Summary
Viene fornito un protocollo dettagliato per la pulizia e il riutilizzo delle provette per ultracentrifuga in policarbonato per eseguire l'isolamento delle vescicole extracellulari adatto per esperimenti di proteomica.
Abstract
Le plastiche monouso da laboratorio aggravano la crisi dell'inquinamento e contribuiscono ai costi dei materiali di consumo. Nell'isolamento delle vescicole extracellulari (EV), le provette per ultracentrifuga in policarbonato (UC) vengono utilizzate per sopportare le elevate forze centrifughe associate. La proteomica EV è un campo in progresso e mancano protocolli di riutilizzo convalidati per questi tubi. Il riutilizzo dei materiali di consumo per i protocolli di isolamento delle proteine a basso rendimento e la proteomica a valle richiede la compatibilità dei reagenti con le acquisizioni di spettroscopia di massa, come l'assenza di contaminazione da polimeri sintetici derivati da provette da centrifuga e una sufficiente rimozione delle proteine residue.
Questo protocollo descrive e convalida un metodo per la pulizia dei tubi UC in policarbonato per il riutilizzo in esperimenti di proteomica EV. Il processo di pulizia prevede l'immersione immediata dei tubi UC in H2O per prevenire l'essiccazione delle proteine, il lavaggio in detergente dodecilsolfato di sodio (SDS) allo 0,1%, il risciacquo in acqua calda del rubinetto, acqua demineralizzata ed etanolo al 70%. Per convalidare il protocollo di riutilizzo delle provette UC per la proteomica delle vescicole extracellulari a valle, sono state ottenute provette usate a seguito di un esperimento che isolava le vescicole extracellulari dal tessuto cardiovascolare utilizzando la colite ulcerosa differenziale e la separazione del gradiente di densità. Le provette sono state pulite e il processo sperimentale è stato ripetuto senza campioni EV confrontando provette UC vuote mai utilizzate con provette UC pulite. I pellet pseudo-EV ottenuti dalle procedure di isolamento sono stati lisati e preparati per cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem utilizzando un kit di preparazione del campione proteico commerciale con modifiche per campioni proteici a bassa abbondanza.
Dopo la pulizia, il numero di proteine identificate è stato ridotto del 98% nello pseudo-pellet rispetto al precedente campione di isolamento EV dalla stessa provetta. Confrontando una provetta pulita con una provetta vuota, entrambi i campioni contenevano un numero molto piccolo di proteine (≤20) con una somiglianza dell'86%. È stata confermata l'assenza di picchi polimerici nei cromatogrammi delle provette pulite. In definitiva, la validazione di un protocollo di pulizia dei tubi UC adatto all'arricchimento dei veicoli elettrici ridurrà i rifiuti prodotti dai laboratori di veicoli elettrici e abbasserà i costi sperimentali.
Introduction
Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle delimitate da doppio strato lipidico rilasciate da cellule che trasportano carichi biologicamente attivi, come le proteine, e partecipano a vari processi biologici, tra cui la comunicazione cellula-cellula e la formazione di mineralizzazione biologica1. Queste particelle si trovano in tutti i fluidi e tessuti corporei e le loro attività biologiche e usi sono un campo di ricerca scientifica in rapida evoluzione. L'isolamento e la convalida di queste nanoparticelle presentano varie sfide a causa delle loro piccole dimensioni e della biosimilarità con altre particelle, come liposomi e aggregati proteici. Le più recenti linee guida della Società Internazionale delle Vescicole Extracellulari, Informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari 2018 (MISEV2018), sono lo standard riconosciuto per la ricerca scientifica sulle vescicole extracellulari2.
Per l'isolamento delle vescicole extracellulari devono essere utilizzati vari metodi, spesso in tandem, a seconda della sorgente a monte e delle applicazioni a valle. A partire dal 2015, il metodo di isolamento primario più comune per le vescicole extracellulari era l'ultracentrifugazione differenziale (UC)2. In linea di principio, la centrifugazione iniziale a bassa velocità separa i componenti indesiderati più grandi o più densi, come cellule e detriti cellulari, lasciando le vescicole extracellulari nel surnatante. Successivamente, l'UC utilizza una forza centrifuga molto elevata per estrarre e quindi separare e purificare le vescicole extracellulari da altre particelle più piccole o meno dense, ma che possono contenere anche particelle dense non EV. La maggior parte dei protocolli utilizzerà spesso, in un passaggio o nell'altro, l'UC per isolare le vescicole extracellulari da un fluido3. Inoltre, l'UC viene utilizzato in altri metodi di isolamento delle vescicole extracellulari, come l'ultracentrifugazione a gradiente di densità (DGUC), che utilizza mezzi come lo iodixanolo OptiprepTM e la forza centrifuga per separare le vescicole extracellulari in base alla loro densità di galleggiamento4. Esistono altri metodi di isolamento delle vescicole extracellulari3.
Considerando la rapida evoluzione della comprensione dei processi biologici dettati dalle vescicole extracellulari e il loro potenziale come biomarcatori e informazioni riguardanti la fisiopatologia, le analisi basate sulla scoperta come la proteomica hanno guadagnato terreno 5,6,7,8. Le vescicole extracellulari sono piccole e, a seconda della fonte, hanno una bassa resa di proteine (<1 μg) rispetto al tessuto intero o al lisato cellulare. L'isolamento delle vescicole extracellulari per l'analisi proteomica richiede considerazioni speciali, come la rimozione di contaminanti proteici non EV da liquidi o tessuti a monte, la considerazione della degradazione delle proteine EV durante il processo di isolamento e l'utilizzo di metodi che creano soluzioni proteiche chimicamente compatibili con la preparazione di peptidi e le analisi di spettrometria di massa.
I materiali di consumo del laboratorio di ricerca sono spesso di plastica e di natura usa e getta. Questi materiali monouso contribuiscono alla crisi globale dell'inquinamento da plastica e ai costi dei materiali di consumo. I tubi UC specializzati in policarbonato e polistirene sono progettati per resistere alle elevate forze centrifughe richieste per pellettare i veicoli elettrici nelle applicazioni di laboratorio. Sebbene sia possibile sterilizzare e disinfettare le provette per colite ulcerosa per il riutilizzo, l'analisi proteomica, in particolare quelle a bassa resa proteica come le vescicole extracellulari, richiede un'attenzione speciale. Non solo è fondamentale una sufficiente rimozione delle proteine residue dall'uso precedente, ma deve essere considerata anche la compatibilità chimica con la spettroscopia di massa e la contaminazione da polimeri derivati dalla plastica.
Qui presentiamo un protocollo di pulizia dei tubi in policarbonato utilizzando detergenti adatti alla spettrometria di massa ed eseguiamo esperimenti per convalidare la sua rimozione di proteine residue al di sotto dei limiti di rilevamento e mancanza di contaminanti polimerici rilevabili. Per convalidare il protocollo di pulizia per applicazioni proteomiche EV utilizzando sia scopi UC che DGUC, abbiamo ottenuto provette da isolamenti di vescicole extracellulari di tessuto vascolare umano con un protocollo combinato UC e DGUC. Le provette sono state pulite utilizzando il protocollo descritto e il processo sperimentale è stato ripetuto senza campioni confrontando una provetta UC vuota mai utilizzata e una provetta UC pulita. In definitiva, la convalida di un protocollo di pulizia dei tubi UC adatto all'arricchimento dei veicoli elettrici ridurrà i rifiuti prodotti dai laboratori di veicoli elettrici e ridurrà i costi associati a tali esperimenti.
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Protocol
1. Pulizia del tubo
NOTA: La procedura di isolamento EV utilizza tubi UC in policarbonato con e senza tappo (descritti di seguito). La stessa procedura è stata seguita sia per le provette tappate che per quelle non tappate. Nel caso dei tubi tappati, le parti del coperchio sono state pulite singolarmente e rimontate dopo l'asciugatura e il pre-stoccaggio.
- Dopo l'uso iniziale delle provette in policarbonato e la rimozione del campione, immergere immediatamente le provette UC in acqua di rubinetto per evitare che il campione si secchi sul lato della provetta.
- Trasferire e immergere le provette in dodecil solfato di sodio (SDS) allo 0,1% in acqua di rubinetto per 10 minuti.
- Una provetta alla volta, decantare la maggior parte, ma non tutta, della soluzione SDS dalla provetta e utilizzare un batuffolo di cotone per pulire accuratamente l'area della provetta in cui si trovava il pellet EV.
NOTA: Non utilizzare nulla con setole. Questo protocollo utilizzava normali tamponi di cotone; tuttavia, per la pulizia dei tubi è possibile utilizzare tamponi di cotone specializzati e a basso contenuto di lanugine. - Sciacquare almeno 3 volte con acqua calda del rubinetto (~50 °C). Assicurati di riempire e decantare completamente il tubo.
- Risciacquare 1 volta con acqua demineralizzata utilizzando un flacone spray o un flacone di lavaggio a bocca stretta.
- Risciacquare 1 volta con etanolo al 70% utilizzando un flacone spray.
- Lasciare asciugare il tubo capovolto.
NOTA: I rack per provette per lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza funzionano bene per l'essiccazione delle provette UC. - Metti i tubi completamente asciutti in un barattolo pulito; sono pronti per il riutilizzo.
NOTA: Attualmente, il protocollo è convalidato per il riutilizzo fino a 2 volte.
2. Arricchimento EV
NOTA: Il seguente protocollo di isolamento delle vescicole extracellulari e proteomica è stato utilizzato sia per l'isolamento delle vescicole extracellulari tissutali originale, sia per i "campioni simulati" utilizzati per ottenere i campioni di provette bianche (mai utilizzate) e pulite. I campioni originali erano vescicole extracellulari intrappolate nel tessuto risospeso da placche carotidee di pazienti sottoposti a endoarterectomie carotidee. I campioni chirurgici sono stati raccolti dall'University Health Network (Toronto, Canada) e sono stati approvati dal comitato etico istituzionale. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato per la raccolta dei campioni e l'analisi dei dati, in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. I campioni simulati erano pseudo-pellet ottenuti dal trattamento di provette vuote e pulite con le stesse soluzioni e fasi di lavorazione dei campioni di isolamento EV.
- Scongela campioni EV o campioni simulati in PBS su ghiaccio.
- Preparare il tampone NTE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) e il filtro sterile.
- Centrifugare i campioni a 10.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
- Spostare il surnatante in una provetta in policarbonato aperta da 1 mL.
- Centrifugare il surnatante a 100.000× g per 1 ora a 4 °C.
- Risospendere il pellet in 150 μL di tampone NTE filtrato sterile con inibitore della proteasi.
- Trasferire in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere il tampone NTE per raggiungere un volume totale del campione di 1,5 mL.
- Tenere i campioni sul ghiaccio.
3. Preparazione dei gradienti di densità e separazione dei gradienti di densità
NOTA: Questo protocollo di isolamento delle vescicole extracellulari è stato precedentemente descritto da Blaser et al.9 In breve:
- Preparare cinque soluzioni di terreno a gradiente di densità di iodixanolo (10%, 15%, 20%, 25% e 30%) con tampone NTE come diluente.
- Stratificare le cinque soluzioni di densità in sequenza in una o più provette per ultracentrifuga con tappo con il 30% in basso e il 10% in alto.
- Fissare i tappi sulle provette e spostarli delicatamente in posizione orizzontale stabile per 1 ora a temperatura ambiente.
- Dopo 1 ora, spostare delicatamente i tubi in posizione verticale sul ghiaccio per 30 minuti per raffreddare la pendenza.
- Aggiungere 1,5 mL del campione o del campione simulato (tampone NTE) alla parte superiore delle provette preparate con gradiente di densità.
- Provette da ultracentrifuga a 250.000 × g per 40 minuti a 4 °C.
- Rimuovere le frazioni superiori del gradiente di densità (2,4 mL) nelle provette per ultracentrifuga non tappate. Riempire fino a 9 mL con tampone NTE filtrato sterile.
- Pellettare le EV mediante ultracentrifugazione a 100.000 × g per 1 ora a 4 °C.
NOTA: Cerchiare la posizione del pellet EV visibile o la posizione prevista con un pennarello. Ciò ti consentirà di pulire direttamente l'area del pellet con il tampone. - Aspirare il surnatante spostando la provetta in posizione capovolta per 3 minuti. Rimuovere le goccioline rimanenti con un batuffolo di cotone prima di capovolgere la provetta con il lato destro rivolto verso l'alto.
- Risospendere il pellet EV in 12 μL di tampone di lisi nel kit di riferimento.
4. Preparazione di peptidi per la proteomica
NOTA: La preparazione del campione di proteomica è stata eseguita secondo il protocollo del kit con modifiche interne per campioni proteici a bassa abbondanza. Il protocollo modificato è il seguente:
- Lizzare, denaturare, ridurre e alchilare i campioni riscaldandoli in tampone di lisi a 95 °C per 10 minuti.
- Digerire i campioni utilizzando la soluzione di digestione di Lys-C/tripsina per 2 ore a 37 °C utilizzando 10 μL di soluzione di lisi dal campione e 10 μL di soluzione di digestato.
- Purifica i peptidi attraverso una cartuccia lavando via i contaminanti idrofili e idrofobici ed eluendo i peptidi purificati utilizzando soluzioni in kit.
- Essiccare i peptidi purificati in una velocità di vuoto a 45 °C per 45 minuti o fino a quando non sono asciutti.
NOTA: Evitare l'essiccazione eccessiva dei peptidi. - Conservare i campioni a -80 °C fino al momento del sequenziamento con spettrometria di massa.
- Aggiungere 17 μL di soluzione con carica LC ai peptidi essiccati.
- Lasciare i campioni in ghiaccio per 1 ora.
- Agitare brevemente i campioni e quindi sonicare in un bagno d'acqua a ultrasuoni per 5 minuti.
- Centrifugare i campioni con carico LC a 16.000 × g per 1 minuto, aspirare 15 μl dall'alto e separare in una nuova provetta.
5. Cromatografia liquida e sequenziamento con spettrometria di massa tandem
- Iniettare 2 μL di soluzione peptidica con carica LC su uno spettrometro di massa.
- Frazionare i peptidi utilizzando una configurazione a doppia colonna.
- Riscaldare la colonna a una temperatura costante di 45 °C.
- Eseguire il gradiente analitico a 300 nL/min dal 5% al 21% di solvente B (acetonitrile/0,1% di acido formico) per 60 minuti, seguito da 10 minuti di solvente B dal 21% al 30% e altri 10 minuti di un lavaggio con seghetto alternativo al 95%-5%.
- Impostare l'MS1 su una risoluzione di 120 K (tempo massimo di iniezione, 25 ms), sottoporre gli ioni precursori superiori (entro un tempo di ciclo di 3,0 s) a un'ampiezza di isolamento HCD di 1,2 m/z, esclusione dinamica abilitata (60 s) e impostare la risoluzione MS2 su 60 K (tempo massimo di iniezione, automatico; energia di collisione normalizzata, 24%, 26% e 28%).
- Impostare l'intervallo di acquisizione MS1 e MS2 rispettivamente su 400 m/z-1.200 m/z e 120 m/z-1.200 m/z.
6. Identificazione di peptidi/proteine
- Cercare gli spettri peptidici acquisiti con un software di ricerca proteomica utilizzando un algoritmo di ricerca commerciale su un database umano uniProt.
- Impostare l'enzima della digestione sulla tripsina e consentire fino a due scissioni mancate.
- Impostare la tolleranza del precursore su 10 ppm e la finestra di tolleranza del frammento su 0,02 Da.
- Impostare l'ossidazione della metionina e l'acetilazione N-terminale come modificazioni variabili e la carbamidometilazione della cisteina come modificazione fissa.
- Filtra i peptidi in base a una soglia del tasso di falsa scoperta (FDR) dell'1,0% calcolata dall'algoritmo Percolator.
- Considera unici solo i peptidi assegnati a un determinato gruppo proteico e non rilevati in nessun altro gruppo proteico e utilizzali per ulteriori analisi.
- Includere nelle analisi solo un minimo di due peptidi unici per ciascuna proteina.
- Massimizza gli ID con il rilevamento degli ioni precursori.
- Eseguire l'allineamento cromatografico con uno spostamento massimo del tempo di ritenzione di 10 minuti, una tolleranza di massa di 10 ppm e un rapporto segnale/rumore minimo di 5.
- Normalizza l'abbondanza di peptidi in base alla quantità totale di peptidi.
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Representative Results
Per convalidare il protocollo di pulizia (Figura 1), sono stati eseguiti due esperimenti. In primo luogo, il proteoma del "campione simulato" dalla provetta pulita è stato confrontato con il proteoma del campione EV di tessuto dall'uso iniziale della provetta per determinare il carryover delle proteine identificate. I cromatogrammi rappresentativi mostrano una riduzione dell'eterogeneità dei picchi dopo la pulizia delle provette (Figura 2). Nell'isolamento originale delle EV, sono state identificate 806 proteine con due o più peptidi unici. Dopo la pulizia, il numero di proteine identificate è stato ridotto del 98% a 19 proteine. Dodici proteine erano condivise in entrambi e sette proteine erano uniche per la provetta pulita (Figura 3A). Utilizzando una revisione della letteratura, è stato compilato un elenco di proteine EV caratteristiche come precedentemente pubblicato9. Delle 24 proteine EV caratteristiche elencate identificate nel campione originale, solo una è stata identificata dopo la pulizia (Tabella 1). Delle proteine condivise, MFGE8, una caratteristica proteina EV era la proteina più differenzialmente arricchita nel campione EV. In confronto, due proteine contaminanti, KRT14 e KRT5, erano le più differenzialmente arricchite nel campione post-pulito (Figura 3B).
Per confermare la rimozione delle proteine dalle provette dopo il lavaggio, è stato eseguito un gel SDS-PAGE con una curva standard BSA da 1 μg (tipica resa di isolamento delle vescicole extracellulari) a 16,5 ng, quindi ha riempito e pulito i pellet di vescicole extracellulari "finte" in triplicato. Tutte le bande di curva standard erano visibili, ma i campioni non lo erano, indicando la rimozione pulita di almeno il 98% delle proteine e nessuna differenza osservabile tra la provetta bianca e quella pulita (Figura 4A). Per valutare ulteriormente le proteine specifiche identificate nelle provette pulite rispetto a una provetta vuota mai utilizzata, è stato condotto un confronto diretto (N = 4, gruppo). I cromatogrammi delle provette bianche e pulite erano molto simili (Figura 4B). Nelle provette vuote mai utilizzate, sono state identificate 19 proteine. Allo stesso modo, nella provetta pulita, sono state identificate 20 proteine, di cui 18 condivise all'interno dei due gruppi (Figura 4C). Classificando tutte le proteine in base alla loro abbondanza, le proteine della cheratina contaminante KRT1, KRT9 e KRT10 sono le più abbondanti in entrambi i gruppi (Figura 4D). Nella provetta pulita è stata identificata una proteina EV caratteristica: la lattoderina (MFGE8). C'era un'elevata somiglianza tra le provette pulite e quelle vuote nel numero di eventi di sequenziamento MS2 innescati in ogni intervallo di tempo di ritenzione di 5 minuti (Figura 4E), il numero di peptidi sequenziati e la fiducia in cui sono stati sequenziati (Figura 4F), nonché un'ampia sovrapposizione tra i peptidi (Figura 4G). Nel loro insieme, questi risultati non indicano alcun impatto percepibile del riutilizzo delle provette con questo protocollo di pulizia sul proteoma.
Il monomero del policarbonato è 254,3 MH1+, che è al di sotto dell'intervallo di acquisizione MS1. I cromatogrammi sono stati valutati per la presenza di dimeri e trimeri carichi singolarmente, che non sono stati rilevati (dati non mostrati, N = 4).
Figura 1: Schema del protocollo di pulizia delle provette per ultracentrifuga in policarbonato. Abbreviazioni: UC = ultracentrifuga; SDS = sodio dodecil solfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Confronto rappresentativo del precedente proteoma del campione EV con il "campione simulato" della provetta pulita (N = 2). Abbreviazioni: EV = vescicola extracellulare; TIC-MS = cromatografia ionica totale-spettrometria di massa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto delle proteine identificate nel campione EV con il campione "simulato" ottenuto dalle provette pulite. (A) Identificazione delle proteine del diagramma di Venn nel precedente proteoma del campione EV con il "campione simulato" dalla provetta pulita (N = 2). (B) Arricchimento differenziale di proteine condivise classificate in base a una variazione logaritmica di 2 volte. Abbreviazione: EV = vescicola extracellulare, FC = cambio di piega Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Confronto tra provette vuote mai utilizzate e provette pulite. (A) È stato eseguito un gel SDS-PAGE con una curva standard BSA da 1 μg a 16,5 ng, quindi pellet EV "finti" in provetta vuota e pulita in triplice copia. (B) Cromatogrammi rappresentativi per provette bianche e pulite. (C) Diagramma di Venn delle proteine condivise o uniche da provette vuote e pulite (N = 4). (D) Tutte le proteine identificate in ciascun gruppo sono classificate in base all'abbondanza per (i) provette bianche e (ii) pulite. Vengono tracciati i valori mediani. (E) Istogramma di tutti gli eventi MS2 attivati per tempo di ritenzione sommato per gruppo (N = 4). (F) Numero di ID peptidici in ciascun gruppo per confidenza, dove i peptidi ad alta confidenza sono distinti dai peptidi abbinati all'interno del gruppo, dove l'affidabilità dell'identificazione è inferiore ma rafforzata dalla corrispondenza con altri spettri, media/SD. (G) Numero di peptidi unici e condivisi tra i gruppi. Abbreviazioni: EV = vescicola extracellulare; TIC-MS = cromatografia ionica totale-spettrometria di massa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Proteine EV caratteristiche trovate nell'analisi pre rispetto a quella post pulizia delle provette UC. Abbreviazioni: UC = ultracentrifuga; EV = vescicola extracellulare. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Qui descriviamo e convalidiamo un protocollo per la pulizia dei tubi UC in policarbonato per l'arricchimento di veicoli elettrici e applicazioni proteomiche. Abbiamo dimostrato il successo della rimozione della proteina residua dal precedente campione di provetta UC rispetto a un'analisi pseudo-pellet pulita al di sotto del limite di rilevamento di questo protocollo di acquisizione con spettrometria di massa e abbiamo mostrato la somiglianza proteomica della provetta UC vuota mai utilizzata rispetto agli pseudo pellet della provetta UC pulita.
In primo luogo, per prevenire l'adsorbimento involontario di proteine sulla parete interna del policarbonato, i tubi di UC sono stati immediatamente immersi in H2O10. Il lavaggio a mano dei tubi UC in policarbonato è raccomandato dai produttori11. Altri detergenti, come Lipsol, devono essere usati con cautela. È un detergente da laboratorio brevettato composto da una miscela di detergente, tensioattivo e agenti chelanti con un pH non neutro. Pertanto, per questa fase, è stato utilizzato un detergente compatibile con la spettrometria di massa, SDS allo 0,1%, e il lavaggio non è stato eseguito per più di 10 minuti11. Nella nostra esperienza, l'uso di strumenti per la pulizia delle setole può portare a graffi sul tubo se non si presta attenzione. Per mitigare potenziali graffi, che potrebbero fornire un serbatoio per le proteine residue, è stato utilizzato un batuffolo di cotone per pulire l'interno del tubo di policarbonato, con particolare attenzione all'area di formazione del pellet EV. La sterilizzazione ripetuta in autoclave può ridurre la durata del tubo in policarbonato11; invece, sono stati eseguiti tre brevi risciacqui con acqua calda. Va inoltre notato che sebbene i produttori suggeriscano metodi di sterilizzazione non termica, non viene descritta una temperatura specifica da evitare. I tubi devono essere sempre ispezionati per segni di deformazione o fessurazione prima del riutilizzo, secondo le raccomandazioni dei produttori. Si sconsiglia l'uso di sostanze infiammabili vicino a centrifughe in funzione; Pertanto, asciugiamo i tubi durante la notte dopo l'ultima fase di risciacquo con etanolo al 70%.
Non è stata osservata alcuna contaminazione significativa del polimero mediante valutazione manuale dei cromatogrammi. Non si prevede che la SDS degradi il policarbonato e brevi esposizioni all'acqua calda (<60 °C) non hanno alcun effetto, mentre esposizioni più lunghe lo fanno12. Inoltre, studi precedenti hanno indicato che le specie di policarbonato eluiscono in un tempo di ritenzione prima della raccolta in base al nostro gradiente di acetonitrile13. Anche se non possiamo essere certi che i polimeri non siano presenti, con i nostri metodi di acquisizione, siamo fiduciosi che il proteoma non sia sostanzialmente influenzato.
Quando si riutilizza il materiale di laboratorio per esperimenti di proteomica senza marcatura, è necessario considerare in modo specifico i contaminanti proteici residui dell'uso precedente. Inoltre, la proteomica delle vescicole extracellulari viene spesso condotta con campioni a resa molto bassa, che a volte producono quantità proteiche nell'intervallo <100 ng. Queste quantità di proteine iniziali sono adatte per la spettrometria di massa, ma aumentano sostanzialmente l'impatto che anche piccole quantità di proteine residue avranno sul proteoma complessivo. Data la sensibilità del sequenziamento avanzato della spettrometria di massa, verranno identificati i contaminanti derivanti dalla manipolazione e dalla produzione umana. In questo protocollo, mostriamo una sostanziale riduzione del numero di proteine identificate del 98% dopo la pulizia. Le proteine rimanenti sono state quasi esclusivamente condivise tra le provette vuote mai utilizzate e le provette pulite. Questi risultati suggeriscono che le proteine identificate erano contaminanti della preparazione proteomica stessa o elementi residui della produzione di tubi, non riporti dall'uso precedente. Di gran lunga, le tre proteine identificate più abbondanti per ordini di grandezza nelle provette vuote e pulite erano la cheratina umana di tipo I (KRT1, KRT10, KRT9), trovata nei capelli e nella pelle, generalmente riconosciuta in questi tipi di preparati come contaminanti da manipolazione umana (https://www.thegpm.org/crap/). Nove delle 18 proteine condivise erano altre cheratine. Tra i contaminanti umani riconosciuti è inclusa anche la dermcidina (DCD), una proteina presente nel sudore umano14. Altre proteine identificate si trovano anche nell'epidermide (CSTA15, HRNR16, FLG217) o precedentemente identificate negli acari della polvere (S100A7, S100A8, S100A9)18,19. Va notato che una componente sostanziale della "polvere" è la pelle umana20. Le due proteine uniche identificate nelle provette pulite sono state entrambe implicate nelle vescicole extracellulari, tuttavia, sono molto minori rispetto ad altre proteine EV identificate 1,21. Le proteine identificate nei campioni sono coerenti con la preparazione e indicano una sovrapposizione molto chiara tra provette bianche e pulite, supportando il riutilizzo.
Le vescicole extracellulari hanno un ruolo importante nei processi biologici, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la comunicazione cellula-cellula e la formazione di mineralizzazione biologica. Le vescicole extracellulari sono onnipresenti nel corpo umano e sono un'area in rapida crescita della scienza di base grazie al loro potenziale come biomarcatori, terapie e fonti di informazioni riguardanti la fisiopatologia. L'arricchimento di queste particelle per la sperimentazione utilizzando UC differenziale coinvolge tubi in policarbonato specializzati. L'uso e lo smaltimento unici di questi materiali termoplastici contribuiscono a maggiori costi sperimentali dei materiali di consumo e al carico globale di inquinamento da plastica. In questo articolo, abbiamo presentato e convalidato un protocollo per la pulizia e il riutilizzo di tubi UC in policarbonato per eseguire l'isolamento delle vescicole extracellulari adatto a esperimenti di proteomica. In definitiva, ciò ridurrà i rifiuti prodotti dai laboratori di veicoli elettrici e ridurrà i costi associati a tali esperimenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da una sovvenzione di ricerca del National Institutes of Health (NIH) R01HL147095, R01HL141917 e R01HL136431, Kowa Company, Ltd. e del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 101023041 (R. Cahalane). La Figura 1 è stata creata con Biorender.com. L'attuale protocollo di pulizia è stato sviluppato modificando un protocollo di pulizia del tubo raccomandato presentato alla Giornata dell'educazione (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) 2023 della Società internazionale delle vescicole extracellulari. Molte grazie alla dott.ssa Kathryn Howe e alla dott.ssa Sneha Raju dell'University Health Network (Università di Toronto, Canada) per i campioni originali di vescicole extracellulari del tessuto carotideo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube | Beckman Coulter Life Sciences | 355630 | uncapped ultracentrifuge tube(s) |
| 10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355603 | capped ultracentrifuge tube(s) |
| an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm | ThermoFisher Scientific | 164946 and ES902 | Dual column setup |
| Critical Swab Swab, Cotton Head | VWR | 89031-270 | cotton swab |
| Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. | ThermoFisher Scientific | BRE725533 | Mass spectrometer |
| Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022) | NA | NA | Human database |
| MilliQ water | water | ||
| PreOmics iST kit | PreOmics | P.O.00027 | commercial protein sample preparation kit |
| Proteome Discoverer package (PD, Version 2.5) | ThermoFisher Scientific | NA | Proteomic search software |
| SEQUEST-HT search algorithm | NA | NA | Search algorithm |
| Sodium Dodecyl Sulfate (20%) | Boston BioProducts | BM-230 | detergent |
References
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, e854347 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
- Lischnig, A., Bergqvist, M., Ochiya, T., Lässer, C. Quantitative proteomics identifies proteins enriched in large and small extracellular vesicles. Molecular & Cellular Proteomics. 21 (9), 100273 (2022).
- van Herwijnen, M. J. C., et al. Comprehensive proteomic analysis of human milk-derived extracellular vesicles unveils a novel functional proteome distinct from other milk components. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (11), 3412-3423 (2016).
- Blaser, M. C., et al. Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis. Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).
- Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic. PLOS ONE. 10 (5), e0122419 (2015).
- Use and care of centrifuge tubes and bottles. Beckman Coulter. , Available from: https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles (2014).
- R&D & Technology Department chemical resistance of polycarbonate products. PALRAM. , Available from: http://ilgbcatalog.org/wp-content/uploads/2015/02/PC-chemical-resistance.pdf (2015).
- Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Environmental Science & Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).
- Schittek, B., et al. Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands. Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).
- Blaydon, D. C., et al. Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion. American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).
- Henry, J., et al. Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes. FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).
- Bolling, M. C., et al. Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations. The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).
- Jin, S., et al. DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis. Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).
- Gläser, R., et al. The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption. Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).
- Molhave, L., et al. House dust in seven Danish offices. Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).
- Buschow, S. I., et al. MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis. Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).
