abbiamo dimostrato il protocollo in 3 fasi utilizzando fibroblasti dermici disponibili in commercio. Abbiamo potuto dimostrare che questo tipo di cellula forma organoidi robusti e abbondanti nella ECM. La procedura descritta può essere ulteriormente ottimizzata in termini di terreni di coltura e ottimizzata verso la stimolazione meccanica assiale dinamica. Allo stesso modo, le fonti cellulari alternative possono essere testate per il loro potenziale di formare organoidi T/L e quindi subire la differenziazione T/L. In sintesi, l’approccio consolidato degli organoidi T/L 3D può essere utilizzato come modello per la ricerca di base sui tendini e persino per l’ingegneria T/L senza scaffold.
Introduction
Tendini e legamenti (T/L) sono componenti vitali del sistema muscolo-scheletrico che forniscono supporto e stabilità essenziali al corpo. Nonostante il loro ruolo critico, questi tessuti connettivi sono soggetti a degenerazione e lesioni, causando dolore e compromissione della mobilità1. Inoltre, il loro limitato apporto di sangue e la lenta capacità di guarigione possono portare a lesioni croniche, mentre fattori come l’invecchiamento, il movimento ripetitivo e la riabilitazione impropria aumentano ulteriormente il rischio di degenerazione e lesioni2. I trattamenti convenzionali, come il riposo, la terapia fisica e gli interventi chirurgici, non sono in grado di ripristinare completamente la struttura e la funzione T/L. Negli ultimi anni, i ricercatori si sono sforzati di comprendere meglio la natura intricata del T/L al fine di cercare trattamenti efficaci per i disturbi T/L 3,4,5. I T/L si distinguono per una struttura gerarchicamente organizzata, dominata dalla matrice extracellulare (ECM), composta principalmente da fibre di collagene di tipo I e proteoglicani, una caratteristica difficile da replicare in vitro6. I tradizionali modelli di coltura cellulare bidimensionale (2D) non riescono a catturare la caratteristica organizzazione tridimensionale (3D) dei tessuti T/L, limitando il loro potenziale traduzionale e ostacolando il progresso innovativo nel campo della rigenerazione T/L.
Recentemente, lo sviluppo di modelli 3D di organoidi ha offerto nuove possibilità per far progredire la ricerca di base e l’ingegneria tissutale senza scaffold di vari tipi di tessuto 7,8,9,10,11,12,13. Ad esempio, per studiare la giunzione miotendinea, Larkin et al. 2006 hanno sviluppato costrutti muscolari scheletrici 3D insieme a segmenti tendinei auto-organizzati derivati dal tendine della coda di ratto10. Inoltre, Schiele et al. 2013, utilizzando canali di crescita rivestiti di fibronectina microlavorati, ha diretto l’autoassemblaggio dei fibroblasti dermici umani per formare fibre cellulari senza l’assistenza di scaffold 3D, un approccio che può catturare i tratti chiave dello sviluppo del tendine embrionale11. Nello studio di Florida et al. 2016, le cellule stromali del midollo osseo sono state prima espanse in linee ossee e legamentose, successivamente utilizzate per generare fogli cellulari monostrato autoassemblati, che sono stati poi implementati per creare un costrutto osseo-legamento-osso multifasico che imita il legamento crociato anteriore nativo, un modello che mira a migliorare la comprensione della rigenerazione dei legamenti12. Per chiarire i processi di meccanotrasduzione tendinea, Mubyana et al. 2018 hanno utilizzato una metodologia senza scaffold mediante la quale sono state create singole fibre tendinee e sottoposte al protocollo di carico meccanico13. Gli organoidi sono strutture 3D auto-organizzate che imitano l’architettura nativa, il microambiente e la funzionalità dei tessuti. Le colture di organoidi 3D forniscono un modello fisiologicamente più rilevante per lo studio della biologia dei tessuti e degli organi, nonché della fisiopatologia. Tali modelli possono anche essere utilizzati per indurre la differenziazione tessuto-specifica di diversi tipi di cellule staminali/progenitrici14,15. Pertanto, l’implementazione di modelli 3D di organoidi nel campo della biologia T/L e dell’ingegneria tissutale diventa un approccio molto interessante 9,16. Fonti cellulari alternative possono essere implementate per l’assemblaggio degli organoidi e stimolate verso la differenziazione tenogenica. Un tipo di cellula rilevante utilizzato per la dimostrazione in questo studio sono i fibroblasti dermici 7,17,18. Queste cellule sono facilmente accessibili attraverso una procedura di biopsia cutanea, che è meno invasiva rispetto alla puntura del midollo osseo o alla liposuzione e può essere moltiplicata abbastanza rapidamente in grandi numeri grazie alla loro buona capacità proliferativa. Al contrario, i tipi di cellule più specializzati, come i fibroblasti residenti in T/L, sono più difficili da isolare ed espandere. Pertanto, i fibroblasti dermici sono stati utilizzati anche come punto di partenza per le tecnologie di riprogrammazione cellulare verso cellule staminali embrionali pluripotenti indotte19. Sottoporre i fibroblasti dermici a specifiche condizioni di coltura 3D e segnali di segnalazione, come il fattore di crescita trasformante-beta 3 (TGFß3), che è stato riportato agire come regolatore chiave di vari processi cellulari, tra cui la formazione e il mantenimento di T/L, può potenziare la loro differenziazione tenogenica in vitro portando all’espressione di geni tendinei specifici e alla deposizione di ECM20 T/L-tipica, 21.
Qui, descriviamo e dimostriamo un protocollo di organoidi in 3 fasi (espansione 2D, stimolazione 2D e maturazione 3D) precedentemente stabilito e implementato utilizzando fibroblasti dermici umani adulti normali (NHDF) disponibili in commercio come fonte cellulare, offrendo un modello prezioso per lo studio della tenogenesi in vitro 7. Nonostante il fatto che questo modello non sia equivalente al tessuto T/L in vivo, fornisce comunque un sistema fisiologicamente più rilevante che può essere utilizzato per studiare i meccanismi di differenziazione cellulare, imitare la fisiopatologia T/L in vitro e stabilire piattaforme di medicina personalizzata T/L e screening farmacologico. Inoltre, in futuro, gli studi potranno valutare se gli organoidi 3D sono adatti per l’ingegneria T/L senza scaffold mediante un’ulteriore ottimizzazione e utilizzabili per lo sviluppo di costrutti meccanicamente robusti su larga scala che assomigliano molto alle dimensioni e alle proprietà strutturali e biofisiche dei tessuti T/L nativi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I risultati dimostrati in questo studio forniscono preziose informazioni sulla creazione e la caratterizzazione del modello di organoide 3D NHDF per lo studio dei tessuti T/L. Il protocollo in 3 fasi ha portato alla formazione di organoidi 3D simili a bastoncelli che presentano caratteristiche tipiche della nicchia T/L. Questo modello è stato precedentemente riportato in Kroner-Weigl et al. 20237 e dimostrato in modo molto dettagliato qui.
Le immagini a contra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.D. e S.M.-D. riconoscere la sovvenzione BMBF “CellWiTaL: sistemi cellulari riproducibili per la ricerca farmacologica – stampa laser senza strato di trasferimento di singole cellule altamente specifiche in strutture cellulari tridimensionali” Proposta n. 13N15874. D.D. e V.R.A. riconoscono la sovvenzione EU MSCA-COFUND OSTASKILLS “Formazione olistica delle ricerche sull’osteoartrite di nuova generazione” GA Nr. 101034412. Tutti gli autori ringraziano la signora Beate Geyer per l’assistenza tecnica.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
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