ヒト真皮線維芽細胞を用いた自己組織化細胞シート培養の実証と3次元腱・靭帯様オルガノイドの手動生成
Summary
ここでは、腱の基礎研究に有望なツールと、腱組織工学のための潜在的な足場のない方法を提供する3ステップオルガノイドモデル(2次元[2D]拡張、2D刺激、3次元[3D]成熟)を実証します。
Abstract
腱と靭帯(T / L)は、筋骨格系を結合する強力な階層的に組織化された構造です。これらの組織は、厳密に配置されたコラーゲンI型に富む細胞外マトリックス(ECM)とT/L系統細胞を主に平行に並べています。怪我の後、T/Lはリハビリテーションに長い時間を必要とし、故障のリスクが高く、多くの場合、満足のいく修復結果が得られません。近年のT/L生物学研究の進歩にもかかわらず、残された課題の1つは、T/L分野には、 in vitroでT/L形成プロセスを再現できる標準化された分化プロトコルがまだないことです。例えば、間葉系前駆細胞の骨と脂肪の分化には、標準的な2次元(2D)細胞培養と特異的刺激培地の添加のみが必要です。軟骨への分化には、3次元(3D)ペレット培養とTGFβの補給が必要です。しかし、腱への細胞分化には、非常に整然とした3D培養モデルが必要であり、理想的には動的な機械的刺激にもさらされる必要があります。私たちは、自己組織化された細胞シートから3次元の棒状構造を形成する3段階(膨張、刺激、成熟)のオルガノイドモデルを確立し、ECM、オートクライン、パラクリン因子を持つ自然な微小環境を作り出しています。これらの棒状オルガノイドは、豊富なECM内に多層の細胞構造を持ち、静的な機械的ひずみにさらされても非常に簡単に扱うことができます。ここでは、市販の真皮線維芽細胞を用いて3ステップのプロトコールを実証しました。この細胞タイプが、強固でECMに富んだオルガノイドを形成することを示すことができました。記載された手順は、培地に関してさらに最適化され、動的軸方向の機械的刺激に向けて最適化され得る。同様に、代替細胞源は、T/Lオルガノイドを形成し、T/L分化を起こす可能性についてテストすることができます。要するに、確立された3D T/Lオルガノイドアプローチは、腱の基礎研究のモデルとして、さらには足場のないT/Lエンジニアリングにも使用できます。
Introduction
腱と靭帯(T / L)は、体に不可欠なサポートと安定性を提供する筋骨格系の重要な構成要素です。これらの結合組織は、その重要な役割にもかかわらず、変性や損傷を起こしやすく、痛みや運動障害を引き起こします1。さらに、それらの限られた血液供給と遅い治癒能力は慢性的な怪我につながる可能性がありますが、老化、反復運動、不適切なリハビリテーションなどの要因は、変性や怪我のリスクをさらに高めます2。安静、理学療法、外科的介入などの従来の治療法では、T/Lの構造と機能を完全に回復させることはできません。過去数年間、研究者は T/L 障害の効果的な治療法を模索するために、T/L の複雑な性質をよりよく理解しようと努めてきました 3,4,5。T/Lは、主にI型コラーゲン線維とプロテオグリカンで構成される、階層的に組織化された細胞外マトリックス(ECM)優位の構造によって区別されますが、これはin vitroで再現することが困難な特徴です6。従来の2次元(2D)細胞培養モデルは、T/L組織の特徴的な3次元(3D)組織を捉えることができず、翻訳の可能性を制限し、T/L再生の分野における革新的な進歩を妨げていました。
近年、3Dオルガノイドモデルの開発により、基礎研究や様々な組織タイプのスキャフォールドフリー組織工学を前進させる新たな可能性がもたらされました7,8,9,10,11,12,13。例えば、筋腱接合部を調査するために、Larkin et al. 2006は、ラット尾腱に由来する自己組織化腱セグメントとともに3D骨格筋構造を開発した10。さらに、Schiele et al. 2013は、マイクロマシニングされたフィブロネクチン被覆成長チャネルを使用することにより、ヒト真皮線維芽細胞の自己組織化を指示し、3D足場の助けを借りずに細胞線維を形成することを示し、胚性腱発生の重要な形質を捉えることができるアプローチである11。Florida et al. 2016による研究では、骨髄間質細胞が最初に骨と靭帯の系統に拡大され、次に自己組織化された単層細胞シートを生成するために使用され、次に実装されて、靭帯再生の理解を深めることを目的としたモデルである、天然の前十字靭帯を模倣した多相性の骨-靭帯-骨構造を作成しました12.腱のメカノトランスダクションプロセスを解明するために、Mubyana et al. 2018は、単一の腱繊維を作成し、機械的負荷プロトコル13にかける足場のない方法を利用しました。オルガノイドは、組織の本来の構造、微小環境、機能性を模倣した自己組織化された3D構造です。3Dオルガノイド培養は、組織や臓器の生物学、病態生理学を研究するための、より生理学的に適切なモデルを提供します。このようなモデルは、異なる幹細胞/前駆細胞型の組織特異的分化を誘導するためにも使用できます14,15。したがって、T/L生物学および組織工学の分野で3Dオルガノイドモデルを実装することは、非常に魅力的なアプローチになります9,16。オルガノイド集合体に代替の細胞源を実装し、テノイド分化に向けて刺激することができます。この研究でデモンストレーションに使用された関連する細胞タイプの1つは、真皮線維芽細胞7,17,18です。これらの細胞は、骨髄穿刺や脂肪吸引に比べて侵襲性が低く、増殖能力が高いため、かなり迅速に大量に増殖できる皮膚生検手順によって簡単にアクセスできます。対照的に、T/L常在性線維芽細胞などのより特殊な細胞タイプは、単離と増殖がより困難です。したがって、真皮線維芽細胞は、人工多能性胚性幹細胞に向けた細胞リプログラミング技術の出発点としても使用された19。T/Lの形成と維持を含むさまざまな細胞プロセスの主要な調節因子として作用することが報告されているトランスフォーミング成長因子-β3(TGFß3)などの特定の3D培養条件とシグナル伝達の手がかりに真皮線維芽細胞をさらすと、腱特異的遺伝子の発現とT/L典型的なECMの沈着につながるin vitroのテノジェニック分化を増強できます20、21.
ここでは、市販の正常な成人ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)を細胞源として使用して、以前に確立および実装された3ステップ(2D拡張、2D刺激、および3D成熟)オルガノイドプロトコルについて説明し、実証し、 in vitro 腱形成を研究するための貴重なモデルを提供します7。このモデルは in vivo T/L組織と同等ではないという事実にもかかわらず、細胞分化メカニズムの調査、 in vitroでのT/L病態生理学の模倣、およびT/L個別化医療および薬物スクリーニングプラットフォームの確立に使用できる、より生理学的に関連性の高いシステムを提供します。さらに、将来的には、3Dオルガノイドが、天然のT/L組織の寸法や構造的および生物物理学的特性によく似た、スケールアップされた機械的に堅牢な構造の開発に利用できるだけでなく、さらなる最適化によって、足場のないT/Lエンジニアリングに適しているかどうかを評価することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究で実証された結果は、T/L 組織を研究するための NHDF 3D オルガノイド モデルの確立と特性評価に関する貴重な洞察を提供します。3ステップのプロトコルにより、T/Lニッチの典型的な特徴を示す3D棒状オルガノイドが形成されました。このモデルは、以前にKroner-Weigl et al.2023 :7 で報告されており、ここで非常に詳細に実証されています。
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Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.D.とS.M.-D.BMBF助成金「CellWiTaL:医薬品研究のための再現性のある細胞システム-三次元細胞構造における非常に特異的な単一細胞の転写層フリーレーザー印刷」提案番号13N15874に感謝します。D.D.とV.R.A.は、EU MSCA-COFUND GRANT OSTASKILLSの「次世代の変形性関節症研究のホリスティックトレーニング」GA Nr.101034412を認めています。すべての著者は、技術支援を提供してくれたベアテ・ガイヤー夫人に感謝します。
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
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