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Abstract
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Immunologie et infection

Imagerie calcique en direct de monocouches organoïdes intestinaux humains infectés par un virus à l’aide d’indicateurs de calcium codés génétiquement

Published: January 19, 2024
doi:
10.3791/66132
, , ,
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research, Department of Molecular Virology and Microbiology,Baylor College of Medicine

Summary

Ce protocole décrit une approche pour effectuer l’imagerie calcique dans les organoïdes intestinaux humains infectés par le virus et propose une approche d’analyse.

Abstract

La signalisation calcique est un régulateur intégral de presque tous les tissus. Dans l’épithélium intestinal, le calcium est impliqué dans la régulation de l’activité sécrétoire, de la dynamique de l’actine, des réponses inflammatoires, de la prolifération des cellules souches et de nombreuses autres fonctions cellulaires non caractérisées. En tant que tel, la cartographie de la dynamique de signalisation du calcium dans l’épithélium intestinal peut fournir un aperçu des processus cellulaires homéostatiques et dévoiler des réponses uniques à divers stimuli. Les organoïdes intestinaux humains (HIO) sont un modèle à haut débit, dérivé de l’homme, pour étudier l’épithélium intestinal et représentent donc un système utile pour étudier la dynamique du calcium. Cet article décrit un protocole permettant de transduire de manière stable les HIO avec des indicateurs calciques génétiquement codés (GECI), d’effectuer une microscopie à fluorescence en direct et d’analyser les données d’imagerie pour caractériser de manière significative les signaux calciques. À titre d’exemple représentatif, des HIO tridimensionnels ont été transduits avec des lentivirus pour exprimer de manière stable GCaMP6s, un GECI cytosolique à base de protéines fluorescentes vertes. Les HIO modifiés ont ensuite été dispersés dans une suspension unicellulaire et ensemencés sous forme de monocouches. Après la différenciation, les monocouches de HIO ont été infectées par le rotavirus et/ou traitées avec des médicaments connus pour stimuler une réponse calcique. Un microscope à épifluorescence équipé d’une chambre d’imagerie en direct humidifiée et à température contrôlée a permis d’imager à long terme des monocouches infectées ou traitées par des médicaments. Après l’imagerie, les images acquises ont été analysées à l’aide du logiciel d’analyse gratuit ImageJ. Dans l’ensemble, ces travaux établissent un pipeline adaptable pour caractériser la signalisation cellulaire dans les DOI.

Introduction

Le calcium est un deuxième messager largement conservé qui joue un rôle essentiel dans la régulation de la physiologie cellulaire1. Compte tenu de sa forte charge, de sa petite taille et de sa grande solubilité dans des conditions physiologiques, le calcium est un manipulateur idéal de la conformation des protéines. Cela fait du calcium un moyen puissant de transduire les signaux électrochimiques en altérations enzymatiques, transcriptionnelles ou post-transcriptionnelles. Les gradients stricts de concentration de calcium à travers le réticulum endoplasmique (RE) et les membranes plasmiques créent une force motrice élevée qui permet des changements rapides de la concentration de calcium cytosolique. De multiples mécanismes, y compris la mise en mémoire tampon et le transport actif, maintiennent étroitement ce gradient. Bien que nécessaire aux fonctions cellulaires normales, cet entretien est coûteux en énergie, ce qui le rend particulièrement sensible aux états de stress 2.

En tant que tel, la dérégulation du calcium dans le cytosol est un signal quasi universel de nombreux types de stress cellulaire. Les perturbations métaboliques, les toxines, les agents pathogènes, les dommages mécaniques et les perturbations génétiques peuvent tous perturber la signalisation du calcium. Quel que soit le stimulus, au niveau de la cellule entière, des augmentations soutenues et incontrôlées du calcium cytosolique peuvent favoriser l’apoptose et éventuellement la nécrose 3,4. Cependant, les altérations des taux de calcium cytosolique de plus faible amplitude ou de fréquence plus élevée ont des effets variables2. De même, les résultats des fluctuations calciques peuvent différer en fonction du microdomaine spatial dans lequel elles se produisent5. La surveillance des niveaux de calcium peut donc donner un aperçu des processus de signalisation dynamiques, mais cela nécessite un échantillonnage avec une résolution temporelle et spatiale relativement élevée.

Les indicateurs calciques génétiquement codés (GECI) sont des outils puissants pour l’échantillonnage continu dans les systèmes de cellules vivantes6. Certains des GECI les plus largement utilisés sont des protéines fluorescentes sensibles au calcium à base de GFP, connues sous le nom de GCaMPs7. Le GCaMP canonique est une fusion de trois domaines protéiques distincts : une GFP permutée circulairement (cpGFP), la calmoduline et M136. Le domaine de la calmoduline subit un changement de conformation lors de la liaison du calcium, ce qui permet son interaction avec M13. L’interaction calmoduline-M13 induit un changement conformationnel de la cpGFP qui augmente son émission fluorescente lors de l’excitation. En tant que tel, une augmentation de la concentration de calcium est corrélée à une augmentation de l’intensité de fluorescence GCaMP. Ces capteurs peuvent être cytosoliques ou ciblés sur des organites spécifiques8.

Comme la plupart des tissus, le calcium régule diverses fonctions au sein de l’épithélium gastro-intestinal. L’épithélium intestinal fait partie intégrante de l’absorption des nutriments et des liquides, mais doit également former une barrière étanche et une interface immunitaire pour éviter l’invasion d’agents pathogènes ou les agressions toxiques. Les voies dépendantes du calcium influencent presque toutes ces fonctions vitales 9,10,11. Cependant, la signalisation calcique dans l’épithélium intestinal reste une frontière sous-explorée avec un potentiel prometteur en tant que cible thérapeutique. Alors que la surveillance de la dynamique du calcium dans l’épithélium intestinal in vivo continue de présenter des défis, les organoïdes intestinaux humains (DOI) offrent un système ex vivo adaptable pour l’expérimentation12. Les HIO sont des sphéroïdes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules souches intestinales humaines et, lors de la différenciation, récapitulent une grande partie de la diversité cellulaire de l’épithélium intestinal natif12.

Ce protocole décrit des méthodes complètes pour concevoir des OIS qui expriment des GECI, puis préparer des OIS modifiés sous forme de monocouches pour l’imagerie du calcium sur cellules vivantes. Il propose l’infection virale comme exemple d’une manipulation pathologique qui perturbe la signalisation calcique et fournit une approche analytique pour quantifier ces changements.

Protocol

Tous les organoïdes intestinaux humains (HIO) utilisés dans ce protocole et les expériences représentatives ont été dérivés de tissus humains obtenus et conservés par le Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Tous les échantillons ont été prélevés conformément à un protocole approuvé par le comité d’examen institutionnel du Baylor College of Medicine. 1. Préparation des matériaux et des réactifs Pour l’entretien des organoïde…

Representative Results

La figure 1A montre un dôme BMM contenant des organoïdes intestinaux humains en 3 dimensions qui ont été transduits pour exprimer de manière stable les GCaMP6. La figure 1B montre la même lignée d’organoïde replaqué en monocouche à 24, 48 et 72 h après le semis. Pour valider la fonction des GCaMP6s, la monocouche a été imagée par microscopie à fluorescence toutes les 2 s pendant 4 min, et 100 nM d’ADP ont été ajoutés au milieu après ~20 s….

Discussion

Les altérations des taux cytosoliques de Ca2+ peuvent être à la fois une cause et un effet de pathologies au sein de l’épithélium 10,16,17. L’augmentation du calcium cytosolique peut entraîner directement la sécrétion via l’activation du canal chlorure dépendant du calcium TMEM16A18,19. L’activation de TMEM16A en réponse au Ca2+ pe…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été financés par des subventions R01DK115507 et R01AI158683 (PI : J. M. Hyser) des National Institutes of Health (NIH). Le soutien aux stagiaires a été fourni par des subventions des NIH F30DK131828 (PI : J.T. Gebert), F31DK132942 (PI : F. J. Scribano) et F32DK130288 (PI : K.A. Engevik). Nous tenons à remercier le Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core pour avoir fourni le milieu d’entretien des organoïdes.

Materials

Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
[Leu15]-Gastrin I Sigma-Aldrich G9145
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
1.5mL microcentrifuge tubes Fisherbrand 5408137
15mL conical tubes Thermofisher Scientific 0553859A
16% formaldehyde Thermofisher Scientific 28906
1M HEPES Gibco 15630080
1M HEPES Gibco 15630080
1X PBS Corning  21-040-CV
25 gauge needle Thermofisher Scientific 1482113D
A-83-01 Tocris 2939
ADP Sigma-Aldrich  A2754
Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
Antibiotic-antimycocytic  Gibco 15240062
Antibiotic-antimycotic  Gibco 15240062
B27 Supplement Gibco 17504-044
Bovine serum albumin FisherScientific  BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments Greiner 543979
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
DAPI Thermofisher Scientific D1306
EDTA Corning 46-034-CI
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fluorobrite Gibco A1896701
GlutaMAX  Gibco  35050079
GlutaMAX  Gibco  35050079
Human epidermal growth factor ProteinTech HZ-1326
Lentivirus VectorBuilder (variable)
Matrigel BD Biosceicen 356231/CB40230C
N2 Supplement Gibco 17502-048
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
NH4Cl Sigma-Aldrich  A9434
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates Thermofisher Scientific 142475
Polybrene MilliporeSigma TR1003G
SB202190 Sigma-Aldrich S70767
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red Thermofisher Scientific 12604013
Trypsin Worthington Biochemical NC9811754
Y-27632 Tocris 1254
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References

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Keywords: Calcium ImagingVirus-infectedHuman Intestinal OrganoidGenetically Encoded Calcium IndicatorsRotavirusParacrine Purinergic SignalingCalcium SignalingIntestinal EpitheliumLive ImagingGCaMP6sHIO Monolayers
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Citer Cet Article
Gebert, J. T., Scribano, F. J., Engevik, K. A., Hyser, J. M. Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (203), e66132, doi:10.3791/66132 (2024).
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