JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Immunologie et infection

Levende calciumbilleddannelse af virusinficerede humane tarmorganoidmonolag ved hjælp af genetisk kodede calciumindikatorer

Published: January 19, 2024
doi:
10.3791/66132
, , ,
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research, Department of Molecular Virology and Microbiology,Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver en tilgang til udførelse af calciumbilleddannelse i virusinficerede humane tarmorganoider og tilbyder en tilgang til analyse.

Abstract

Calciumsignalering er en integreret regulator af næsten alle væv. Inden for tarmepitelet er calcium involveret i reguleringen af sekretorisk aktivitet, actindynamik, inflammatoriske reaktioner, stamcelleproliferation og mange andre ukarakteriserede cellulære funktioner. Som sådan kan kortlægning af calciumsignaldynamik i tarmepitelet give indsigt i homeostatiske cellulære processer og afsløre unikke reaktioner på forskellige stimuli. Humane tarmorganoider (HIO’er) er en højkapacitetsmodel, der er afledt af mennesker, til at studere tarmepitelet og repræsenterer således et nyttigt system til at undersøge calciumdynamikken. Dette papir beskriver en protokol til stabilt at transducere HIO’er med genetisk kodede calciumindikatorer (GECI’er), udføre levende fluorescensmikroskopi og analysere billeddannelsesdata for meningsfuldt at karakterisere calciumsignaler. Som et repræsentativt eksempel blev 3-dimensionelle HIO’er transduceret med lentivirus for stabilt at udtrykke GCaMP6’er, en grøn fluorescerende proteinbaseret cytosolisk GECI. De konstruerede HIO’er blev derefter spredt i en enkeltcellesuspension og podet som monolag. Efter differentiering blev HIO-monolagene inficeret med rotavirus og/eller behandlet med lægemidler, der vides at stimulere et calciumrespons. Et epifluorescensmikroskop udstyret med et temperaturstyret, befugtet levende billeddannelseskammer tillod langtidsbilleddannelse af inficerede eller lægemiddelbehandlede monolag. Efter billeddannelse blev erhvervede billeder analyseret ved hjælp af den frit tilgængelige analysesoftware, ImageJ. Samlet set etablerer dette arbejde en tilpasningsdygtig pipeline til karakterisering af cellulær signalering i HIO’er.

Introduction

Calcium er en bredt bevaret anden budbringer, der spiller en kritisk rolle i reguleringen af cellulær fysiologi1. På grund af sin stærke ladning, lille størrelse og høje opløselighed under fysiologiske forhold er calcium en ideel manipulator af proteinkonformation. Dette gør calcium til et kraftfuldt middel til at transducere elektrokemiske signaler til enzymatiske, transkriptionelle eller posttranskriptionelle ændringer. De strenge calciumkoncentrationsgradienter over det endoplasmatiske retikulum (ER) og plasmamembraner skaber en høj drivkraft, der muliggør hurtige ændringer i cytosolisk calciumkoncentration. Flere mekanismer, herunder både buffering og aktiv transport, opretholder denne gradient tæt. Selvom det er nødvendigt for normale cellulære funktioner, er denne vedligeholdelse energisk dyr, hvilket gør den særlig modtagelig i stresstilstande 2.

Som sådan er dysregulering af calcium i cytosolen et næsten universelt signal om mange slags cellulær stress. Metaboliske forstyrrelser, toksiner, patogener, mekaniske skader og genetiske forstyrrelser kan alle forstyrre calciumsignalering. Uanset stimulus kan vedvarende, ukontrollerede stigninger i cytosolisk calcium på helcelleniveau fremme apoptose og til sidst nekrose 3,4. Ændringer i cytosoliske calciumniveauer med lavere amplitude eller højere frekvens har imidlertid varierende virkninger2. Ligeledes kan resultaterne af calciumfluktuationer variere baseret på det rumlige mikrodomæne, hvor de forekommer5. Overvågning af calciumniveauer kan derfor give indsigt i dynamiske signalprocesser, men dette kræver prøveudtagning med relativt høj tidsmæssig og rumlig opløsning.

Genetisk kodede calciumindikatorer (GECI’er) er effektive værktøjer til kontinuerlig prøveudtagning i levende cellesystemer6. Nogle af de mest anvendte GECI’er er GFP-baserede calcium-responsive fluorescerende proteiner kendt som GCaMPs7. Den kanoniske GCaMP er en fusion af tre forskellige proteindomæner: en cirkulært permuteret GFP (cpGFP), calmodulin og M136. Calmodulindomænet gennemgår en konformationsændring ved binding af calcium, hvilket tillader dets interaktion med M13. Calmodulin-M13-interaktionen inducerer en konformationsændring i cpGFP, der øger dens fluorescerende emission ved excitation. Som sådan korrelerer en stigning i calciumkoncentration med en stigning i GCaMP-fluorescensintensitet. Disse sensorer kan være cytosoliske eller målrettet mod specifikke organeller8.

I lighed med de fleste væv regulerer calcium en række funktioner i mave-tarmepitelet. Tarmepitelet er integreret for næringsstof- og væskeabsorption, men skal også danne en tæt barriere og immungrænseflade for at undgå patogeninvasion eller giftige fornærmelser. Calciumafhængige veje påvirker næsten alle disse vitale funktioner 9,10,11. Imidlertid forbliver calciumsignalering i tarmepitelet en underudforsket grænse med lovende potentiale som et terapeutisk mål. Mens overvågning af calciumdynamikken i tarmepitelet in vivo fortsat giver udfordringer, tilbyder humane tarmorganoider (HIO’er) et tilpasningsdygtigt ex vivo-system til eksperimenter12. HIO’er er 3-dimensionelle (3D) sfæroider afledt af humane tarmstamceller og rekapitulerer efter differentiering meget af den cellulære mangfoldighed af det indfødte tarmepitel12.

Denne protokol beskriver omfattende metoder til at konstruere HIO’er, der udtrykker GECI’er og derefter forberede konstruerede HIO’er som monolag til levende celle calciumbilleddannelse. Det tilbyder virusinfektion som et eksempel på en patologisk manipulation, der forstyrrer calciumsignalering og giver en analytisk tilgang til kvantificering af disse ændringer.

Protocol

Alle de humane tarmorganoider (HIO’er), der anvendes i denne protokol, og de repræsentative eksperimenter blev afledt af humant væv opnået og vedligeholdt af Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Alle prøver blev indsamlet i overensstemmelse med en protokol godkendt af Institutional Review Board ved Baylor College of Medicine. 1. Fremstilling af materialer og reagenser Til organoid vedligeholdelse samles cellekulturbehandlede 24-brøndplader, kæ…

Representative Results

Figur 1A viser en BMM-kuppel indeholdende 3-dimensionelle humane tarmorganoider, der er blevet transduceret for stabilt at udtrykke GCaMP6’er. Figur 1B viser den samme linje af organoid forgyldt som et monolag ved 24, 48 og 72 timer efter såning. For at validere funktionen af GCaMP6s blev monolaget afbildet ved fluorescensmikroskopi hver 2. s i 4 minutter, og 100 nM ADP blev tilføjet til medierne efter ~ 20 s. ADP fremkalder calciumfrigivelse fra det endoplasm…

Discussion

Ændringer i cytosoliske Ca2+ niveauer kan være både en årsag og virkning af patologier i epitelet 10,16,17. Stigninger i cytosolisk calcium kan direkte drive sekretion via aktivering af den calciumafhængige chloridkanal TMEM16A18,19. Aktivering af TMEM16A som reaktion på Ca2+ muliggør apikal udstrømning af chlorid og etablerer en osmotisk gr…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af tilskud R01DK115507 og R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) fra National Institutes of Health (NIH). Praktikantstøtte blev ydet af NIH-tilskud F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) og F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Vi vil gerne takke Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core for at levere organoid vedligeholdelsesmedier.

Materials

Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
[Leu15]-Gastrin I Sigma-Aldrich G9145
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
1.5mL microcentrifuge tubes Fisherbrand 5408137
15mL conical tubes Thermofisher Scientific 0553859A
16% formaldehyde Thermofisher Scientific 28906
1M HEPES Gibco 15630080
1M HEPES Gibco 15630080
1X PBS Corning  21-040-CV
25 gauge needle Thermofisher Scientific 1482113D
A-83-01 Tocris 2939
ADP Sigma-Aldrich  A2754
Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
Antibiotic-antimycocytic  Gibco 15240062
Antibiotic-antimycotic  Gibco 15240062
B27 Supplement Gibco 17504-044
Bovine serum albumin FisherScientific  BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments Greiner 543979
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
DAPI Thermofisher Scientific D1306
EDTA Corning 46-034-CI
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fluorobrite Gibco A1896701
GlutaMAX  Gibco  35050079
GlutaMAX  Gibco  35050079
Human epidermal growth factor ProteinTech HZ-1326
Lentivirus VectorBuilder (variable)
Matrigel BD Biosceicen 356231/CB40230C
N2 Supplement Gibco 17502-048
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
NH4Cl Sigma-Aldrich  A9434
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates Thermofisher Scientific 142475
Polybrene MilliporeSigma TR1003G
SB202190 Sigma-Aldrich S70767
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red Thermofisher Scientific 12604013
Trypsin Worthington Biochemical NC9811754
Y-27632 Tocris 1254
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
  2. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  3. Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
  4. Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
  5. Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
  6. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  7. Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
  8. Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
  9. Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
  10. Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
  11. Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
  14. Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
  15. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  16. Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
  17. Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
  18. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  19. Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
  20. Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
  21. Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
  22. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
  23. Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
  24. Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
  25. Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
  26. Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
  27. Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
  28. Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
  29. Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
  30. Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
  31. Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
  32. Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
  33. Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
  34. Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
  35. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
  36. Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
  37. Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
  38. Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
  39. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
  40. Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).

Tags

Keywords: Calcium ImagingVirus-infectedHuman Intestinal OrganoidGenetically Encoded Calcium IndicatorsRotavirusParacrine Purinergic SignalingCalcium SignalingIntestinal EpitheliumLive ImagingGCaMP6sHIO Monolayers
check_url/fr/66132?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Gebert, J. T., Scribano, F. J., Engevik, K. A., Hyser, J. M. Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (203), e66132, doi:10.3791/66132 (2024).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image