Summary
Ett detaljerat protokoll tillhandahålls för rengöring och återanvändning av ultracentrifugrör av polykarbonat för att utföra extracellulär vesikelisolering som är lämplig för proteomikexperiment.
Abstract
Engångsplast i laboratorier förvärrar föroreningskrisen och bidrar till kostnader för förbrukningsvaror. Vid isolering av extracellulära vesiklar (EV) används polykarbonatultracentrifugrör (UC) för att uthärda de tillhörande höga centrifugalkrafterna. EV-proteomik är ett område på frammarsch och validerade återanvändningsprotokoll för dessa rör saknas. Återanvändning av förbrukningsvaror för lågavkastande proteinisoleringsprotokoll och nedströms proteomik kräver reagenskompatibilitet med masspektroskopiförvärv, såsom frånvaro av kontaminering av syntetisk polymer från centrifugrör, och tillräcklig avlägsnande av kvarvarande proteiner.
Detta protokoll beskriver och validerar en metod för rengöring av UC-rör av polykarbonat för återanvändning i EV-proteomikexperiment. Rengöringsprocessen innebär omedelbar nedsänkning av UC-rör i H2O för att förhindra torkning av protein, tvätt i 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) tvättmedel, sköljning i varmt kranvatten, avmineraliserat vatten och 70 % etanol. För att validera protokollet för återanvändning av UC-rör för nedströms EV-proteomik erhölls använda rör efter ett experiment där EV isolerades från kardiovaskulär vävnad med hjälp av differentiell UC och densitetsgradientseparation. Rören rengjordes och den experimentella processen upprepades utan EV-prover, där man jämförde blanka, aldrig använda UC-rör med rengjorda UC-rör. De pseudo-EV-pellets som erhölls från isoleringsprocedurerna lyserades och förbereddes för vätskekromatografi-tandem-masspektrometri med hjälp av ett kommersiellt proteinprovberedningskit med modifieringar för proteinprover med låg förekomst.
Efter rengöring minskade antalet identifierade proteiner med 98 % i pseudopelleten jämfört med det tidigare EV-isoleringsprovet från samma rör. En jämförelse mellan ett rengjort rör och ett blankt rör visade att båda proverna innehöll ett mycket litet antal proteiner (≤20) med 86 % likhet. Frånvaron av polymertoppar i kromatogrammen i de rengjorda rören bekräftades. I slutändan kommer valideringen av ett UC-rörrengöringsprotokoll som är lämpligt för anrikning av elfordon att minska avfallet som produceras av elbilslaboratorier och sänka de experimentella kostnaderna.
Introduction
Extracellulära vesiklar (EV) är lipid-dubbelskiktsavgränsade partiklar som frigörs från celler som bär biologiskt aktiv last, såsom protein, och deltar i olika biologiska processer, inklusive cell-cellkommunikation och bildandet av biologisk mineralisering1. Dessa partiklar finns i alla kroppsvätskor och vävnader, och deras biologiska aktiviteter och användningsområden är ett snabbt utvecklande område för vetenskaplig forskning. Isolering och validering av dessa nanopartiklar innebär olika utmaningar på grund av deras ringa storlek och biolikhet med andra partiklar, såsom liposomer och proteinaggregat. De senaste riktlinjerna från International Society of Extracellular Vesicles, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), är den erkända standarden för vetenskaplig forskning om EV2.
Olika metoder, ofta tillsammans, måste användas för EV-isolering beroende på uppströmskällan och nedströmsapplikationerna. Från och med 2015 var den vanligaste primära isoleringsmetoden för EV differentiell ultracentrifugering (UC)2. I princip separerar initial centrifugering med lägre hastighet större eller tätare oönskade komponenter, såsom celler och cellskräp, vilket lämnar EV:er i supernatanten. Därefter använder UC mycket hög centrifugalkraft för att pelletera ut och därmed separera och rena EV från andra partiklar som är mindre eller mindre täta men som också kan innehålla täta icke-EV-partiklar. De flesta protokoll använder ofta, i ett eller annat steg, UC för att isolera elfordon från en vätska3. Vidare används UC i andra metoder för EV-isolering, såsom densitetsgradientultracentrifugering (DGUC), som använder medier som OptiprepTM jodixanol och centrifugalkraft för att separera EV enligt deras flytande densitet4. Det finns andra metoder för EV-isolering3.
Med tanke på den snabbt växande förståelsen av de biologiska processer som dikteras av EV och deras potential som biomarkörer och information om patofysiologi, har upptäcktsbaserade analyser som proteomik fått dragkraft 5,6,7,8. EV är små och, beroende på källa, har de ett lågt utbyte av protein (<1 μg) jämfört med helvävnads- eller celllysat. Isolering av EV för proteomikanalys kräver särskilda överväganden, såsom avlägsnande av icke-EV-proteinföroreningar från uppströms vätska eller vävnad, övervägande av EV-proteinnedbrytning under isoleringsprocessen och användning av metoder som skapar proteinlösningar som är kemiskt kompatibla med peptidberedning och masspektrometrianalyser.
Förbrukningsvaror för forskningslaboratorier är ofta av plast och engångsartiklar. Dessa engångsmaterial bidrar till den globala plastföroreningskrisen och kostnaderna för förbrukningsvaror. Specialiserade UC-rör av polykarbonat och polystyren är designade för att motstå de höga centrifugalkrafter som krävs för att pelletera elbilar i laboratorieapplikationer. Även om det är möjligt att sterilisera och desinficera UC-rör för återanvändning, kräver proteomisk analys, särskilt de med lågt proteinutbyte som EVs, särskild uppmärksamhet. Det är inte bara av största vikt att avlägsna restprotein från tidigare användning, utan även kemisk kompatibilitet med masspektroskopi och plastbaserad polymerkontaminering måste beaktas.
Här presenterar vi ett rengöringsprotokoll för polykarbonatrör med rengöringsmedel som är lämpliga för masspektrometri och utför experiment för att validera dess framgångsrika avlägsnande av kvarvarande protein under detektionsgränserna och brist på detekterbara polymerföroreningar. För att validera rengöringsprotokollet för EV-proteomikapplikationer med både UC- och DGUC-ändamål erhöll vi rör från isoleringar av EV i mänsklig vaskulaturvävnad med ett kombinerat UC- och DGUC-protokoll. Rören rengjordes med hjälp av det beskrivna protokollet, och den experimentella processen upprepades utan prover som jämförde en tom aldrig använd UC-slang och en rengjord UC-slang. I slutändan kommer valideringen av ett UC-rörrengöringsprotokoll som är lämpligt för berikning av elfordon att minska avfallet som produceras av elbilslaboratorier och sänka kostnaderna för sådana experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rengöring av rör
OBS: EV-isoleringsproceduren använder både täckta och otäckta UC-rör av polykarbonat (detaljerad nedan). Samma procedur följdes för både lock och otäckta rör. När det gäller rör med lock rengjordes lockets delar individuellt och sattes ihop igen efter torkning och förlagring.
- Efter den första användningen av polykarbonatrören och avlägsnandet av provet, sänk omedelbart ner UC-rören i kranvatten för att förhindra torkning av provet till sidan av röret.
- Överför och sänk ner rören i 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) i kranvatten i 10 minuter.
- Ett rör i taget, dekantera det mesta, men inte allt, av SDS-lösningen från röret och använd en bomullspinne för att noggrant torka av området på röret där EV-pelleten var placerad.
OBS: Använd inte något med borst. Detta protokoll använde vanliga bomullspinnar; Specialiserade, lågluddiga bomullspinnar kan dock användas för att rengöra rören. - Skölj minst 3 gånger med varmt kranvatten (~50 °C). Se till att fylla och dekantera röret helt.
- Skölj 1x med avmineraliserat vatten med en sprayflaska eller en tvättflaska med smal mun.
- Skölj 1x med 70% etanol med hjälp av en sprayflaska.
- Lämna röret upp och ner för att torka.
OBS: Rörställ för fluorescensaktiverad cellsortering fungerar bra för torkning av UC-rören. - Lägg de helt torkade rören i en ren burk; De är redo att återanvändas.
OBS: För närvarande är protokollet validerat för återanvändning upp till 2x.
2. Berikning av elfordon
OBS: Följande EV-isolerings- och proteomikprotokoll användes för både den ursprungliga EV-vävnadsisoleringen, såväl som "mock samples" som användes för att erhålla blank (aldrig använt) och rengjort rörprover. De ursprungliga proverna var resuspenderade vävnadsinstängda EV från karotisplack från patienter som genomgick karotisendarterektomi. Kirurgiska prover samlades in från University Health Network (Toronto, Kanada) och godkändes av den institutionella etiska kommittén. Alla patienter gav informerat samtycke till provtagning och dataanalys, i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Proverna var pseudopellets som erhölls genom att behandla tomma och rengjorda rör med samma lösningar och bearbetningsteg som EV-isoleringsprover.
- Avfrosta EV-prover eller låtsasprover i PBS på is.
- Gör NTE-buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) och sterilt filter.
- Snurra proverna vid 10 000 × g i 10 minuter vid 4 °C.
- Flytta supernatanten till ett 1 ml polykarbonatrör med öppen topp.
- Centrifugera supernatanten vid 100 000× g i 1 timme vid 4 °C.
- Återsuspendera pelleten i 150 μl sterilfiltrerad NTE-buffert med proteashämmare.
- Överför till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt NTE-buffert för att nå en total provvolym på 1,5 ml.
- Förvara proverna på is.
3. Förberedelse av densitetsgradienter och densitetsgradientseparation
OBS: Detta EV-isoleringsprotokoll har tidigare beskrivits av Blaser et al.9 I korthet:
- Bered fem lösningar av jodixanol densitetsgradientmedium (10 %, 15 %, 20 %, 25 % och 30 %) med NTE-buffert som spädningsmedel.
- Skikta de fem densitetslösningarna sekventiellt i täckta ultracentrifugrör med 30 % i botten och 10 % i toppen.
- Fäst locken på röret/rören och flytta försiktigt till ett stabilt horisontellt läge i 1 timme vid rumstemperatur.
- Efter 1 timme, flytta röret/rören försiktigt till vertikalt läge på isen i 30 minuter för att kyla gradienten.
- Tillsätt 1,5 ml av provet eller provet (NTE-buffert) till toppen av de förberedda densitetsgradientrören.
- Ultracentrifugrör vid 250 000 × g i 40 minuter vid 4 °C.
- Ta bort de översta fraktionerna av densitetsgradienten (2.4 ml) till ultracentrifugrören utan lock. Fyll på till 9 ml med sterilfiltrerad NTE-buffert.
- Pelletera EV:erna genom ultracentrifugering vid 100 000 × g i 1 timme vid 4 °C.
OBS: Ringa in platsen för den synliga EV-pelleten eller den förväntade platsen med en markör. Detta gör att du kan rengöra området på pelleten med pinnen direkt. - Aspirera supernatanten samtidigt som du flyttar tuben till ett upp och nedvänt läge i 3 minuter. Ta bort de återstående dropparna med en bomullspinne innan du vänder röret med rätt sida upp.
- Återsuspendera EV-pelleten i 12 μL lysbuffert i den refererade satsen.
4. Peptidberedning för proteomik
OBS: Proteomikprovberedning utfördes enligt kitprotokollet med interna modifieringar för proteinprover med låg förekomst. Det modifierade protokollet är som följer:
- Lyse, denaturera, reduktera och alkylera proverna genom upphettning i lysebuffert vid 95 °C i 10 minuter.
- Smält proverna med Lys-C/trypsin-uppslutningslösningen i 2 timmar vid 37 °C med 10 μl lyslösning från provet och 10 μl uppslutningslösning.
- Rena peptider genom en patron genom att tvätta ut hydrofila och hydrofoba föroreningar och eluera ut renade peptider med hjälp av kitlösningar.
- Torka de renade peptiderna i ett vakuum vid 45 °C i 45 minuter eller tills de är torra.
OBS: Undvik övertorkning av peptiderna. - Förvara proverna vid -80 °C fram till tidpunkten för masspektrometrisekvensering.
- Tillsätt 17 μL LC-loadlösning till de torkade peptiderna.
- Låt proverna ligga på is i 1 timme.
- Vred proverna kort och sonikera sedan i ett ultraljudsvattenbad i 5 minuter.
- Centrifugera LC-belastningsproverna vid 16 000 × g i 1 minut, aspirera 15 μL från toppen och separera i ett nytt rör.
5. Vätskekromatografi och tandemmasspektrometrisekvensering
- Injicera 2 μl LC-load peptidlösning i en masspektrometer.
- Fraktionera peptiderna med hjälp av en dubbelkolonnuppsättning.
- Värm kolonnen till en konstant temperatur på 45 °C.
- Kör den analytiska gradienten vid 300 nL/min från 5 % till 21 % lösningsmedel B (acetonitril/0,1 % myrsyra) i 60 minuter, följt av 10 minuter med 21 % till 30 % lösningsmedel B, och ytterligare 10 minuter med en 95-5 % sticksågstvätt.
- Ställ in MS1 på 120 K upplösning (maximal injektionstid, 25 ms), underställ de övre prekursorjonerna (inom en cykeltid på 3,0 s) på HCD-isoleringsbredden 1,2 m/z, dynamisk uteslutning aktiverad (60 s), och ställ in MS2-upplösningen på 60 K (maximal injektionstid, auto; normaliserad kollisionsenergi, 24 %, 26 % och 28 %).
- Ställ in exponeringsområdet MS1 och MS2 på 400 m/z-1 200 m/z respektive 120 m/z-1 200 m/z.
6. Identifiering av peptider/proteiner
- Sök igenom de förvärvade peptidspektra med en proteomisk sökprogramvara med hjälp av en kommersiell sökalgoritm mot en human uniProt-databas.
- Ställ in matsmältningsenzymet på trypsin och tillåt upp till två missade klyvningar.
- Ange prekursortoleransen till 10 ppm och fragmenttoleransfönstret till 0,02 Da.
- Ställ metioninoxidation och N-terminal acetylering som variabla modifieringar och cysteinkarbamidometylering som fast modifiering.
- Filtrera peptiderna baserat på en tröskel för falsk upptäcktsfrekvens (FDR) på 1,0 % som beräknats av Percolator-algoritmen.
- Betrakta endast peptider som tillhör en viss proteingrupp och som inte detekteras i någon annan proteingrupp som unika och använd dem för vidare analyser.
- Inkludera endast minst två unika peptider för varje protein i analyserna.
- Maximera ID:n med identifiering av föregångsjoner.
- Utför kromatografisk justering med en maximal kvarhållningstidsförskjutning på 10 minuter, masstolerans på 10 ppm och signal-till-brus på minst 5.
- Normalisera peptidöverflödet med den totala peptidmängden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att validera rengöringsprotokollet (figur 1) utfördes två experiment. Först jämfördes proteomet i "skenprovet" från det rengjorda röret med proteomet i vävnadens EV-prov från rörets initiala användning för att bestämma överföringen av identifierade proteiner. Representativa kromatogram visar en minskning av maximal heterogenitet efter rengöring av rören (figur 2). I den ursprungliga EV-isoleringen identifierades 806 proteiner med två eller flera unika peptider. Efter rengöring minskade antalet identifierade proteiner med 98 % till 19 proteiner. Tolv proteiner delades i båda, och sju proteiner var unika för det rengjorda röret (Figur 3A). Med hjälp av en litteraturstudie sammanställdes en lista över karakteristiska EV-proteiner som tidigare publicerats9. Av de listade 24 karakteristiska EV-proteinerna som identifierades i det ursprungliga provet, identifierades endast ett efter rengöring (tabell 1). Av de gemensamma proteinerna var MFGE8, ett karakteristiskt EV-protein, det mest differentiellt berikade proteinet i EV-provet. I jämförelse var två kontaminerande proteiner, KRT14 och KRT5, de mest differentiellt anrikade i det efterrengjorda provet (Figur 3B).
För att bekräfta avlägsnandet av protein från rören efter tvätt utfördes en SDS-PAGE-gel med en BSA-standardkurva från 1 μg (typisk låg ände av EV-isoleringsutbyte) till 16,5 ng, och sedan blanka och rengjorda tub "mock" EV-pellets i tre exemplar. Alla standardkurvband var synliga men proverna var inte synliga, vilket tyder på att minst 98 % av proteinet hade avlägsnats från rengöring och att det inte fanns någon märkbar skillnad mellan det blanka och det rengjorda röret (figur 4A). För att ytterligare bedöma de specifika proteiner som identifierades i de rengjorda rören jämfört med ett tomt oanvänt rör, genomfördes en direkt jämförelse (N = 4, grupp). Kromatogrammen för de blanka och rengjorda rören var mycket lika (Figur 4B). I de tomma rören som aldrig använts identifierades 19 proteiner. På samma sätt identifierades 20 proteiner i det rengjorda röret, varav 18 delades inom de två grupperna (Figur 4C). Om man rangordnar alla proteiner efter deras förekomst är de förorenande keratinproteinerna KRT1, KRT9 och KRT10 de vanligast förekommande i båda grupperna (Figur 4D). I det rengjorda röret identifierades ett karakteristiskt EV-protein: laktadherin (MFGE8). Det fanns hög likhet mellan de rena kontra blanka rören i antalet utlösta MS2-sekvenseringshändelser vid varje 5 minuters retentionstidsintervall (Figur 4E), antalet peptider som sekvenserades och konfidensen i vilken de sekvenserades (Figur 4F), samt stor överlappning mellan peptiderna (Figur 4G). Sammantaget indikerar dessa resultat ingen märkbar effekt av återanvändning av tuben med detta rengöringsprotokoll på proteomet.
Monomeren av polykarbonat är 254,3 MH1+, vilket är under MS1-insamlingsintervallet. Kromatogram bedömdes med avseende på förekomst av ensamt laddade dimerer och trimerer, vilka inte detekterades (data visas inte, N = 4).
Figur 1: Schematisk schema för rengöringsprotokoll för ultracentrifugrör av polykarbonat. Förkortningar: UC = ultracentrifug; SDS = natriumdodecylsulfat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ jämförelse av det tidigare EV-provproteomet med "mock-provet" från det rengjorda röret (N = 2). Förkortningar: EV = extracellulär vesikel; TIC-MS = total jonkromatografi-masspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Jämförelse av proteiner som identifierats i EV-provet med "mock"-provet som erhållits från de rengjorda rören. (A) Venndiagram proteinidentifieringar i det föregående EV-provproteomet med "mock-provet" från det rengjorda röret (N = 2). (B) Differentiell anrikning av delade proteiner rangordnad efter log 2-faldig förändring. Förkortning: EV = extracellulär vesikel, FC = veckförändring Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Jämförelse av tomma aldrig använda tuber och rengjorda tuber. (A) En SDS-PAGE gel utfördes med en BSA-standardkurva från 1 μg till 16,5 ng, och sedan blanka och rengjorda tuber "mock" EV-pellets i tre exemplar. B) Representativa kromatogram för blanka och rengjorda rör. C) Venndiagram över gemensamma eller unika proteiner från blanka och rengjorda rör (N = 4). D) Alla proteiner som identifierats i varje grupp rangordnas efter förekomst för i) blanka och ii) rengjorda rör. Medianvärden ritas ut. (E) Histogram för alla utlösta MS2-händelser efter retentionstid summerad per grupp (N = 4). (F) Antal peptid-ID i varje grupp baserat på konfidens, där peptider med hög konfidens skiljer sig från intragruppmatchade peptider, där identifieringskondensen är lägre men förstärks av matchning med andra spektra, medelvärde/SD. (G) Antal unika och delade peptider mellan grupper. Förkortningar: EV = extracellulär vesikel; TIC-MS = total jonkromatografi-masspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Karakteristiska EV-proteiner funna i analys av rengöring av UC-rör före kontra efter detta. Förkortningar: UC = ultracentrifug; EV = extracellulär vesikel. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver och validerar vi ett protokoll för rengöring av UC-rör av polykarbonat för EV-anrikning och proteomikapplikationer. Vi demonstrerade det framgångsrika avlägsnandet av kvarvarande protein från det tidigare UC-rörprovet jämfört med en rengjord pseudo-pelletsanalys under detektionsgränsen för detta masspektrometriförvärvsprotokoll och visade den proteomiska likheten mellan blankt, aldrig använt UC-rör jämfört med rengjorda UC-rörets pseudopellets.
För det första, för att förhindra oavsiktlig adsorption av protein till den inre polykarbonatväggen, sänktes UC-rör omedelbart ner i H2O10. Handtvätt av UC-rör av polykarbonat rekommenderas av tillverkarna11. Andra rengöringsmedel, som Lipsol, bör användas med försiktighet. Det är ett proprietärt laboratorierengöringsmedel som består av en blandning av tvättmedel, ytaktiva ämnen och kelatbildare med ett icke-neutralt pH. Därför användes för detta steg ett masspektrometrikompatibelt tvättmedel, 0,1 % SDS, och tvätt utfördes inte i mer än 10 minuter11. Enligt vår erfarenhet kan användning av borstrengöringsverktyg leda till repor på röret om försiktighet inte vidtas. För att mildra potentiella repor, som kan ge en reservoar för kvarvarande protein, användes en bomullspinne för att torka av insidan av polykarbonatröret, med fokus på området för EV-pelletsbildning. Upprepad autoklavering kan minska polykarbonatrörets livslängd11; Istället utfördes tre korta varmvattensköljningar. Det bör också noteras att även om tillverkarna föreslår icke-termiska steriliseringsmetoder, beskrivs inte en specifik temperatur som ska undvikas. Rör bör alltid inspekteras för tecken på deformation eller sprickbildning innan de används igen, enligt tillverkarens rekommendationer. Brandfarliga ämnen rekommenderas inte att användas nära centrifuger i drift; Således torkar vi rören över natten efter det sista 70% etanolsköljningssteget.
Ingen signifikant polymerkontaminering observerades vid manuell bedömning av kromatogram. SDS förväntas inte bryta ned polykarbonat, och kortvarig exponering för varmt vatten (<60 °C) har ingen effekt, medan längre exponeringar gördet. Vidare har tidigare studier indikerat att polykarbonatarter eluerar vid en retentionstid före insamling baserat på vår acetonitrilgradient13. Även om vi inte kan vara säkra på att polymerer inte är närvarande, är vi med våra insamlingsmetoder övertygade om att proteomet inte påverkas väsentligt.
Vid återanvändning av laboratorieutrustning för etikettfria proteomikexperiment måste kvarvarande proteinföroreningar från tidigare användning beaktas specifikt. Vidare utförs EV-proteomik ofta med mycket lågavkastande prover, ibland med proteinmängder i intervallet <100 ng. Dessa mängder startprotein är lämpliga för masspektrometri men ökar avsevärt den inverkan även små mängder kvarvarande protein kommer att ha på det totala proteomet. Med tanke på känsligheten hos avancerad masspektrometrisekvensering kommer föroreningar från mänsklig hantering och tillverkning att identifieras. I detta protokoll visar vi en betydande minskning av antalet identifierade proteiner med 98% efter rengöring. De återstående proteinerna delades nästan uteslutande mellan de blanka, aldrig använda rören och de rena rören. Dessa resultat tyder på att de identifierade proteinerna var föroreningar från själva proteomikpreparatet eller restelement från rörtillverkning, inte överföring från den tidigare användningen. De överlägset vanligaste tre identifierade proteinerna i storleksordning i de blanka och rengjorda rören var humant keratin typ I (KRT1, KRT10, KRT9), som finns i hår och hud, allmänt erkänt i dessa typer av preparat som föroreningar från mänsklig hantering (https://www.thegpm.org/crap/). Nio av de gemensamma 18 proteinerna var andra keratiner. Som en erkänd mänsklig förorening ingår också dermcidin (DCD), ett protein som finns i mänsklig svett14. Andra identifierade proteiner finns också i epidermis (CSTA15, HRNR16, FLG217) eller tidigare identifierade i dammkvalster (S100A7, S100A8, S100A9)18,19. Det bör noteras att en betydande del av "damm" är mänsklig hud20. De två unika proteiner som identifierats i de rengjorda rören har båda varit inblandade i EVs, men är mycket små jämfört med andra identifierade EV-proteiner 1,21. De proteiner som identifierats i proverna överensstämmer med beredningen och indikerar en mycket tydlig överlappning mellan tomma och rengjorda rör, vilket stöder återanvändning.
EV har en viktig roll i biologiska processer, inklusive men inte begränsat till cell-cellkommunikation och bildandet av biologisk mineralisering. EV är allestädes närvarande i människokroppen och är ett snabbt växande område inom grundvetenskapen på grund av deras potential som biomarkörer, terapier och informationskällor om (pato)fysiologi. Att berika dessa partiklar för experiment med differentiell UC involverar specialiserade polykarbonatrör. Engångsanvändning och bortskaffande av dessa termoplaster bidrar till högre kostnader för experimentella förbrukningsvaror och den globala plastföroreningsbördan. Häri presenterade och validerade vi ett protokoll för rengöring och återanvändning av UC-rör av polykarbonat för att utföra EV-isolering som är lämplig för proteomikexperiment. I slutändan kommer detta att minska avfallet som produceras av EV-laboratorier och sänka kostnaderna för sådana experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att uppge.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av ett forskningsbidrag från National Institutes of Health (NIH) R01HL147095, R01HL141917 och R01HL136431, Kowa Company, Ltd., och EU:s Horizon 2020 Research and Innovation Program inom ramen för Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement No. 101023041 (R. Cahalane). Figur 1 skapades med Biorender.com. Det nuvarande rengöringsprotokollet utvecklades genom att modifiera ett rekommenderat rengöringsprotokoll för rör som presenterades vid International Society of Extracellular Vesicles 2023 Education Day (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI). Stort tack till Dr. Kathryn Howe och Dr. Sneha Raju från University Health Network (University of Toronto, Kanada) för de ursprungliga EV-proverna av karotisvävnad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube | Beckman Coulter Life Sciences | 355630 | uncapped ultracentrifuge tube(s) |
| 10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355603 | capped ultracentrifuge tube(s) |
| an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm | ThermoFisher Scientific | 164946 and ES902 | Dual column setup |
| Critical Swab Swab, Cotton Head | VWR | 89031-270 | cotton swab |
| Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. | ThermoFisher Scientific | BRE725533 | Mass spectrometer |
| Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022) | NA | NA | Human database |
| MilliQ water | water | ||
| PreOmics iST kit | PreOmics | P.O.00027 | commercial protein sample preparation kit |
| Proteome Discoverer package (PD, Version 2.5) | ThermoFisher Scientific | NA | Proteomic search software |
| SEQUEST-HT search algorithm | NA | NA | Search algorithm |
| Sodium Dodecyl Sulfate (20%) | Boston BioProducts | BM-230 | detergent |
References
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, e854347 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
- Lischnig, A., Bergqvist, M., Ochiya, T., Lässer, C. Quantitative proteomics identifies proteins enriched in large and small extracellular vesicles. Molecular & Cellular Proteomics. 21 (9), 100273 (2022).
- van Herwijnen, M. J. C., et al. Comprehensive proteomic analysis of human milk-derived extracellular vesicles unveils a novel functional proteome distinct from other milk components. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (11), 3412-3423 (2016).
- Blaser, M. C., et al. Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis. Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).
- Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic. PLOS ONE. 10 (5), e0122419 (2015).
- Use and care of centrifuge tubes and bottles. Beckman Coulter. , Available from: https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles (2014).
- R&D & Technology Department chemical resistance of polycarbonate products. PALRAM. , Available from: http://ilgbcatalog.org/wp-content/uploads/2015/02/PC-chemical-resistance.pdf (2015).
- Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Environmental Science & Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).
- Schittek, B., et al. Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands. Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).
- Blaydon, D. C., et al. Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion. American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).
- Henry, J., et al. Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes. FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).
- Bolling, M. C., et al. Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations. The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).
- Jin, S., et al. DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis. Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).
- Gläser, R., et al. The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption. Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).
- Molhave, L., et al. House dust in seven Danish offices. Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).
- Buschow, S. I., et al. MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis. Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).
