Демонстрация самоорганизующейся культуры клеточных листов и ручная генерация 3D-органоида, похожего на сухожилие/связку, с использованием дермальных фибробластов человека
Summary
В данной работе мы демонстрируем трехступенчатую модель органоида (двумерное [2D] расширение, 2D-стимуляция, трехмерное [3D] созревание), предлагающую многообещающий инструмент для фундаментальных исследований сухожилий и потенциальный метод без каркасов для тканевой инженерии сухожилий.
Abstract
Сухожилия и связки (Т/Л) являются сильными иерархически организованными структурами, объединяющими опорно-двигательный аппарат. Эти ткани имеют строго организованный коллагеновый тип I-богатый внеклеточный матрикс (ECM) и клетки T/L-линии, в основном расположенные параллельными рядами. После травмы Т/Л требуют длительного времени для реабилитации с высоким риском неудачи и часто неудовлетворительными результатами восстановления. Несмотря на недавние достижения в исследованиях биологии Т/Л, одна из нерешенных проблем заключается в том, что в области Т/Л все еще отсутствует стандартизированный протокол дифференцировки, который способен повторить процесс образования Т/Л in vitro. Например, костная и жировая дифференцировка мезенхимальных клеток-предшественников требует только стандартной двумерной (2D) клеточной культуры и добавления специфических стимулирующих сред. Для дифференцировки в хрящи необходимо трехмерное (3D) культивирование гранул и добавление TGFß. Однако дифференцировка клеток в сухожилие требует очень упорядоченной 3D-модели культуры, которая в идеале также должна подвергаться динамической механической стимуляции. Мы создали 3-ступенчатую (расширение, стимуляция и созревание) органоидную модель для формирования 3D-палочковидной структуры из самоорганизующегося клеточного листа, которая обеспечивает естественную микросреду со своими собственными ECM, аутокринными и паракринными факторами. Эти палочковидные органоиды имеют многослойную клеточную архитектуру в богатой ВКМ и могут быть довольно легко обработаны для воздействия статической механической нагрузки. Здесь мы продемонстрировали 3-этапный протокол с использованием коммерчески доступных дермальных фибробластов. Мы смогли показать, что этот тип клеток образует крепкие и богатые ВКМ органоиды. Описанная процедура может быть дополнительно оптимизирована с точки зрения питательных сред и оптимизирована для динамической осевой механической стимуляции. Таким же образом альтернативные клеточные источники могут быть проверены на их способность образовывать органоиды Т/Л и, таким образом, подвергаться дифференцировке Т/Л. В целом, устоявшийся подход к 3D Т/Л органоидам может быть использован в качестве модели для фундаментальных исследований сухожилий и даже для безкаркасной инженерии Т/Л.
Introduction
Сухожилия и связки (T/L) являются жизненно важными компонентами опорно-двигательного аппарата, которые обеспечивают необходимую поддержку и стабильность организма. Несмотря на свою критическую роль, эти соединительные ткани склонны к дегенерации и травмам, вызывая боль и нарушение подвижности1. Более того, их ограниченное кровоснабжение и медленная способность к заживлению могут привести к хроническим травмам, в то время как такие факторы, как старение, повторяющиеся движения и неправильная реабилитация, еще больше увеличивают риск дегенерации и травм. Традиционные методы лечения, такие как отдых, физиотерапия и хирургические вмешательства, не могут полностью восстановить структуру и функцию T/L. В течение последних нескольких лет исследователи стремились лучше понять сложную природу T/L, чтобы найти эффективные методы лечения T/L-расстройств 3,4,5. T/L отличаются иерархически организованной структурой с преобладанием внеклеточного матрикса (ECM), состоящей в основном из коллагеновых волокон I типа и протеогликанов, особенность, которую трудно воспроизвести in vitro6. Традиционные двумерные (2D) модели клеточных культур не могут охватить характерную трехмерную (3D) организацию тканей Т/Л, что ограничивает их трансляционный потенциал, а также препятствует инновационному прогрессу в области регенерации Т/Л.
В последнее время разработка 3D-моделей органоидов открыла новые возможности для продвижения фундаментальных исследований и тканевой инженерии различных типов тканейбез каркасов 7,8,9,10,11,12,13. Например, для исследования миотендинозного соединения Larkin et al. 2006 разработали трехмерные конструкции скелетных мышц вместе с самоорганизующимися сегментами сухожилия, полученными из сухожилия10 крысиного хвоста. Более того, Schiele et al. 2013, используя микромашинные каналы роста, покрытые фибронектином, направили самосборку дермальных фибробластов человека для формирования клеточных волокон без помощи 3D-каркаса, подход, который может уловить ключевые чертыразвития эмбриональных сухожилий. В исследовании, проведенном Florida et al. 2016, стромальные клетки костного мозга сначала были расширены в линии костей и связок, а затем использованы для создания самоорганизующихся однослойных клеточных листов, которые затем были реализованы для создания многофазной конструкции «кость-связка-кость», имитирующей нативную переднюю крестообразную связку, модель, направленную на улучшение понимания регенерации связок12. Чтобы выяснить процессы механотрансдукции сухожилий, Mubyana et al. 2018 использовали методологию без каркасов, с помощью которой отдельные волокна сухожилия были созданы и подвергнуты протоколу механической нагрузки13. Органоиды — это самоорганизующиеся 3D-структуры, которые имитируют естественную архитектуру, микроокружение и функциональность тканей. 3D-культуры органоидов обеспечивают более физиологически релевантную модель для изучения биологии тканей и органов, а также патофизиологии. Такие модели также могут быть использованы для индуцирования тканеспецифической дифференцировки различных типов стволовых/прогениторных клеток14,15. Следовательно, реализация 3D-моделей органоидов в области биологии Т/Л и тканевой инженерии становится очень привлекательным подходом 9,16. Альтернативные клеточные источники могут быть реализованы для органоидной сборки и стимулированы к теногенной дифференцировке. Одним из релевантных типов клеток, используемых для демонстрации в этом исследовании, являются дермальные фибробласты 7,17,18. Эти клетки легко доступны с помощью процедуры биопсии кожи, которая менее инвазивна по сравнению с пункцией костного мозга или липосакцией и может довольно быстро размножаться в больших количествах благодаря их хорошей пролиферативной способности. Напротив, более специализированные типы клеток, такие как Т/L-резидентные фибробласты, сложнее изолировать и расширить. Таким образом, дермальные фибробласты также использовались в качестве отправной точки для технологий перепрограммирования клеток в направлении индуцированных плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток19. Воздействие на дермальные фибробласты специфических условий 3D-культивирования и сигнальных сигналов, таких как трансформирующий фактор роста-бета 3 (TGFß3), который, как сообщается, действует как ключевой регулятор различных клеточных процессов, включая образование и поддержание T/L, может потенцировать их теногенную дифференцировку in vitro, приводящую к экспрессии сухожиль-специфических генов и отложению T/L-типичной ECM20, 21.
Здесь мы описываем и демонстрируем ранее установленный и реализованный 3-этапный (2D-экспансия, 2D-стимуляция и 3D-созревание) органоидный протокол с использованием коммерчески доступных нормальных дермальных фибробластов взрослого человека (NHDF) в качестве источника клеток, предлагая ценную модель для изучения теногенеза in vitro 7. Несмотря на то, что эта модель не эквивалентна ткани Т/Л in vivo, она все же обеспечивает более физиологически значимую систему, которую можно использовать для исследования механизмов клеточной дифференцировки, имитации патофизиологии Т/Л in vitro и создания персонализированной медицины Т/Л и платформ для скрининга лекарств. Более того, в будущем исследования могут оценить, подходят ли 3D-органоиды для безкаркасной инженерии Т/Л путем дальнейшей оптимизации, а также могут ли они быть использованы для разработки увеличенных механически прочных конструкций, которые очень похожи по размерам, структурным и биофизическим свойствам нативных тканей Т/Л.
Protocol
Representative Results
Discussion
Результаты, продемонстрированные в этом исследовании, дают ценную информацию о создании и характеристике 3D-модели органоида NHDF для изучения тканей T/L. 3-ступенчатый протокол привел к образованию 3D-палочковидных органоидов, которые демонстрируют типичные черты ниши T/L. Эта модель ранее …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Д.Д. и С.М.-Д. признательно за грант BMBF «CellWiTaL: Воспроизводимые клеточные системы для исследования лекарств — беспослойная лазерная печать высокоспецифичных одиночных клеток в трехмерных клеточных структурах», предложение No 13N15874. D.D. и V.R.A. признают грант EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS «Целостное обучение исследований остеоартрита следующего поколения» GA Nr. 101034412. Все авторы выражают благодарность г-же Беате Гейер за техническую помощь.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair – A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
