Summary
Detta protokoll beskriver en procedur för tredimensionell (3D) utskrift av bakteriekolonier för att studera deras rörlighet och tillväxt i komplexa 3D-porösa hydrogelmatriser som är mer besläktade med deras naturliga livsmiljöer än konventionella flytande kulturer eller petriskålar.
Abstract
Bakterier är allestädes närvarande i komplexa tredimensionella (3D) porösa miljöer, såsom biologiska vävnader och geler, och underjordiska jordar och sediment. Majoriteten av tidigare arbete har dock fokuserat på studier av celler i bulkvätskor eller på plana ytor, som inte helt rekapitulerar komplexiteten i många naturliga bakteriella livsmiljöer. Här adresseras denna kunskapslucka genom att beskriva utvecklingen av en metod för att 3D-printa täta kolonier av bakterier till fastnade granulära hydrogelmatriser. Dessa matriser har avstämbara porstorlekar och mekaniska egenskaper; de begränsar cellerna fysiskt och stöder dem på så sätt i 3D. De är optiskt transparenta, vilket möjliggör direkt visualisering av bakterier som sprids i deras omgivning med hjälp av avbildning. Som ett bevis på denna princip demonstreras här kapaciteten hos detta protokoll genom 3D-utskrift och avbildning av icke-rörliga och rörliga Vibro cholerae, såväl som icke-rörliga Escherichia coli, i fastnade granulära hydrogelmatriser med varierande interstitiella porstorlekar.
Introduction
Bakterier lever ofta i olika, komplexa porösa 3D-miljöer som sträcker sig från slemhinnegeler i tarmen och lungorna till jord i marken 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. I dessa miljöer kan bakteriers rörelse genom motilitet eller tillväxt hindras av omgivande hinder, såsom polymernätverk eller packningar av fasta mineralkorn – vilket påverkar cellernas förmåga att sprida sig genom sina miljöer26, få tillgång till näringskällor, kolonisera ny terräng och bilda skyddande biofilmsamhällen27. Traditionella laboratoriestudier använder dock vanligtvis mycket förenklade geometrier, med fokus på celler i flytande kulturer eller på plana ytor. Även om dessa metoder ger viktiga insikter i mikrobiologi, rekapitulerar de inte helt komplexiteten i naturliga livsmiljöer, vilket leder till dramatiska skillnader i tillväxthastighet och motilitetsbeteende jämfört med mätningar som utförs i verkliga miljöer. Därför behövs en metod för att definiera bakteriekolonier och studera deras rörlighet och tillväxt i 3D-porösa miljöer som är mer besläktade med många av deras naturliga livsmiljöer.
Att inokulera celler i en agargel och sedan visualisera deras makroskopiska spridning med ögat eller med hjälp av en kamera är ett enkelt sätt att åstadkomma detta, vilket först föreslogs av Tittsler och Sandholzer 193628. Detta tillvägagångssätt lider dock av ett antal viktiga tekniska utmaningar: (1) Även om porstorlekarna i princip kan varieras genom att variera agaroskoncentrationen, är porstrukturen hos sådana geler dåligt definierad; (2) Ljusspridning gör att dessa geler blir grumliga, vilket gör det svårt att visualisera celler i individuell skala med hög upplösning och trohet, särskilt i stora prover; (3) När agarkoncentrationen är för stor begränsas cellmigrationen till gelens övre plana yta. (4) Den komplexa reologin hos sådana geler gör det svårt att introducera inokulat med väldefinierade geometrier.
För att ta itu med dessa begränsningar har Dattas laboratorium i tidigare arbete utvecklat ett alternativt tillvägagångssätt med hjälp av granulära hydrogelmatriser - bestående av fastnade, biokompatibla hydrogelpartiklar svullna i flytande bakteriekultur - som "porösa petriskålar" för att innesluta celler i 3D. Dessa matriser är mjuka, självläkande, sträckspänningsfasta ämnen; Således, till skillnad från tvärbundna geler som används i andra bioprintningsprocesser, kan ett injektionsmikromunstycke röra sig fritt inuti matrisen längs vilken föreskriven 3D-väg som helst genom att lokalt arrangera om hydrogelpartiklarna29. Dessa partiklar förtätas sedan snabbt och självläker runt injicerade bakterier, vilket stöder cellerna på plats utan ytterligare skadlig bearbetning. Denna process är därför en form av 3D-utskrift som gör det möjligt att ordna bakterieceller - i en önskad 3D-struktur, med en definierad samhällssammansättning - i en porös matris med avstämbara fysikalisk-kemiska egenskaper. Dessutom är hydrogelmatriserna helt transparenta, vilket gör att cellerna kan visualiseras direkt med hjälp av avbildning.
Nyttan av detta tillvägagångssätt har tidigare visats på två sätt. I en uppsättning studier spreds utspädda celler genom hydrogelmatrisen, vilket möjliggjorde studier av motiliteten hos enskilda bakterier 30,31. I en annan uppsättning studier 3D-printades flercelliga samhällen i geler i centimeterskala med hjälp av ett injektionsmunstycke monterat på ett programmerbart mikroskopsteg, vilket möjliggjorde studier av spridningen av bakteriekollektiv genom sin omgivning32,33. I båda fallen avslöjade dessa studier tidigare okända skillnader i spridningsegenskaperna hos bakterier som lever i porösa miljöer jämfört med de i vätskeodling/på plana ytor. Men med tanke på att de var monterade på ett mikroskopstadium var dessa tidigare studier begränsade till små provvolymer (~1 ml) och därför korta experimentella tidsskalor. De var också begränsade i sin förmåga att definiera inokulageometrier med hög rumslig upplösning.
Här beskrivs nästa generation av denna experimentella plattform som adresserar båda begränsningarna. Specifikt tillhandahålls protokoll genom vilka man kan använda en modifierad 3D-skrivare med en ansluten sprutextruder för att 3D-printa och avbilda bakteriekolonier i stor skala. Dessutom indikerar representativa data hur detta tillvägagångssätt kan vara användbart för att studera bakteriers rörlighet och tillväxt, med hjälp av biofilm-tidigare Vibrio cholerae och planktoniska Escherichia coli som exempel. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att upprätthålla bakteriekolonier under långa tider och visualisera med hjälp av olika avbildningstekniker. Därför har förmågan hos detta tillvägagångssätt att studera bakteriesamhällen i 3D-porösa livsmiljöer en enorm forsknings- och tillämpad potential, vilket påverkar behandlingen och studien av mikrober i tarmen, huden, lungan och jorden. Dessutom skulle detta tillvägagångssätt kunna användas i framtiden för 3D-utskrift av bakteriebaserade konstruerade levande material till mer komplexa fristående former.
Protocol
Detta tillvägagångssätt är att konvertera en kommersiell 3D-modelleringsskrivare för avsättning till en 3D-bioprinter med hjälp av ett tidigare etablerat protokoll av Tashman et al.34. I korthet ersatte Tashman et al. ett kommersiellt extruderhuvud med en specialtillverkad sprutpumpsextruder. Denna extruder möjliggör utskrift av högkoncentrerade vätskesuspensioner av bakterieceller i 3D, med dess extruderade volym och 3D-position som styrs av programmeringsspråket G-kod. Den extruderade volymen specificeras i programvaran av extrudersteget (E-steget) och kalibreras dessutom enligt beskrivningen nedan. Dessa bakteriesuspensioner skrivs därmed ut direkt i en granulär hydrogelmatris, som fungerar som ett 3D-stöd för cellerna. Nedan beskriver protokollet också hur man förbereder matriser med olika polymerkoncentrationer, karakteriserar de resulterande förändringarna i porstorlek och reologiska egenskaper och karakteriserar efterföljande bakteriell rörlighet och tillväxt med hjälp av direkt avbildning.
1. Konvertering av en kommersiell 3D-skrivare till en 3D-bioprinter
- Ta bort extrudern och värmaren från en kommersiell 3D-skrivare (se Materialförteckning).
- Följ tidigare protokoll för att tillverka sprutpumpens extruder34, med en ytterligare modifiering för att rymma en Luer lock-spruta för engångsbruk. Montera sprutpumpens extruder på skrivaren.
OBS: CAD-filerna som krävs för att modifiera sprutpumpens extruder för plastsprutor finns i Supplementary Files 1-3. - Installera och öppna programvaran för 3D-skrivare (se Materialförteckning) på en dator. Anslut 3D-skrivaren till datorn.
- Ladda en 1 ml engångsspruta med en nål av lämplig storlek i de 3D-utskrivna klämmorna genom att rikta in den övre och nedre halvan av mekanismen (Figur 1). Fäst klämmorna runt sprutan med tre M8-hylsbultar och tunna sexkantsmuttrar av stål (se materialförteckning). Sprutkolven ansluts till ledarskruven i sprutpumpens extruder. Höj kolven manuellt genom att vrida ledarskruven för att skapa en 0,5 ml luftspalt i sprutan.
- Om kontaminering är ett problem för experimentet, transportera sprutklämmandet till en biohuva och sterilisera med 70 % etanolspray vid inträde innan du slutför följande steg.
2. Beredning av bakteriesuspensionen
- För V. cholerae och E. coli, odla över natten på en 2% Lennox LB (Luria buljong, se Materialtabell) agarplatta vid 37 °C.
- För V. cholerae, inokulera cellerna till 3 ml flytande LB med tio sterila glaspärlor. Odla cellerna i en skakinkubator vid 37 °C i 5-6 timmar fram till den mellersta exponentiella fasen till en optisk densitet (OD) 600 på ~0,9.
- För E. coli, inokulera cellerna i 3 ml flytande LB. Odla cellerna i en skakinkubator vid 37 °C över natten. Innokulera 200 μL av nattkulturen i färsk LB i 3 timmar tills OD når 0,6.
- Överför kulturen till ett 10 ml centrifugrör. Centrifugera kulturen i 5 minuter vid 5 000 x g vid rumstemperatur för att bilda en pellet. Ta bort supernatanten. Återsuspendera med ~10 μL flytande LB för att uppnå en celldensitet på ~9 x 1010 celler per ml.
3. Ladda den bakteriella suspensionen i sprutan
OBS: Det finns två metoder för att ladda bakterierna i sprutan (steg 3.1 och steg 3.2). Steg 3.1 fungerar för att ladda små volymer bakteriesuspensioner, <200 μL, och steg 3.2 fungerar för att ladda större volymer bakteriesuspensioner, >200 μL. Steg 3.1 användes för de representativa resultaten som visas här.
- Ladda en tom 1 ml Luer lock-spruta av plast i 3D-bioprintern. Anslut sprutkolven med ledarskruven. Dra tillbaka sprutan manuellt för att tillföra 0,2 ml av luftspalten för att ge utrymme för kolven att röra sig i sprutan eftersom en liten volym celler ~20-50 μL används för varje sats experiment.
- Fäst en trubbig nål på sprutspetsen med den nålstorlek som krävs för den storlek på tryckfunktionerna som krävs. Här används en 2-tums 20 G-nål.
- Ladda den bakteriella suspensionen i sprutan genom att placera ett 10 ml centrifugrör med det bakteriella inokulatet under nålen. Vrid skruven manuellt för att dra tillbaka sprutkolven och ladda cellerna i sprutan. Bakteriernas cellvolymer är så små att cellerna ofta bara laddas in i nålen.
- Ta bort kolven från sprutklämmande komplex och använd en annan spruta och nål för att försiktigt ladda sprutklämkomplexet med önskade bakteriesuspensioner, var noga med att undvika att luftbubblor fastnar. Sprutklämkomplexet ska fyllas något över brättet med önskad bakteriesuspension och sedan överföras till bioprintern.
- Sätt försiktigt in sprut-clamp-komplexet utan kolven i motsvarande uttag på huvudkärnan på bioskrivarens extruder.
- Se till att skrivarvagnen är ungefär halvvägs upp på ledarskruven och att det finns en uppsamlingsskål under den laddade sprutan. För sedan försiktigt in kolven genom både vagnen och sprutklämmans komplex tills den hakar fast i vagnen. Tryck långsamt ner kolven i bakteriesuspensionen för att undvika att luftbubblor fastnar i sprutan.
- Skjut adaptern clamp på vagnen över baksidan av kolven för att säkra den på plats för både extruderings- och indragningsmanövrar.
4. Kalibrering av extrudersteget till deponerad volym
- För att kalibrera extrudersteget (E-steget) till den deponerade volymen, ställ först in bioskrivaren med exakt spruta, sprutnål och deponerande bakteriesuspension som kommer att användas i experimentet. Här används en 1 ml Luer lock-spruta.
- Bestäm ett uppskattat E-stegsintervall att kalibrera över genom att extrudera ett godtyckligt E-stegsnummer (~200) och notera kolvens volymförändring med sprutvolymmarkörer.
- Använd detta grova E-stegsförhållande till volymförhållandet för att bestämma E-stegsinställningarna för att utföra kalibreringssvepet. Till exempel, om ett E-steg på 200 extruderar cirka 20 μL genom visuell inspektion och man vill deponera 10-200 μL, testa E-steg mellan 100-2000.
- För att utföra det linjära kalibreringssvepet, märk först och mät torrvikten för tjugo 1,5 ml provtagningsrör på en analysvåg med 0,1 mg känslighet.
- Extrudera bakteriesuspension i de föruppmätta 1,5 ml-rören. Utför minst 2 repliker för varje E-steg. Upprepa för alla E-steg över det linjära området, byt ut bakteriesuspensionen vid behov. Om kontaminering är ett problem för experimentet, torka av utsidan av sprutnålen med en luddfri trasa mättad med 70 % etanol efter varje prov.
- Mät massan av alla 1,5 ml rör med samma analysvåg. Subtrahera det första massvärdet från det andra för att erhålla en nettomassa av bakteriesuspension deponerad.
- Omvandla massan av bakteriesuspension till en volym med materialets densitet. För många bakteriesuspensioner som huvudsakligen består av vatten är 1 g/ml en lämplig densitetsuppskattning.
- Utför en linjär anpassning mellan E-steget och den extruderade volymen för att avsluta kalibreringsprocessen.
5. Beredning av den granulära hydrogelmatrisen
- I ett biosäkerhetsskåp, tillsätt torra granulat av tvärbundna akrylsyra/alkylakrylatsampolymerer (se materialtabell) till 400 ml 2 % Lennox Luria-Bertani (LB) för att hålla matrisen steril; Andra flytande cellodlingsmedier kan dock också användas för att svälla hydrogelmatrisen.
OBS: Viktprocenten av granulat som tillsätts till LB beror på den porstorlek som man siktar på. I den aktuella studien, för en 0,9 % granulär hydrogelmatris, tillsätts 3,6 g torra granulat till LB och för en 1,2 % granulär hydrogelmatris tillsätts 4,8 g torra granulat till LB. Hydrogelgranulatet dispergeras homogent genom att blanda dem i en stavblandare i 2 minuter. - När det har blandats, justera pH till 7,4 genom att tillsätta 20 till 500 μL steg om 10 M natriumhydroxid (NaOH) för att säkerställa cellviabilitet. Efter varje tillsats av NaOH, mät pH genom att doppa en pipettspets i blandningen och sedan torka av hydrogelmatrisen på ett pH-testpapper.
OBS: När NaOH tillsätts kommer blandningens viskositet att öka när hydrogelgranulatet börjar svälla. De svullna hydrogelgranulaten är ~5 μm till 10 μm i diameter och har fastnat i en hydrogelmatris. Den inre maskstorleken för granulaten är ~40 nm till 100 nm, som tidigare fastställts32. Maskstorleken är tillräckligt stor för att små molekyler (t.ex. syre och näringsämnen) ska kunna diffundera fritt, men tillräckligt liten för att bakterier ska kunna begränsas mellan de interstitiella porerna. - Överför sedan den granulära hydrogelmatrisen till ett 50 ml centrifugrör med en 50 ml steril plastspruta. Centrifugera hydrogelmatrisen vid 161 x g i 1 minut vid rumstemperatur för att avlägsna bubblorna som bildas under blandningsprocessen.
- Låt hydrogelmatrisen sitta i minst 2 dagar i rumstemperatur för att säkerställa att ingen kontaminering har inträffat. Kontamineringen uppträder som mikrokolonier suspenderade i hydrogelmatrisen. Efter två dagar, centrifugera hydrogelmatrisen vid 161 x g i 1 minut för att ta bort eventuella ytterligare bubblor som bildats.
OBS: Protokollet kan pausas här genom att förvara hydrogelmatrisen i rumstemperatur i upp till en vecka. - I biosäkerhetsskåpet, med hjälp av en 30 ml steril plastspruta, överför du önskad mängd hydrogelmatris till behållaren där utskrift kommer att ske (här användes ~20 ml för en 20 ml vävnadskolv eller 1 ml för 1 ml mikrokyvetter av plast).
6. Karakterisering av de granulära hydrogelmatrisens reologiska egenskaper
- Ladda ~3 ml av hydrogelmatrisen i en skjuverreometer (se materialtabell) med ett mellanrum på 1 mm mellan uppruggade parallellplattor med en diameter på 50 mm för att mäta de reologiska egenskaperna.
- Kvantifiera sträckbeteendet med hjälp av enkelriktade skjuvmätningar på skjuvreometern genom att mäta skjuvspänningen som en funktion av ett logaritmiskt svep av skjuvhastigheten från 10-4 s-1 till 102 s-1 (t.ex. figur 2A).
OBS: Vid låga skjuvhastigheter kommer hydrogelmatrisen att ha en konstant skjuvspänning (sträckgränsen) som är oberoende av skjuvhastigheten. Vid höga skjuvhastigheter kommer skjuvspänningen att öka med ett kraftlagsberoende på skjuvhastigheten, vilket indikerar fluidiseringen av hydrogelmatrisen. Detta avkastningsspänningsbeteende gör det möjligt att 3D-printa bakterier i den granulära hydrogelmatrisen29. - Mät lagrings- och förlustmodulerna, G' respektive G'', som en funktion av frekvensen med hjälp av oscillerande reologi med liten amplitud med en töjningsamplitud på 1 % och frekvenser mellan 0,1 och 1 Hz (t.ex. figur 2B).
OBS: Den idealiska granulära hydrogelmatrisen för 3D-utskrift bör ha en lagringsmodul som är större än förlustmodulen, vilket indikerar att mediet fungerar som ett fastnat elastiskt fast ämne29.
7. Karakterisering av den granulära hydrogelmatrisens interstitiella porstorlek
- Ultraljudsbehandling 100 nm karboxylerade fluorescerande polystyrennanopartiklar (~3,6 x 1013 partiklar/ml, se materialförteckning) i sin förpackning i 15 minuter för att återsuspendera för att bryta upp eventuella aggregeringar/kluster av partiklar. Överför 50 μL nanopartiklar till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera i 10 minuter vid 9 500 x g vid rumstemperatur tills pelleten bildas och supernatanten är klar. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml av det flytande odlingsmediet (här LB) som används för att bereda den granulära hydrogelmatrisen.
OBS: Protokollet kan pausas här genom att förvara de återsuspenderade nanopartiklarna vid 4 °C i upp till 3 månader.
- Centrifugera i 10 minuter vid 9 500 x g vid rumstemperatur tills pelleten bildas och supernatanten är klar. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml av det flytande odlingsmediet (här LB) som används för att bereda den granulära hydrogelmatrisen.
- Ultraljudsbehandla de resuspenderade nanopartiklarna i 30 min. Överför 1 ml granulär hydrogelmatris till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 μl av de omsuspenderade nanopartiklarna till den granulära hydrogelmatrisen och blanda dem med en pipettspets. Efter blandning, centrifugera i 30 s vid 161 x g vid rumstemperatur.
- Överför hydrogelmatrisen och nanopartikelblandningen till en petriskål med en diameter på 35 mm med en 0,1 mm tjock glasbottenbrunn. Brunnen är 20 mm i diameter och 1 mm djup. Placera ett täckglas ovanpå och tryck ner för att inaktivera flöde och avdunstning under avbildning. Ett alternativ till glastäcket är att tillsätta 1 ml paraffinolja på toppen.
- Ta bilder av nanopartiklarna med hjälp av ett konfokalmikroskop med ett 40x oljeobjektiv med 8x extra zoom i bildbehandlingsprogrammet (se Materialförteckning).
OBS: Ett högre förstoringsmål kan användas istället för att använda ytterligare digital zoom i programvaran.- Avbilda en tidsslinga utan fördröjning (helst ~19 bilder/s) i ett enda z-plan i 2 minuter med minst fyra nanopartiklar inom synfältet. Upprepa 15 till 20 gånger på olika platser för att samla in tillräckligt med data för statistik (100 till 200 nanopartiklar).
- Använd en partikelspårningsprogramvara för att analysera partiklarnas förskjutning. Här används ett specialskrivet skript baserat på den klassiska Crocker-Grier-algoritmen för att spåra masscentrum för nanopartikeln35 (se tilläggsfil 7).
- Från partikelspårningen beräknas den genomsnittliga kvadratiska förskjutningen (MSD). MSD kommer att uppvisa fri diffusion i porutrymmet vid korta längder och tidsskalor och övergå till subdiffusiv skalning vid stora längder och tidsskalor på grund av inneslutning35.
- Identifiera längdskalan där övergången till subdiffusiv skalning sker för att uppskatta den lokala porstorleken. Beräkna porstorleken genom att addera denna längdskala till nanopartikelns diameter. Upprepa porstorleksanalysen för varje nanopartikel som mäts. Detta ger en porstorleksfördelning från vilken en genomsnittlig porstorlek kan beräknas (t.ex. figur 3).
8. 3D utskriftsprocess
- 3D-printa specialtillverkade hållare för provbehållarna (se tilläggsfiler 4-6 för CAD-filerna ). Här används hållare för vävnadsodlingskolvarna och mikrokyvetter. Hållarna gör det möjligt att programmera skrivaren för att skriva ut flera prover i en enda utskriftssession. Placera provbehållarna med hydrogelmedia i hållarna på byggplattformen.
- Öppna programmet för 3D-utskrift. Ladda en förprogrammerad g-kod i programvaran. För de representativa resultaten används steg 3.1 för att ladda bakteriesuspensionen i 3D-skrivaren.
Ett exempel på en g-kod för utskrift av linjära vertikala geometrier ges i tabell 1. - Genom 3D-utskriftsprogramvaran flyttar du x-y-z-planen för att centrera skrivhuvudet på xy-planet för att vara den första behållaren och sedan hem z-axeln. Den målsökande z-axeln höjer skrivhuvudet. Vrid skruven långsamt manuellt för att trycka in sprutkolven tills en liten mängd av bakteriesuspensionen syns på nålspetsen.
- Torka lätt av överflödig bakteriesuspension med en steril engångsservett. Baserat på höjden på provhållaren, nålen och sprutan, med hjälp av 3D-utskriftsprogrammet, sänk skrivhuvudet ett fast avstånd in i hydrogelmediet i den provbehållare du väljer. Starta utskriftsprocessen genom att klicka på Skriv ut.
- När utskriften är klar stänger du provbehållarna. Torka av skrivaren med 70 % etanol. Kassera sprutan och nålen på rätt sätt.
9. Odling och avbildning av V. cholerae
- För bildbehandling med stort synfält, använd en kamera med ett zoomobjektiv för att bildcellstillväxt med en ljuslåda. Ta en bild av proverna direkt efter utskrift i rumstemperatur och överför dem sedan till en inkubator. Förvara proverna vid 37 °C i en stationär inkubator mellan avbildningssessionerna under experimentet.
- Ta bilder under en önskad tid för att observera tillväxtbeteendet under långa perioder i den granulära hydrogelmatrisen.
Representative Results
Genom att använda en 3D-bioprinter med den granulära hydrogelmatrisen kan bioprinters förmåga att skriva ut bakteriekolonier i former som, när de skrivs ut på ett plant substrat istället, skulle sjunka ihop på grund av den låga viskositeten hos bakteriesuspensionen. Upplösningen på tillvägagångssättet som presenteras här beror på extruderingshastigheten, nålens storlek, skrivhuvudets hastighet, luft i nålen och viskositeten hos bakteriesuspensionen. På grund av den låga volymen av bakteriesuspension kan luftbubblor oavsiktligt föras in under laddningen av den bakteriella suspensionen i sprutan och nålen. Detta kan leda till att en luftbubbla avsätts i den slutliga tryckta strukturen (figur 4). Ett annat sätt för luftbubblor att föras in i trycket är om man inte trycker in kolven för att bilda en liten droppe bakteriesuspension vid nålspetsen före tryckning och det finns en luftspalt vid nålspetsen. Att inte trycka ner sprutkolven före utskrift kan också leda till att olika volymer av celler skrivs ut i samma sats. Men allt eftersom tiden går löses luftbubblan upp i det omgivande mediet, som visas i figur 4.
För kalibrering av extruderingssteget är den deponerade volymen beroende av hur skrivhuvudets linjära ställdon översätter sprutkolven, sprutans innerdiameter kommer direkt att påverka volymen. Vidare kommer de reologiska egenskaperna hos bakteriesuspension att påverka hur lätt de skjuvas genom nålens sammandragning för att skriva ut smidigt. Således bör denna kalibreringsprocedur göras om för varje spruta/nål/bakteriesuspension. I princip skulle sprutkalibreringen kunna automatiseras. I praktiken skulle det dock vara en utmaning att skriva en sådan kod som i stort sett gäller för många användningsfall. Till exempel skulle en användare som vill kalibrera extruderingen av cirka 300 μl från en 1 ml spruta behöva ladda om sprutan mycket oftare än en användare som kalibrerar runt en målvolym på 30 μl. Eftersom konstanten E-steg till volymkalibrering är okänd när kalibreringsprocessen börjar, kanske användaren inte kan förutsäga exakt hur ofta omladdning faktiskt krävs. För att automatisera kalibreringsprocessen måste dessutom de exakta positionerna för varje förvägt 1,5 ml-rör specificeras. För att säkerställa att allt biobläck deponeras från nålen till röret för noggrann kalibrering måste exakt kontakt göras mellan nålen och tubens botten/vägg. Utan god kontakt kan små droppar förbli fuktade och fästa vid nålen. Således kan varje positionsvariation mellan rören i hög grad bidra till fel i kalibreringsprocessen. Av dessa skäl rekommenderar författarna att varje användare bygger ett kalibreringsprogram som passar deras unika behov.
En viktig del av det tillvägagångssätt som presenteras här är förmågan att visualisera bakterier som sprider sig genom sina miljöer direkt via motilitet och tillväxt med hjälp av avbildning. I en tidigare version av protokollet för avbildning fylldes 6-brunnsplattor med 19 ml av en granulär hydrogelmatris. Men även med en lyckad 3D-utskrift av en horisontell linje av celler som kunde observeras på ett inverterat mikroskop, skulle en tät koloni också växa på mediets ovansida, vilket begränsar visualiseringen med ljusfältsmikroskopi (figur 5). Kolonin på ovansidan var troligen ett resultat av kontaminering när sprutnålen placerades i eller togs bort från mediet under utskriften. För att kringgå detta problem skrivs vertikala linjer av celler ut i scintillationsflaskor (figur 6A). Krökningen av de cylindriska ampullerna orsakade dock distorsion under avbildningen. Detta ledde till valet av plattväggiga kyvetter och vävnadsodlingskolvar som provbehållare för utskrift, vilket möjliggjorde oförvrängd avbildning (figur 6B-D). En begränsning med vävnadsodlingskolvar är den lilla lutande halsen som begränsar de geometrier som kan skrivas ut.
Sammantaget möjliggör detta protokoll observation av bakteriell rörlighet och tillväxt i komplexa porösa miljöer över långa tidsskalor. Några exempel visas i figur 6B-G för biofilmbildande V. cholerae med hjälp av ljusfältsmikroskopi samt planktonceller av E. coli med hjälp av laserskanning fluorescens konfokalmikroskopi, vilket visar mångsidigheten i detta tillvägagångssätt. Faktum är att ett potentiellt problem med hydrogelmatriser är deras möjliga autofluorescens när de avbildas med fluorescensmikroskopi; Bilderna som visas i figur 6F,G visar dock att sådan autofluorescens är minimal i den experimentella plattformen som presenteras här. En annan begränsning för sådana optiska mikroskopimetoder är deras rumsliga upplösning, som bestäms av diffraktionsgränsen vid ~100 s nanometer; Denna längdskala är dock mycket mindre än storleken på en enskild bakteriecell, och därför ger optiska tekniker förmågan att avbilda bakterieceller från skalan för enskilda celler (figur 6G) till skalan för större, flercelliga kolonier 30,31,32,33. Ytterligare exempel beskrivs nedan.
Som nämnts ovan kan det tillvägagångssätt som presenteras här användas för att 3D-printa och avbilda bakteriekolonier i små (1 ml) och stora (20 ml) matrisvolymer. Därför beskrivs skillnaderna i de resultat som erhålls med olika volymer nedan, med 3D-printade kolonier av rörliga och icke-rörliga V. cholerae som representativa exempel. Den rumsliga upplösningen (linjens bredd) för utskriften bestäms av munstyckets innerdiameter. I exemplen som beskrivs nedan resulterar en nål med en innerdiameter på 0,6 mm i en initial cylindrisk koloni på 0,6 mm. Tidigare forskning har visat att utskriftsupplösningen kan minskas ytterligare genom att använda en kapillär av draget glas med en innerdiameter på ~100-200 μm33.
För de små volymerna används två olika granulära hydrogelmatriser med två olika porstorleksfördelningar: en med en genomsnittlig porstorlek som är större än medeldiametern för en V. cholerae-cell, 0,2-0,4 μm36, och den andra med en genomsnittlig porstorlek som är mindre än denna diameter. Proverna under tolv dagar avbildas och mäts genom bildanalys av koloniernas ytexpansion över tid (Figur 7 och Figur 8). För icke-rörliga celler, som bara kan sprida sig genom sin omgivning genom cellulär tillväxt, var arealexpansionshastigheten likartad mellan de olika undersökta matriserna (Figur 7), vilket indikerar att skillnader i matrisporstorlek inte påverkar cellulär spridning genom tillväxt - som förväntat. Däremot, för de rörliga cellerna som sprider sig genom sin omgivning genom aktiv rörlighet, var hastigheten för areal expansion av V. cholerae högre för hydrogelmatrisen med de större porerna - för vilka inneslutning av hydrogelkornen hindrar cellulär rörlighet mindre. Dessa skillnader i bakteriespridning var också tydliga i koloniernas morfologier (Figur 8). Kolonin av V. cholerae i hydrogelmatriser med större porer sprider sig genom släta, diffusa plymer (Figur 8A), vilket återspeglar spridning genom aktiv rörlighet som tidigare observerats32. I överensstämmelse med denna tolkning observeras inte dessa diffusa plymer när det gäller icke-rörliga celler (Figur 8C). Dessutom är porerna tillräckligt stora för att cellerna inte ska trycka på pärlorna när de simmar genom porerna. Dessutom är den viskösa spänningen som appliceras vid simning mindre än 1 Pa, vilket är otillräckligt för att deformera den omgivande hydrogelmatrisen märkbart. Däremot sprider sig kolonin i hydrogelmatriser med mindre porer endast genom grova, fraktalliknande plymer för både rörliga och icke-rörliga celler (Figur 8B,D), vilket återspeglar spridning enbart genom celltillväxt, medan cellerna växer deformeras de tillfälligt och ger den omgivande matrisen. I själva verket, med tanke på att sträckgränsen för hydrogelmatriserna är mycket mindre än cellernas turgortryck, i denna gräns för liten porstorlek, ger matrisen endast svagt motstånd mot cellulär tillväxt och verkar inte starkt påverka den 3D-printade strukturen, vilket också verifierats i vårt tidigare arbete37.
Liknande resultat observeras för experiment som utförs i stora volymprover; Men med tanke på det större överflödet av näringsämnen i dessa prover kunde experimenten upprätthålla celltillväxt över längre tidsskalor. Som ett exempel visas resultat med de granulära hydrogelmatriserna där den genomsnittliga porstorleken var mindre än cellstorleken - och därmed berodde cellulär spridning främst på tillväxt. Proverna avbildas under ~30 dagar i de granulära hydrogelmatriserna och observeras liknande ytexpansion för både icke-rörliga och rörliga celler under de första 150 timmarna; Vid ännu längre tidpunkter observeras dock en stark variation mellan proverna, där vissa prover uppvisar snabbare spridningshastigheter (figur 9 och figur 10). Intressant nog, vid omprovtagning av hydrogelmatrisen efter experimentet - en fördel med den stora volymen av hydrogelmatrisen - mäts en minskning av sträckspänning, lagringsmoduler och förlustmoduler (Figur 11), vilket indikerar att matriserna blev mjukare. Denna förändring kan bero på att V. cholerae producerar en molekyl som förändrar hydrogelmatrisens egenskaper och främjar cellulär spridning vid långa tidpunkter, vilket kommer att vara intressant att testa i framtida forskning. Exempel på de grova, fraktalliknande kolonimorfologier som resulterar i dessa experiment visas i figur 10.
Figur 1: Bilder av den specialbyggda 3D-bioprintern. (A) Bioprinter med en modifierad spruta, pump, extruderhuvud med en Luer lock-spruta och nål för engångsbruk. Bioprintern är ~46 cm bred. (B) Bild av 3D-utskrift av celler i kolvar fyllda med hydrogelmatris som fastnat. Bredden på bilden är 87 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Karakterisering av de reologiska egenskaperna hos de granulära hydrogelmatriserna. (A) Skjuvspänning som en funktion av den applicerade skjuvhastigheten. (B) Lagrings- och förlustmoduler, G' respektive G'', som en funktion av svängningsfrekvensen. Legenden anger den hydrogelmassfraktion som används för att framställa varje hydrogelmatris. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Porstorleksmätningar av två representativa granulära hydrogelmatriser. Genom att spåra spårämnen bestäms fördelningen av karakteristiska pordimensioner för varje hydrogelmatris. Data representeras av 1-CDF, där CDF är den kumulativa fördelningsfunktionen. Legenden anger den hydrogelmassfraktion som används för att framställa varje matris. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på bubblor som bildas vid 3D-utskrift av bakterier. (A) Schematisk bild av bilduppställningen. (B) Ögonblicksbilder av tillväxten av V. cholerae med en bubbla längst ner på trycket (röd ruta) i 1,2 % hydrogelmatris svullen i LB. Efter 59 timmars odling vid 37 °C är luftbubblan helt upplöst och kolonin kollapsar tillbaka på grund av hydrogelmatrisens elasticitet. Skalstreck = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Bilder av den horisontella linjen av rörlig V. cholerae tryckt i en platta med sex brunnar fylld med 1,2 % hydrogelmatris svullen i LB och den biofilm som bildades på ovansidan efter 48 timmars inkubation vid 37 °C. (A) Schematisk bild av bildtagningsinställningen. (B) Biofilmbildningen på ovansidan på grund av kontaminering under 3D-utskrift minskar opaciteten och möjliggör inte tydlig avbildning av den horisontella linjen. Den övre ytan bildar rynkor, förmodligen på grund av differentiell tillväxt. Skalstreck = 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 6: Exempel på olika exempelbehållare som kan användas i den här metoden. (A) V. cholerae tryckt i en injektionsflaska av glas fylld med 1,2 % granulär hydrogelmatris efter 470 timmar. Injektionsflaskans krökning gör det svårt att avbilda tillväxten. Skalstreck = 5 mm. (B) V. cholerae tryckt i en mikrokyvett fylld med 1,2 % granulär hydrogelmatris. De platta sidorna möjliggör tydlig avbildning, men de små volymerna begränsar längden på experimenten innan cellerna får slut på tillväxtsubstrat. (C) Bildinställning med ett zoomobjektiv för att avbilda V. cholerae tryckt i en vävnadsodlingskolv fylld med 1,2 % granulär hydrogelmatris. I likhet med mikrokyvettfodralet möjliggör de platta sidorna en tydlig bildbehandling. Vävnadsodlingskolvarna kan fyllas med större volymer granulär hydrogelmatris, vilket förlänger experimenttiden. (D) Bild från zoomobjektivet av V. cholerae tryckt inuti en 1,2 % granulär hydrogelmatris efter 100 timmars inkubation vid 37 °C. Skalstreck = 1 mm. (E) Bilduppställning med ett konfokalmikroskop för att avbilda fluorescerande celler. F) 3D-projektion av konfokalmikroskop av fluorescerande E. coli inuti den granulära hydrogelmatrisen med 1,2 % efter 10 dagars inkubation vid 37 °C. Skalstapel = 50 μm. (G) Konfokalmikroskop med encellsupplösning av fluorescerande E. coli inuti hydrogelmatrisen. Skalstapel = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Areaexpansion som en funktion av tiden för kolonier av V. cholerae tryckt i 1 ml granulära hydrogelstödmatriser. Uppgifterna i diagrammet kommer från bildanalysen i figur 8. Det observerades att rörliga celler (slutna röda cirklar och kvadrater) spred sig i snabbare takt än de icke-rörliga cellerna, vilket återspeglar spridning genom både tillväxt och rörlighet. Dessutom sprider sig de rörliga cellerna i hydrogelmatrisen med en stor porstorlek (röda rutor) i snabbare takt än cellerna i hydrogelmatrisen med 0,3 μm porer (röda cirklar). Icke-rörliga celler visar ingen skillnad i arealexpansionshastighet mellan de två porstorlekarna, eftersom de bara växer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Kolonier av V. cholerae tryckta i 1 ml granulära hydrogelstödmatriser. (A) Ögonblicksbilder av tillväxt och rörlighet hos rörlig V. cholerae i 0,9 % granulär hydrogelmatris där porstorleken är större än den genomsnittliga celldiametern. Pilar indikerar en diffus plym som bildas på grund av att celler rör sig genom hydrogelmatrisen. (B) Ögonblicksbilder av tillväxt och motilitet hos rörlig V. cholerae i en 1,2% granulär hydrogelmatris där porstorleken är mindre än den genomsnittliga celldiametern. Pilar indikerar grov, fraktalliknande plym som bildas på grund av celltillväxt. (C) Ögonblicksbilder av tidsutvecklingen av icke-rörlig V. cholerae i 0,9 % granulär hydrogelmatris där porstorleken är större än den genomsnittliga celldiametern. I detta fall kan diffusa plymer som reflekterar motilitet inte observeras. (D) Ögonblicksbilder av tillväxten av icke-motil V. cholerae i en 1,2 % granulär hydrogelstödmatris där porstorleken är mindre än den genomsnittliga celldiametern. I detta fall kan grova, fraktalliknande plymer som reflekterar tillväxt återigen observeras. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Areaexpansion som en funktion av tiden för kolonier av V. cholerae utskrivna i 20 ml 1,2 % granulära hydrogelstödmatriser. Icke-rörliga (öppna cirklar) och rörliga celler (slutna cirklar) observeras sprida sig med liknande hastighet under de första 100 timmarna. Efter 100 timmar observeras skillnader i arealexpansionshastigheten, vilket kan bero på utvecklingen av variabilitet vid långa tidpunkter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Kolonier av V. cholerae utskrivna i 22 ml 1,2 % granulära hydrogelmatriser odlade vid 37 °C. (Överst) Ögonblicksbilder av tillväxt av rörlig V. cholerae. (Nederst) Ögonblicksbilder av tillväxten av icke-rörliga V. cholerae. I båda fallen kan grova, fraktalliknande plymer som reflekterar tillväxt observeras. Skalstreck = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Karakterisering av de reologiska egenskaperna hos den 1,2 % granulära hydrogelmatrisen före (0 timmar) och efter experimentet (397 timmar). (A) Skjuvspänning som en funktion av den applicerade skjuvhastigheten. (B) Lagrings- och förlustmoduler, G' respektive G'', som en funktion av den anbringade svängningsfrekvensen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Gcode-kommandon | Uppgifter | |||
| M82 (M82) | Absolut extruderingsläge | |||
| M302 S0 | Aktivera kall extrudering | |||
| M92 E14575 | Ställ in extruderingsstegen per mm | |||
| G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 | Ställ in z-axeln och extruderingspositionen på noll och x-,y-positionen på 35,71 mm och y 88 mm där skrivhuvudet är när g-koden startar | |||
| M221 S100 T0 | Ställer in flödeshastigheten på 100 % | |||
| M107 | Stäng av fläkten | |||
| G1 F1 X35.61 Y81 E0.1 | Extrudera 20 μL biobläck i matrisen med en matningshastighet på 50 μL/min där den aktuella positionen ställdes in | |||
| G0 F200 Z60 | Dra ut nålen ur matrisen och ta provet med en hastighet av 200 mm/min | |||
| G0 F500 X65.81 Y81.0 | Flytta nålen till nästa provbehållare med en hastighet av 500 mm/min | |||
| G0 F100 Z0 | Sänk nålen i nästa provbehållare till samma z-position där utskriften startade med en hastighet av 100 mm/min | |||
| G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 | Extrudera 20 μL biobläck i matrisen med en matningshastighet på 50 μL/min där den aktuella positionen ställdes in | |||
| G0 F200 Z60 | Dra ut nålen ur matrisen och ta provet med en hastighet av 200 mm/min | |||
| G0 F500 X96.01 Y81.0 | Flytta nålen till nästa provbehållare med en hastighet av 500 mm/min | |||
| G0 F100 Z0 | Sänk nålen i provbehållaren till samma z-position där utskriften startade med en hastighet av 100 mm/min | |||
| G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 | Extrudera 20 μL biobläck i matrisen med en matningshastighet på 50 μL/min där den aktuella positionen ställdes in | |||
| G0 F200 Z60 | Dra ut nålen ur matrisen och ta provet med en hastighet av 200 mm/min | |||
| G0 F500 X126.21 Y81.0 | Flytta nålen till nästa provbehållare med en hastighet av 500 mm/min | |||
| G0 F100 Z0 | Sänk nålen i nästa provbehållare till samma z-position där utskriften startade med en hastighet av 100 mm/min | |||
| G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 | Extrudera 20 μL biobläck i matrisen med en matningshastighet på 50 μL/min där den aktuella positionen ställdes in | |||
| G0 F200 Z80 | Dra ut nålen ur matrisen och ta provet med en hastighet av 200 mm/min | |||
Tabell 1: G-kodsprogrammering för utskrift av vertikala linjer i bakteriesuspensionen.
Tilläggsfil 1: STL-fil för bottenklämman 1 ml Luer lock-engångssprutor för sprutextrudern. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletteringsfil 2: STL-fil för toppklämman för 1 ml Luer lock-engångssprutor för sprutextrudern. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 3: STL-fil för sprutadaptern för 1 ml Luer lock-engångssprutor för engångsbruk för sprutextrudern. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 4: STL-fil för kyvettprovhållaren. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 5: STL-fil för vävnadskolvens provhållare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletteringsfil 6: STL-fil för 6-hålsplattan och 35 mm petriskåltryckbädden. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 7: Anpassat skript för partikelspårning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Det är viktigt att se till att matrisen tillverkas i en steril miljö när man bereder varje hydrogelmatris. Om inte, kan kontaminering uppstå, vilket visar sig som t.ex. mikrokolonier (små sfäroider) i matrisen efter flera dagar. Under blandningsprocessen är det viktigt att alla torra granulära hydrogelpartiklar löses upp. Dessutom, när man justerar pH för varje hydrogelmatris med NaOH, kommer granulerna att börja svälla, vilket ökar hydrogelmatrisens viskositet, vilket leder till att blandningen blir svårare. Att använda stativblandaren hjälper till att säkerställa att NaOH är väl blandat i hydrogelmatrisen. Under laddningen av varje bakteriesuspension kan luftfickor bildas i nålen. För att undvika detta problem, se till att nålspetsen alltid sitter i bakteriesuspensionen i centrifugröret och inte i botten av röret eller nära den övre ytan. Ett annat sätt att komma till rätta med detta problem är att odla stora volymer celler och på så sätt ha större volymer av bakteriesuspensionen för utskrift.
Begränsningar
För närvarande, under tryckning, begränsar den låga viskositeten hos bakteriesuspensionen de geometrier som kan skrivas ut och leder ofta till att en biofilm bildas och växer på toppen av hydrogelmatrisens yta på grund av spårceller. Det finns några potentiella metoder för att övervinna denna begränsning, inklusive att öka viskositeten hos bakteriesuspensionen eller ytterligare optimera 3D-skrivarinställningarna. För att öka viskositeten hos bakteriesuspensionen kan man blanda bakteriesuspensionen med en annan polymer - till exempel alginat, som tidigare har använts för 3D-utskrift av bakterier på plana ytor38. Skrivarinställningarna kan optimeras ytterligare för att möjliggöra indragning av sprutkolven när nålen dras ut från den granulära hydrogelmatrisen, vilket skulle kunna förhindra att celler deponeras när nålen avlägsnas från hydrogelmatrisen.
Metodens betydelse i förhållande till befintliga/alternativa metoder
Metoden som beskrivs här gör det möjligt att skriva ut bakteriekolonier i granulära hydrogelmatriser. De granulära hydrogelmatriserna gör det möjligt att studera inverkan av yttre miljöfaktorer (t.ex. porstorlek, matrisdeformerbarhet) på bakteriernas rörlighet och tillväxt. Dessutom, medan LB i detta arbete används som flytande tillväxtmedium för att svälla hydrogelmatrisen, kan hydrogelmatrisen svällas med andra flytande tillväxtmedier, inklusive media med antibiotika. Tidigare metoder för att studera bakterier i trånga miljöer begränsades av längden på experimenttiden, polymermaskans storlek och omgivande hydrogelmatrisstyvhet37,38. Det finns redan protokoll för att göra granulära hydrogelmatriser av olika polymerer, så potentialen för att studera effekterna av olika miljöförhållanden på bakteriers rörlighet och tillväxt är enorm. Denna metod gör det möjligt att studera bakterier i kontrollmiljöer som lättare rekapitulerar de miljöer som bakterier lever i i den verkliga världen, såsom värdslem eller jord. En annan begränsning för många andra metoder är opaciteten hos den omgivande matrisen; Detta tillvägagångssätt med optiskt transparenta material ger dock möjlighet att utforska t.ex. optogenetisk kontroll och mönstring av bakterier i 3D.
Förutom att studera rörlighet och tillväxt övervinner 3D-utskriftsmetoden som beskrivs här begränsningen hos många andra bioprintningsmetoder som kräver deponering av ett biobläck på ett substrat och därför är begränsade i höjden på det konstruerade levande material de kan producera. I framtiden kan detta bioprintningsprotokoll utvidgas ytterligare för att tillverka biohybridmaterial genom att blanda polymerer med biofilmbildande celler. De granulära hydrogelmatriserna ger stöd för 3D-utskrift av tjockare, mer storskaliga konstruerade levande material och mer komplexa geometrier än många andra nuvarande bakteriebioprintningsmetoder. Även om detta arbete endast använde V. cholerae och E. coli, har andra arter, såsom Pseudomonas aeruginosa, också framgångsrikt 3D-printats37. Utöver utskrift kan skrivaren anpassas för att göra en kontrollerad provtagning av bakterier efter tillväxt för att se om det till exempel har skett några genetiska förändringar.
Disclosures
Den experimentella plattformen som används för att 3D-printa och avbilda bakteriesamhällen i denna publikation är föremål för en patentansökan inlämnad av Princeton University på uppdrag av Tapomoy Bhattacharjee och S.S.D. (PCT Application number PCT/US/2020/030213).
Acknowledgments
R.K.B. erkänner stöd från Presidential Postdoctoral Research Fellows Program. Detta material är också baserat på arbete som stöds av NSF Graduate Research Fellowship Program Grant DGE-2039656 (till AMH). A.S.D.-M. och H.N.L. bekräftar stöd från Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund vid Princeton University. Vi tackar också Bonnie Basslers laboratorium för att ha tillhandahållit stammar av V. cholerae. S.S.D. erkänner stöd från NSF Grants CBET-1941716, DMR-2011750 och EF-2124863, samt Eric och Wendy Schmidt Transformative Technology Fund, New Jersey Health Foundation, Pew Biomedical Scholars Program och Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| 1 mL Luer lock syringe | BH Supplies | BH1LL | |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| 100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres) | Invitrogen, (ThermoFischer Scientific) | F8803 |
|
| 15 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-237 | |
| 20 G blunt needle | McMaster Carr | 75165A252 | |
| 25 mL tissue culture flasks | VWR | 10861-566 | |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot Mini 2 | |
| 3D printing software | Cura | Cura-Lulzbot | |
| 50 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-239 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Carbomer Granular Hydrogel Particles | Lubrizol | Carbopol 980NF | dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers |
| Centrifuge (2 mL tube capacity) | VWR | 2405-37 | |
| Centrifuge (50 mL tube capacity) | ThermoFischer Scientific | 75007200 | Sorvall (brand) ST 8 (model) |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R+ inverted laserscanning confocal microscope |
|
| Glass bottom petri dish | Cellvis | D35-10-1-N | |
| Lennox LB (Lubria Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap | McMaster Carr | 91290A478 | |
| M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut | McMaster Carr | 93187A300 | |
| Open-source syringe pump | Custom-made | Replistruder 4 | https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791 |
| Petri dish (60 mm round) | ThermoFischer Scientific | FB0875713A | |
| Shear Rheometer | Anton Paar | MCR 501 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-992 |
References
- Persat, A., et al.
- Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system. Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).
- Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores. Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).
- Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387 (2017).
- Grice, E. A., Segre, J. A.
- Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).
- Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more. Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).
- Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).
- Harman, M. W., et al. The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Siitonen, A., Nurminen, M. Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).
- Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola. Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).
- O’Neil, H. S., Marquis, H. Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion. Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).
- Gill, C. O., Penney, N.
- Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding. Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).
- Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration. Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).
- Toley, B. J., Forbes, N. S. Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue. Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).
- Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).
- de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).
- Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots. FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).
- Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. Rhizosphere biology and crop productivity—a review. Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).
- Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment. Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).
- Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources. Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).
- Ford, R. M., Harvey, R. W. Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).
- Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies. Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).
- Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Influence of confinement on the spreading of bacterial populations. PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063 (2022).
- Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. A biophysical threshold for biofilm formation. eLife. 11, e76380 (2022).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).
- Bhattacharjee, T., et al. Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming. Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media. Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. Chemotactic migration of bacteria in porous media. Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).
- Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S.
- Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting. HardwareX. 9, e00170 (2021).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 9671 (2017).
- Martínez-Calvo, A., et al. Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119 (2022).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward approach for 3D bacterial printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Zhang, Q., et al. Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118 (2021).
