Levande kalciumavbildning av virusinfekterade humana tarmorganoidmonolager med hjälp av genetiskt kodade kalciumindikatorer
Summary
Detta protokoll beskriver ett tillvägagångssätt för att utföra kalciumavbildning i virusinfekterade mänskliga tarmorganoider och erbjuder ett tillvägagångssätt för analys.
Abstract
Kalciumsignalering är en integrerad regulator för nästan alla vävnader. Inom tarmepitelet är kalcium involverat i regleringen av sekretorisk aktivitet, aktindynamik, inflammatoriska svar, stamcellsproliferation och många andra okarakteriserade cellulära funktioner. Som sådan kan kartläggning av kalciumsignaldynamik i tarmepitelet ge insikt i homeostatiska cellulära processer och avslöja unika svar på olika stimuli. Humana tarmorganoider (HIO) är en modell med hög genomströmning som härrör från människor för att studera tarmepitelet och representerar därmed ett användbart system för att undersöka kalciumdynamiken. Denna artikel beskriver ett protokoll för att stabilt transducera HIO:er med genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI), utföra levande fluorescensmikroskopi och analysera bilddata för att på ett meningsfullt sätt karakterisera kalciumsignaler. Som ett representativt exempel transducerades 3-dimensionella HIO:er med lentivirus för att stabilt uttrycka GCaMP6s, en grön fluorescerande proteinbaserad cytosolisk GECI. De konstruerade HIO:erna dispergerades sedan i en encellssuspension och såddes som monolager. Efter differentiering infekterades HIO-monolagren med rotavirus och/eller behandlades med läkemedel som är kända för att stimulera ett kalciumsvar. Ett epifluorescensmikroskop försett med en temperaturkontrollerad, fuktad kammare för live-avbildning möjliggjorde långtidsavbildning av infekterade eller läkemedelsbehandlade monolager. Efter avbildning analyserades de insamlade bilderna med hjälp av det fritt tillgängliga analysprogrammet ImageJ. Sammantaget etablerar detta arbete en anpassningsbar pipeline för att karakterisera cellulär signalering i HIO:er.
Introduction
Kalcium är en allmänt bevarad andra budbärare som spelar en avgörande roll för att reglera cellulär fysiologi1. Med tanke på dess starka laddning, lilla storlek och höga löslighet under fysiologiska förhållanden är kalcium en idealisk manipulator av proteinkonformation. Detta gör kalcium till ett kraftfullt sätt att omvandla elektrokemiska signaler till enzymatiska, transkriptionella eller post-transkriptionella förändringar. De strikta kalciumkoncentrationsgradienterna över det endoplasmatiska nätverket (ER) och plasmamembranen skapar en hög drivkraft som möjliggör snabba förändringar i cytosolisk kalciumkoncentration. Flera mekanismer, inklusive både buffring och aktiv transport, upprätthåller den här gradienten strikt. Även om det är nödvändigt för normala cellulära funktioner, är detta underhåll energimässigt dyrt, vilket gör det särskilt känsligt i stresstillstånd 2.
Som sådan är dysreglering av kalcium i cytosolen en nästan universell signal om många typer av cellulär stress. Metaboliska störningar, toxiner, patogener, mekaniska skador och genetiska störningar kan alla störa kalciumsignaleringen. Oavsett stimulans kan ihållande, okontrollerade ökningar av cytosoliskt kalcium på helcellsnivå främja apoptos och så småningom nekros 3,4. Förändringar i cytosoliska kalciumnivåer med lägre amplitud eller högre frekvens har dock varierande effekter2. På samma sätt kan resultaten av kalciumfluktuationer skilja sig åt beroende på den rumsliga mikrodomän där de förekommer5. Övervakning av kalciumnivåer kan därför ge insikt i dynamiska signaleringsprocesser, men detta kräver provtagning med relativt hög tidsmässig och rumslig upplösning.
Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) är kraftfulla verktyg för kontinuerlig provtagning i levande cellsystem6. Några av de mest använda GECI:erna är GFP-baserade kalciumresponsiva fluorescerande proteiner som kallas GCaMPs7. Den kanoniska GCaMP är en sammansmältning av tre distinkta proteindomäner: en cirkulärt permuterad GFP (cpGFP), kalmodulin och M136. Kalmodulindomänen genomgår en konformationsförändring vid bindning av kalcium, vilket möjliggör dess interaktion med M13. Calmodulin-M13-interaktionen inducerar en konformationsförändring i cpGFP som ökar dess fluorescerande emission vid excitation. Som sådan korrelerar en ökning av kalciumkoncentrationen med en ökning av GCaMP-fluorescensintensiteten. Dessa sensorer kan vara cytosoliska eller riktade mot specifika organeller8.
I likhet med de flesta vävnader reglerar kalcium en mängd olika funktioner i mag-tarmepitelet. Tarmepitelet är integrerat för närings- och vätskeabsorption men måste också bilda en tät barriär och immungränssnitt för att undvika patogeninvasion eller giftiga förolämpningar. Kalciumberoende vägar påverkar nästan alla dessa vitala funktioner 9,10,11. Kalciumsignalering i tarmepitelet är dock fortfarande ett underutforskat område med lovande potential som terapeutiskt mål. Medan övervakning av kalciumdynamik i tarmepitelet in vivo fortsätter att innebära utmaningar, erbjuder mänskliga tarmorganoider (HIO) ett anpassningsbart ex vivo-system för experiment12. HIO:er är 3-dimensionella (3D) sfäroider som härrör från mänskliga tarmstamceller och som vid differentiering rekapitulerar mycket av den cellulära mångfalden i det ursprungliga tarmepitelet12.
Detta protokoll beskriver omfattande metoder för att konstruera HIO:er som uttrycker GECI:er och sedan förbereda konstruerade HIO:er som monolager för kalciumavbildning i levande celler. Den erbjuder virusinfektion som ett exempel på en patologisk manipulation som stör kalciumsignalering och ger ett analytiskt tillvägagångssätt för att kvantifiera dessa förändringar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förändringar i cytosoliska Ca2+ nivåer kan vara både en orsak och effekt av patologier inom epitelet 10,16,17. Ökningar av cytosoliskt kalcium kan direkt driva sekretion via aktivering av den kalciumberoende kloridkanalen TMEM16A18,19. Aktivering av TMEM16A som svar på Ca2+ möjliggör apikalt utflöde av klorid, vilket skapar en osmotisk grad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av anslag R01DK115507 och R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) från National Institutes of Health (NIH). Traineestöd tillhandahölls av NIH-anslag F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) och F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Vi vill tacka Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core för att ha tillhandahållit organoidunderhållsmedia.
Materials
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
- Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
- Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
- Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
- Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
- Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
- Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
- Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
- Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
- Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
- Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
- Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
- Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
- Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
- Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
- Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
- Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
- Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
- Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
- Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
- Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
- Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
- Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
- Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
- Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
