遺伝子コードされたカルシウムインジケーターを用いたウイルス感染ヒト腸オルガノイド単分子膜のライブカルシウムイメージング
Summary
このプロトコルでは、ウイルスに感染したヒト腸オルガノイドでカルシウムイメージングを行うためのアプローチを説明し、分析へのアプローチを提供します。
Abstract
カルシウムシグナル伝達は、ほぼすべての組織に不可欠な調節因子です。腸管上皮内では、カルシウムは分泌活動、アクチン動態、炎症反応、幹細胞増殖、その他多くの特徴不明の細胞機能の調節に関与しています。そのため、腸上皮内のカルシウムシグナル伝達動態をマッピングすることで、恒常性細胞プロセスに関する洞察が得られ、さまざまな刺激に対する独自の応答が明らかになります。ヒト腸管オルガノイド(HIO)は、腸上皮を研究するためのハイスループットなヒト由来モデルであり、カルシウム動態を調べるための有用なシステムです。この論文では、遺伝子コードカルシウムインジケーター(GECI)を用いてHIOを安定的に形質導入し、ライブ蛍光顕微鏡法を実施し、イメージングデータを解析してカルシウムシグナルを有意義に特徴付けるためのプロトコルについて説明します。代表例として、3次元HIOをレンチウイルスで形質導入し、緑色蛍光タンパク質をベースとした細胞質GECIであるGCaMP6sを安定的に発現させました。次に、操作されたHIOを単一細胞懸濁液に分散させ、単層として播種しました。分化後、HIO単層をロタウイルスに感染させ、および/またはカルシウム応答を刺激することが知られている薬剤で処理しました。温度制御され加湿されたライブイメージングチャンバーを備えた落射蛍光顕微鏡は、感染した単分子膜や薬物処理された単分子膜の長期イメージングを可能にしました。イメージングに続いて、取得した画像は、無料で入手できる解析ソフトウェアImageJを使用して解析されました。全体として、この研究は、HIOにおける細胞シグナル伝達を特徴付けるための適応可能なパイプラインを確立するものである。
Introduction
カルシウムは広く保存されているセカンドメッセンジャーであり、細胞生理機能の調節に重要な役割を果たしています1。カルシウムは、その強い電荷、小型、および生理学的条件での高い溶解性を考えると、タンパク質のコンフォメーションの理想的なマニピュレーターです。これにより、カルシウムは電気化学的シグナルを酵素的、転写的、または転写後の変化に変換する強力な手段になります。小胞体(ER)と原形質膜を横切る厳密なカルシウム濃度勾配は、細胞質カルシウム濃度の急速な変化を可能にする高い駆動力を生み出します。バッファリングとアクティブトランスポートの両方を含む複数のメカニズムが、この勾配を厳密に維持します。正常な細胞機能には必要であるが、この維持はエネルギー的に高価であり 、ストレス状態において特に影響を受けやすい2。
このように、細胞質内のカルシウムの調節不全は、多くの種類の細胞ストレスのほぼ普遍的なシグナルです。代謝障害、毒素、病原体、機械的損傷、遺伝的摂動はすべて、カルシウムシグナル伝達を混乱させる可能性があります。刺激に関係なく、細胞レベルでは、細胞質カルシウムの持続的で制御不能な上昇は、アポトーシスを促進し、最終的には壊死を促進する可能性があります3,4。しかし、低振幅または高頻度の細胞質カルシウムレベルの変化は、さまざまな影響を及ぼします2。同様に、カルシウム変動の結果は、変動が発生する空間的ミクロドメインによって異なる可能性があります5。したがって、カルシウムレベルをモニタリングすることで、動的シグナル伝達プロセスに関する洞察を得ることができますが、そのためには比較的高い時間分解能と空間分解能でのサンプリングが必要です。
遺伝子コードされたカルシウム指標(GECI)は、生細胞システムでの連続サンプリングのための強力なツールです6。最も広く使用されているGECIには、GCaMPとして知られるGFPベースのカルシウム応答性蛍光タンパク質があります7。標準的なGCaMPは、環状に順列されたGFP(cpGFP)、カルモジュリン、およびM136の3つの異なるタンパク質ドメインの融合です。カルモジュリンドメインは、カルシウムの結合時にコンフォメーション変化を起こし、M13との相互作用を可能にします。カルモジュリン-M13相互作用は、cpGFPの立体構造変化を誘発し、励起時の蛍光発光を増加させます。そのため、カルシウム濃度の上昇はGCaMP蛍光強度の増加と相関します。これらのセンサーは、細胞質である場合もあれば、特定の細胞小器官を標的とする場合もある8。
ほとんどの組織と同様に、カルシウムは消化管上皮内のさまざまな機能を調節します。腸上皮は栄養素と体液の吸収に不可欠ですが、病原体の侵入や有毒な侮辱を避けるために、タイトなバリアと免疫インターフェースを形成する必要があります。カルシウム依存性経路は、これらの生命機能のほぼすべてに影響を与えます9,10,11。しかし、腸上皮内のカルシウムシグナル伝達は未開拓のフロンティアであり、治療標的として有望な可能性を秘めています。in vivoでの腸上皮内のカルシウム動態のモニタリングは引き続き課題となっていますが、ヒト腸オルガノイド(HIO)は実験に適応可能なex vivoシステムを提供します12。HIOは、ヒト腸管幹細胞に由来する3次元(3D)スフェロイドであり、分化すると、天然の腸上皮の細胞多様性の多くを再現する12。
このプロトコールでは、GECIを発現するHIOを設計し、生細胞カルシウムイメージング用の単層として設計されたHIOを調製するための包括的な方法について説明します。カルシウムシグナル伝達を破壊する病理学的操作の例としてウイルス感染を提供し、これらの変化を定量化するための分析的アプローチを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞質Ca2+レベルの変化は、上皮内の病状の原因と結果の両方である可能性があります10,16,17。細胞質カルシウムの増加は、カルシウム依存性塩化物チャネルの活性化を介して分泌を直接促進TMEM16A18,19。Ca2+に応答したTMEM16Aの活性化は、塩化物の頂端流出を可能に?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01DK115507およびR01AI158683(PI:J. M. Hyser)の支援を受けました。研修生のサポートは、NIHの助成金F30DK131828(PI:J.T. Gebert)、F31DK132942(PI:F. J. Scribano)、F32DK130288(PI:K.A. Engevik)によって提供されました。オルガノイド維持培地を提供してくださったTexas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Coreに感謝します。
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
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