Визуализация кальция в режиме реального времени инфицированных вирусом монослоев органоидов кишечника человека с использованием генетически кодируемых кальциевых индикаторов
Summary
Этот протокол описывает подход к выполнению визуализации кальция в инфицированных вирусом органоидах кишечника человека и предлагает подход к анализу.
Abstract
Кальциевая сигнализация является неотъемлемым регулятором практически каждой ткани. В кишечном эпителии кальций участвует в регуляции секреторной активности, динамики актина, воспалительных реакций, пролиферации стволовых клеток и многих других нехарактерных клеточных функций. Таким образом, картирование динамики передачи сигналов кальция в кишечном эпителии может дать представление о гомеостатических клеточных процессах и выявить уникальные реакции на различные стимулы. Органоиды кишечника человека (HIO) представляют собой высокопроизводительную модель для изучения кишечного эпителия и, таким образом, представляют собой полезную систему для исследования динамики кальция. В данной статье описывается протокол для стабильной трансдукции HIO с генетически кодируемыми кальциевыми индикаторами (GECI), выполнения флуоресцентной микроскопии в реальном времени и анализа данных визуализации для осмысленной характеристики сигналов кальция. В качестве репрезентативного примера можно привести 3-мерные HIO, трансдуцированные лентивирусом для стабильной экспрессии GCaMP6s, цитозольного GECI на основе зеленого флуоресцентного белка. Затем сконструированные HIO были диспергированы в одноклеточную суспензию и высеяны в виде монослоев. После дифференцировки монослои HIO инфицировали ротавирусом и/или лечили препаратами, которые, как известно, стимулируют кальциевый ответ. Эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный камерой для визуализации в реальном времени с регулируемой температурой, позволил получить долгосрочную визуализацию инфицированных или обработанных лекарственными препаратами монослоев. После получения изображений полученные изображения были проанализированы с помощью свободно доступного аналитического программного обеспечения ImageJ. В целом, эта работа создает адаптируемый конвейер для характеристики клеточной сигнализации в HIO.
Introduction
Кальций является широко консервативным вторичным мессенджером, который играет важнейшую роль в регуляции клеточной физиологии1. Учитывая его сильный заряд, небольшой размер и высокую растворимость в физиологических условиях, кальций является идеальным манипулятором конформации белка. Это делает кальций мощным средством для преобразования электрохимических сигналов в ферментативные, транскрипционные или посттранскрипционные изменения. Строгие градиенты концентрации кальция в эндоплазматическом ретикулуме (ER) и плазматических мембранах создают высокую движущую силу, которая позволяет быстро изменять концентрацию цитозольного кальция. Многочисленные механизмы, включая буферизацию и активный транспорт, жестко поддерживают этот градиент. Несмотря на то, что это необходимо для нормального функционирования клеток, это поддержание энергетически затратно, что делает его особенно восприимчивым в стрессовых состояниях.
Таким образом, дисрегуляция кальция в цитозоле является почти универсальным сигналом многих видов клеточного стресса. Метаболические нарушения, токсины, болезнетворные микроорганизмы, механические повреждения и генетические нарушения могут нарушить передачу сигналов кальция. Независимо от стимула, на уровне всей клетки устойчивое, неконтролируемое повышение цитозольного кальция может способствовать апоптозу и, в конечномитоге, некрозу. Однако изменения уровня кальция в цитозолье с более низкой амплитудой или более высокой частотой имеют различные эффекты2. Аналогичным образом, результаты флуктуаций кальция могут различаться в зависимости от пространственного микродомена, в которомони происходят. Таким образом, мониторинг уровня кальция может дать представление о динамических сигнальных процессах, но для этого требуется отбор проб с относительно высоким временным и пространственным разрешением.
Генетически кодируемые индикаторы кальция (GECI) являются мощными инструментами для непрерывного отбора проб в системах живых клеток6. Одними из наиболее широко используемых GECI являются кальций-чувствительные флуоресцентные белки на основе GFP, известные как GCaMPs7. Канонический GCaMP представляет собой слияние трех различных белковых доменов: циркулярно перестановочного GFP (cpGFP), кальмодулина и M136. Домен кальмодулина претерпевает конформационные изменения при связывании кальция, что позволяет ему взаимодействовать с М13. Взаимодействие кальмодулина и М13 индуцирует конформационное изменение cpGFP, которое увеличивает его флуоресцентное излучение при возбуждении. Таким образом, увеличение концентрации кальция коррелирует с увеличением интенсивности флуоресценции GCaMP. Эти сенсоры могут быть цитозольными или нацеленными на конкретные органеллы8.
Как и большинство тканей, кальций регулирует различные функции в эпителии желудочно-кишечного тракта. Кишечный эпителий является неотъемлемой частью всасывания питательных веществ и жидкости, но также должен образовывать плотный барьер и иммунный интерфейс, чтобы избежать инвазии патогенов или токсического раздражения. Кальций-зависимые пути влияют почти на все эти жизненно важные функции 9,10,11. Тем не менее, передача сигналов кальция в кишечном эпителии остается малоизученным рубежом с многообещающим потенциалом в качестве терапевтической мишени. В то время как мониторинг динамики кальция в кишечном эпителии in vivo по-прежнему представляет собой проблему, кишечные органоиды человека (HIO) предлагают адаптируемую систему ex vivo для экспериментов12. HIO представляют собой трехмерные (3D) сфероиды, полученные из стволовых клеток кишечника человека и при дифференцировке повторяют большую часть клеточного разнообразия нативного кишечного эпителия12.
Этот протокол описывает комплексные методы разработки HIO, экспрессирующих GECI, а затем подготовки сконструированных HIO в виде монослоев для визуализации живых клеток кальция. В качестве примера патологической манипуляции, которая нарушает передачу сигналов кальция, предлагается вирусная инфекция, а также аналитический подход к количественной оценке этих изменений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изменения цитозольного уровняCa2+ могут быть как причиной, так и следствием патологий в эпителии 10,16,17. Увеличение цитозольного кальция может напрямую стимулировать секрецию через активацию кальций-зависимого хлоридного канала TM…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами R01DK115507 и R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) от Национальных институтов здравоохранения (NIH). Поддержка стажеров была обеспечена грантами NIH F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F.J. Scribano) и F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Мы хотели бы поблагодарить Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core за предоставление среды для поддержания органоидов.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
- Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
- Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
- Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
- Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
- Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
- Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
- Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
- Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
- Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
- Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
- Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
- Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
- Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
- Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
- Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
- Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
- Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
- Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
- Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
- Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
- Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
- Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
- Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
- Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
