Summary
Bu protokol, geleneksel sıvı kültürlerden veya Petri kaplarından daha doğal yaşam alanlarına daha çok benzeyen karmaşık 3D gözenekli hidrojel matrislerinde hareketliliklerini ve büyümelerini incelemek için bakteri kolonilerinin üç boyutlu (3D) baskısı için bir prosedürü açıklar.
Abstract
Bakteriler, biyolojik dokular ve jeller gibi karmaşık üç boyutlu (3B) gözenekli ortamlarda ve yüzey altı toprakları ve çökeltilerinde her yerde bulunur. Bununla birlikte, önceki çalışmaların çoğu, birçok doğal bakteri habitatının karmaşıklığını tam olarak özetlemeyen, dökme sıvılardaki veya düz yüzeylerdeki hücrelerin çalışmalarına odaklanmıştır. Burada, bilgideki bu boşluk, yoğun bakteri kolonilerini sıkışmış granüler hidrojel matrislerine 3D yazdırmak için bir yöntemin geliştirilmesini açıklayarak ele alınmaktadır. Bu matrisler ayarlanabilir gözenek boyutlarına ve mekanik özelliklere sahiptir; hücreleri fiziksel olarak sınırlarlar, böylece onları 3 boyutlu olarak desteklerler. Optik olarak şeffaftırlar ve görüntüleme kullanarak çevrelerindeki bakteri yayılımının doğrudan görselleştirilmesine izin verirler. Bu prensibin bir kanıtı olarak, burada, bu protokolün yeteneği, değişen interstisyel gözenek boyutlarına sahip sıkışmış granüler hidrojel matrislerinde hareketsiz ve hareketli olmayan Vibro koleraların yanı sıra hareketsiz Escherichia coli'nin 3D baskı ve görüntüleme ile gösterilmiştir.
Introduction
Bakteriler genellikle bağırsaktaki ve akciğerlerdeki mukozal jellerden yerdeki toprağa kadar çeşitli, karmaşık 3D gözenekli ortamlarda yaşar 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. Bu ortamlarda, hareketlilik veya büyüme yoluyla bakteri hareketi, hücrelerin çevrelerineyayılma yeteneğini etkileyen polimer ağları veya katı mineral tanecikleri paketleri gibi çevredeki engeller tarafından engellenebilir 26, besin kaynaklarına erişme, yeni arazileri kolonileştirme ve koruyucu biyofilm topluluklarıoluşturma 27. Bununla birlikte, geleneksel laboratuvar çalışmaları tipik olarak sıvı kültürlerdeki veya düz yüzeylerdeki hücrelere odaklanan oldukça basitleştirilmiş geometriler kullanır. Bu yaklaşımlar mikrobiyoloji hakkında önemli bilgiler verirken, doğal yaşam alanlarının karmaşıklığını tam olarak özetlemezler ve gerçek dünya ortamlarında gerçekleştirilen ölçümlere kıyasla büyüme oranlarında ve hareketlilik davranışında çarpıcı farklılıklara yol açarlar. Bu nedenle, bakteri kolonilerini tanımlamak ve doğal yaşam alanlarının çoğuna daha çok benzeyen 3D gözenekli ortamlarda hareketliliklerini ve büyümelerini incelemek için bir yönteme kritik olarak ihtiyaç vardır.
Hücreleri bir agar jeline aşılamak ve daha sonra makroskopik yayılımlarını gözle veya bir kamera kullanarak görselleştirmek, ilk olarak 1936'da Tittsler ve Sandholzer tarafından önerildiği gibi, bunu başarmanın basit bir yolunu sağlar28. Bununla birlikte, bu yaklaşım bir dizi önemli teknik zorluktan muzdariptir: (1) Gözenek boyutları, prensip olarak, agaroz konsantrasyonu değiştirilerek değiştirilebilirken, bu tür jellerin gözenek yapısı zayıf bir şekilde tanımlanmıştır; (2) Işık saçılımı, bu jellerin bulanıklaşmasına neden olarak, özellikle büyük numunelerde, hücrelerin bireysel ölçekte yüksek çözünürlük ve doğrulukla görselleştirilmesini zorlaştırır; (3) Agar konsantrasyonu çok büyük olduğunda, hücre göçü jelin üst düz yüzeyi ile sınırlıdır; (4) Bu tür jellerin karmaşık reolojisi, iyi tanımlanmış geometrilere sahip aşıların eklenmesini zorlaştırır.
Bu sınırlamaları ele almak için, önceki çalışmalarda, Datta'nın laboratuvarı, hücreleri 3 boyutlu olarak sınırlamak için "gözenekli Petri kapları" olarak sıvı bakteri kültüründe şişmiş sıkışmış, biyouyumlu hidrojel parçacıklarından oluşan granüler hidrojel matrislerini kullanarak alternatif bir yaklaşım geliştirdi. Bu matrisler yumuşak, kendi kendini iyileştiren, akma stresli katılardır; bu nedenle, diğer biyo-baskı işlemlerinde kullanılan çapraz bağlı jellerden farklı olarak, bir enjeksiyon mikronozu, hidrojel parçacıklarını yerel olarak yeniden düzenleyerek öngörülen herhangi bir 3D yol boyunca matris içinde serbestçe hareket edebilir29. Bu parçacıklar daha sonra hızla yeniden yoğunlaşır ve enjekte edilen bakterilerin etrafında kendi kendini iyileştirir ve herhangi bir ek zararlı işlem yapmadan hücreleri yerinde destekler. Bu nedenle bu işlem, bakteri hücrelerinin ayarlanabilir fizikokimyasal özelliklere sahip gözenekli bir matris içinde - istenen bir 3D yapıda, tanımlanmış bir topluluk bileşimi ile - düzenlenmesini sağlayan bir 3D baskı şeklidir. Ayrıca, hidrojel matrisleri tamamen şeffaftır ve hücrelerin görüntüleme kullanılarak doğrudan görselleştirilmesini sağlar.
Bu yaklaşımın faydası daha önce iki şekilde gösterilmiştir. Bir dizi çalışmada, seyreltik hücreler hidrojel matrisi boyunca dağıldı, bu da tek tek bakterilerinhareketliliğinin incelenmesini sağladı 30,31. Başka bir dizi çalışmada, çok hücreli topluluklar, programlanabilir bir mikroskop aşamasına monte edilmiş bir enjeksiyon nozulu kullanılarak santimetre ölçekli jellerde 3D olarak basıldı ve bu da bakteri kollektiflerinin çevrelerine yayılmasına ilişkin çalışmaları mümkün kıldı32,33. Her iki durumda da, bu çalışmalar, gözenekli ortamlarda yaşayan bakterilerin yayılma özelliklerinde, sıvı kültürdeki/düz yüzeylerdekilere kıyasla daha önce bilinmeyen farklılıkları ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bir mikroskop aşamasına monte edildikleri göz önüne alındığında, bu önceki çalışmalar küçük numune hacimleri (~ 1 mL) ve dolayısıyla kısa deneysel zaman ölçekleri ile sınırlıydı. Ayrıca, yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip aşı geometrilerini tanımlama yetenekleri de sınırlıydı.
Burada, her iki sınırlamayı da ele alan bu deneysel platformun yeni nesli açıklanmaktadır. Spesifik olarak, 3D baskı ve bakteri kolonilerini büyük ölçeklerde görüntülemek için bağlı bir şırınga ekstrüderi ile modifiye edilmiş bir 3D yazıcının kullanılabileceği protokoller sağlanır. Ayrıca, temsili veriler, bu yaklaşımın, biyofilm oluşturucu Vibrio cholerae ve planktonik Escherichia coli'yi örnek olarak kullanarak, bakterilerin hareketliliğini ve büyümesini incelemek için nasıl yararlı olabileceğini göstermektedir. Bu yaklaşım, bakteri kolonilerinin uzun süre sürdürülmesini ve çeşitli görüntüleme teknikleri kullanılarak görselleştirilmesini sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşımın 3D gözenekli habitatlardaki bakteri topluluklarını inceleme yeteneği, bağırsak, cilt, akciğer ve topraktaki mikropların tedavisini ve çalışmasını etkileyen muazzam araştırma ve uygulamalı potansiyele sahiptir. Dahası, bu yaklaşım gelecekte bakteri bazlı tasarlanmış canlı malzemelerin daha karmaşık bağımsız şekillere 3D baskısı için kullanılabilir.
Protocol
Bu yaklaşım, Tashman ve ark.34 tarafından önceden oluşturulmuş bir protokol kullanarak ticari bir 3D kaynaşmış biriktirme modelleme yazıcısını bir 3D biyoyazıcıya dönüştürmektir. Kısaca, Tashman ve ark. ticari bir ekstrüder kafasını özel yapım bir şırınga pompası ekstrüderi ile değiştirdi. Bu ekstrüder, ekstrüde hacmi ve G kodu programlama dili tarafından kontrol edilen 3D konumu ile bakteri hücrelerinin yüksek konsantrasyonlu sıvı süspansiyonlarının 3D olarak basılmasını sağlar. Ekstrüde edilen hacim, yazılımda ekstrüder adımı (E-adımı) ile belirtilir ve ayrıca aşağıda daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kalibre edilir. Bu bakteri süspansiyonları böylece doğrudan hücreler için 3D destek görevi gören granüler bir hidrojel matrisine basılır. Aşağıda, protokol ayrıca farklı polimer konsantrasyonlarına sahip matrislerin nasıl hazırlanacağını, gözenek boyutunda ve reolojik özelliklerde ortaya çıkan değişikliklerin nasıl karakterize edileceğini ve doğrudan görüntüleme kullanılarak müteakip bakteri hareketliliğinin ve büyümesinin nasıl karakterize edileceğini açıklamaktadır.
1. Ticari bir 3D yazıcının 3D biyoyazıcıya dönüştürülmesi
- Ekstrüderi ve ısıtıcıyı ticari bir 3D yazıcıdan çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Tek kullanımlık bir Luer kilit şırıngasını yerleştirmek için ek bir modifikasyonla şırınga pompası ekstrüderini34 üretmek için önceki protokolleri izleyin. Şırınga pompası ekstrüderini yazıcıya monte edin.
NOT: Plastik şırıngalar için şırınga pompası ekstrüderini değiştirmek için gereken CAD dosyaları Ek Dosyalar 1-3'te verilmiştir. - 3D yazıcı yazılımını (Malzeme Tablosuna bakın) bir bilgisayara kurun ve açın. 3D yazıcıyı bilgisayara bağlayın.
- Mekanizmanın üst ve alt yarılarını hizalayarak 3D baskılı kelepçelere uygun boyutta bir iğne ile 1 mL tek kullanımlık bir şırınga yükleyin (Şekil 1). cl'yi sabitleyinampüç M8 soket cıvatası ve ince çelik altıgen somun kullanarak şırınganın etrafındaki sırıngalar (Malzeme Tablosuna bakın). Şırınga pistonu, şırınga pompası ekstrüderindeki kılavuz vidaya bağlanır. Şırıngada 0.5 mL'lik bir hava boşluğu oluşturmak için kılavuz vidayı döndürerek pistonu manuel olarak kaldırın.
- Kontaminasyon deney için bir endişe kaynağıysa, şırınga-kelepçe kompleksini bir biyodavlumbaza taşıyın ve aşağıdaki adımları tamamlamadan önce girişte %70 etanol spreyi ile sterilize edin.
2. Bakteriyel süspansiyonun hazırlanması
- V. cholerae ve E. coli için, 37 ° C'de% 2 Lennox LB (Luria Et Suyu, Malzeme Tablosuna bakınız) agar plakasında gece boyunca büyütün.
- V. cholerae için, hücreleri on steril cam boncuk ile 3 mL sıvı LB'ye aşılayın. Hücreleri, orta üstel faza kadar 37 ° C'de 5-6 saat boyunca çalkalanan bir inkübatörde ~ 0.9 optik yoğunluk (OD) 600'e kadar büyütün.
- E. coli için, hücreleri 3 mL sıvı LB'ye aşılayın. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de çalkalanan bir inkübatörde büyütün. OD 0.6'ya ulaşana kadar 3 saat boyunca taze LB'de gece kültürünün 200 μL'sini aşılayın.
- Kültürü 10 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir pelet oluşturmak için kültürü oda sıcaklığında 5.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. mL başına ~9 x 10 10 hücrelik bir hücre yoğunluğu elde etmek için ~10 μL sıvı LB ile yeniden süspanse edin.
3. Bakteriyel süspansiyonun şırıngaya yüklenmesi
NOT: Bakterileri şırıngaya yüklemek için iki yöntem sağlanmıştır (adım 3.1 ve adım 3.2). Adım 3.1, <200 μL'lik küçük hacimli bakteriyel süspansiyonların yüklenmesi için çalışır ve adım 3.2, >200 μL'lik daha büyük hacimlerde bakteriyel süspansiyonların yüklenmesi için çalışır. Burada gösterilen temsili sonuçlar için Adım 3.1 kullanılmıştır.
- Boş bir 1 mL plastik Luer kilit şırıngasını 3D biyoyazıcıya yükleyin. Şırınga pistonunu kılavuz vidayla bağlayın. Her deney grubu için ~20-50 μL'lik küçük bir hücre hacmi kullanıldığından, pistonun şırınga içinde hareket etmesi için alan sağlamak üzere 0,2 mL hava boşluğu eklemek için şırıngayı manuel olarak geri çekin.
- Şırınga ucuna, gerekli baskı özelliklerinin boyutu için gerekli iğne boyutuna sahip kör bir iğne takın. Burada 2 inç 20 G'lik bir iğne kullanılır.
- İğnenin altına bakteri aşısı bulunan 10 mL'lik bir santrifüj tüpü yerleştirerek bakteriyel süspansiyonu şırıngaya yükleyin. Şırınga pistonunu geri çekmek için vidayı manuel olarak döndürün ve hücreleri şırıngaya yükleyin. Bakteri hücre hacimleri o kadar küçüktür ki, çoğu zaman hücreler sadece iğneye yüklenir.
- Pistonu şırınga kelepçesi kompleksinden çıkarın ve hava kabarcıklarını yakalamamaya dikkat ederek şırınga kelepçesi kompleksini istenen bakteri süspansiyonlarıyla dikkatlice yüklemek için başka bir şırınga ve iğne kullanın. Şırınga-kelepçe kompleksi, istenen bakteri süspansiyonu ile ağzın biraz üzerine doldurulmalı ve daha sonra biyoyazıcıya aktarılmalıdır.
- Şırınga kelepçesi kompleksini piston olmadan biyo-yazıcı ekstrüderinin ana çekirdeğindeki ilgili sokete dikkatlice yerleştirin.
- Yazıcı taşıyıcısının kılavuz vidanın yaklaşık yarısına kadar olduğundan ve yüklü şırınganın altında bir toplama kabı bulunduğundan emin olun. Ardından, pistonu taşıyıcıya takılana kadar hem taşıyıcıdan hem de şırınga kelepçesi kompleksinden dikkatlice geçirin. Şırıngada hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için pistonu yavaşça bakteriyel süspansiyona bastırın.
- Adaptörü kaydırınamp hem ekstrüzyon hem de geri çekme manevraları için yerine sabitlemek için pistonun arkasındaki taşıyıcıya yerleştirin.
4. Ekstrüder adımının biriken hacme kalibrasyonu
- Ekstrüder adımını (E-adımı) biriken hacme kalibre etmek için, önce biyo-yazıcıyı deneyde kullanılacak tam şırınga, şırınga iğnesi ve biriken bakteri süspansiyonu ile kurun. Burada 1 mL'lik Luer kilitli şırınga kullanılır.
- İsteğe bağlı bir E-adım numarası (~200) ekstrüde ederek kalibre edilecek tahmini bir E-adım aralığı belirleyin ve şırınga hacim işaretleyicileri ile piston hacmi değişikliğini not edin.
- Kalibrasyon taramasını gerçekleştirmek için E-adım ayarlarını belirlemek için bu kaba E-adım/hacim oranını kullanın. Örneğin, 200'lük bir E-adımı görsel inceleme ile yaklaşık 20 μL ekstrüde ediyorsa ve biri 10-200 μL biriktirmek istiyorsa, E-adımlarını 100-2000 arasında test edin.
- Doğrusal kalibrasyon taramasını gerçekleştirmek için önce yirmi adet 1,5 mL'lik numune alma tüpünün kuru kütlesini 0,1 mg hassasiyetle analitik terazide etiketleyin ve ölçün.
- Bakteriyel süspansiyonu önceden ölçülmüş 1.5 mL'lik tüplere ekstrüde edin. Her E-adım için en az 2 çoğaltma gerçekleştirin. Doğrusal aralıktaki tüm E-adımları için tekrarlayın ve gerektiğinde bakteriyel süspansiyonu değiştirin. Kontaminasyon deney için bir endişe kaynağıysa, her numuneden sonra şırınga iğnesinin dışını %70 etanol ile doyurulmuş, tüy bırakmayan bir mendille silin.
- Tüm 1,5 mL'lik tüplerin kütlesini aynı analitik terazi ile ölçün. Biriken net bir bakteri süspansiyonu kütlesi elde etmek için birinci kütle değerini ikinciden çıkarın.
- Bakteriyel süspansiyon kütlesini malzeme yoğunluğu ile bir hacme dönüştürün. Esas olarak sudan oluşan birçok bakteri süspansiyonu için 1 g/mL uygun bir yoğunluk yaklaşımıdır.
- Kalibrasyon işlemini tamamlamak için E-adımı ile ekstrüde edilmiş hacim arasında doğrusal bir uyum gerçekleştirin.
5. Granül hidrojel matrisinin hazırlanması
- Bir biyogüvenlik kabininde, matrisi steril tutmak için 400 mL %2 Lennox Luria-Bertani'ye (LB) çapraz bağlı akrilik asit/alkil akrilat kopolimerlerinin kuru granüllerini ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin; Bununla birlikte, hidrojel matrisini şişirmek için diğer sıvı hücre kültürü ortamları da kullanılabilir.
NOT: LB'ye eklenen granüllerin ağırlık yüzdesi, kişinin hedeflediği gözenek boyutuna bağlıdır. Bu çalışmada, %0.9'luk bir granüler hidrojel matrisi için LB'ye 3.6 g kuru granül ve %1.2'lik bir granüler hidrojel matrisi için LB'ye 4.8 g kuru granül eklenmiştir. Hidrojel granüller stand mikserde 2 dk karıştırılarak homojen bir şekilde dağılır. - Karıştırıldıktan sonra, hücre canlılığını sağlamak için 20 ila 500 μL'lik artışlarla 10 M sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek pH'ı 7,4'e ayarlayın. Her NaOH ilavesinden sonra, karışıma bir pipet ucu batırarak ve ardından hidrojel matrisini bir pH test kağıdına silerek pH'ı ölçün.
NOT: NaOH eklendikçe, hidrojel granülleri şişmeye başladığından karışımın viskozitesi artacaktır. Şişmiş hidrojel granüllerinin çapı ~5 μm ila 10 μm'dir ve bir hidrojel matrisinde birbirine sıkışır. Granüllerin iç ağ boyutu, daha önce32 olduğu gibi ~ 40 nm ila 100 nm'dir. Ağ boyutu, küçük moleküllerin (örneğin, oksijen ve besinler) serbestçe yayılması için yeterince büyük, ancak bakterilerin interstisyel gözenekler arasında hapsedilmesi için yeterince küçüktür. - Ardından, granül hidrojel matrisini 50 mL'lik steril plastik bir şırınga kullanarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Karıştırma işlemi sırasında oluşan kabarcıkları gidermek için hidrojel matrisini oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 161 x g'de santrifüjleyin.
- Herhangi bir kontaminasyon oluşmadığından emin olmak için hidrojel matrisinin oda sıcaklığında en az 2 gün bekletin. Kontaminasyon, hidrojel matrisinde asılı duran mikro koloniler olarak görünür. İki gün sonra, oluşan ek kabarcıkları gidermek için hidrojel matrisini 161 x g'de 1 dakika santrifüjleyin.
NOT: Hidrojel matrisi oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklayarak protokol burada duraklatılabilir. - Biyogüvenlik kabininde, 30 mL'lik steril plastik bir şırınga kullanarak, istenen miktarda hidrojel matrisini baskının yapılacağı kaba aktarın (burada 20 mL'lik bir doku kültürü şişesi için ~20 mL veya 1 mL'lik plastik mikro küvetler için 1 mL kullanılmıştır).
6. Granül hidrojel matrisinin reolojik özelliklerinin karakterizasyonu
- Reolojik özellikleri ölçmek için pürüzlü 3 mm çapında paralel plakalar arasında 1 mm boşluk bulunan bir kesme reometresine ~50 mL hidrojel matrisi yükleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
- 10-4 s-1 ila 102 s-1 arasındaki logaritmik kayma hızının bir fonksiyonu olarak kesme gerilimini ölçerek, kesme reometresinde tek yönlü kesme ölçümlerini kullanarak akma davranışını ölçün (örneğin, Şekil 2A).
NOT: Düşük kesme hızlarında, hidrojel matrisi, kesme hızından bağımsız olarak sabit bir kesme gerilimine (akma gerilimi) sahip olacaktır. Yüksek kesme hızlarında, kesme gerilimi, hidrojel matrisinin akışkanlaştığını gösteren, kesme hızına bir güç yasası bağımlılığı ile artacaktır. Bu akma-stres davranışı, bakterilerin granüler hidrojel matrisi29 içinde 3D olarak basılmasına izin verir. - Depolama ve kayıp modüllerini, G' ve G''yi, sırasıyla, %1'lik bir gerinim genliğine sahip küçük genlikli salınımlı reoloji ve 0.1 ila 1 Hz arasındaki frekansları kullanarak frekansın bir fonksiyonu olarak ölçün (örneğin, Şekil 2B).
NOT: 3D baskı için ideal granül hidrojel matrisi, ortamın sıkışmış elastik bir katı29 gibi davrandığını gösteren kayıp modülünden daha büyük bir depolama modülüne sahip olmalıdır.
7. Granül hidrojel matris interstisyel gözenek boyutunun karakterizasyonu
- Sonicate 100 nm karboksilatlı floresan polistiren nanopartikülleri (~ 3.6 x 1013 partikül / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ambalajlarında 15 dakika boyunca herhangi bir parçacık kümesini / kümesini parçalamak için yeniden süspanse edin. 50 μL nanopartikülleri 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Pelet oluşana ve süpernatan berraklaşana kadar oda sıcaklığında 9.500 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti, granül hidrojel matrisini hazırlamak için kullanılan sıvı büyüme ortamının (burada LB) 1 mL'sinde yeniden süspanse edin.
NOT: Protokol, yeniden süspanse edilmiş nanopartikülleri 4 °C'de 3 aya kadar saklayarak burada duraklatılabilir.
- Pelet oluşana ve süpernatan berraklaşana kadar oda sıcaklığında 9.500 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti, granül hidrojel matrisini hazırlamak için kullanılan sıvı büyüme ortamının (burada LB) 1 mL'sinde yeniden süspanse edin.
- Yeniden askıya alınmış nanopartikülleri 30 dakika boyunca sonikleştirin. 1 mL granül hidrojel matrisini 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Granül hidrojel matrisine 1 μL yeniden süspanse edilmiş nanopartikül ekleyin ve bunları bir pipet ucuyla karıştırın. Karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığında 161 x g'da 30 saniye santrifüjleyin.
- Hidrojel matrisini ve nanopartikül karışımını 0,1 mm kalınlığında cam tabanlı 35 mm çapında bir Petri kabına aktarın. Kuyu 20 mm çapında ve 1 mm derinliğindedir. Üstüne bir cam lamel yerleştirin ve görüntüleme sırasında akışı ve buharlaşmayı devre dışı bırakmak için aşağı doğru bastırın. Cam lamele bir alternatif, üstüne 1 mL parafin yağı eklemektir.
- Nanopartikülleri, görüntüleme yazılımında 8x ek yakınlaştırma ile 40x yağ objektifli bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin (bkz.
NOT: Yazılımda ek dijital yakınlaştırma kullanmak yerine daha yüksek bir büyütme hedefi kullanılabilir.- Görüş alanı içinde en az dört nanoparçacık ile 2 dakika boyunca tek bir z düzleminde gecikmesiz (ideal olarak ~ 19 kare / sn) bir zaman döngüsü görüntüleyin. İstatistikler için yeterli veri toplamak için farklı yerlerde 15 ila 20 kez tekrarlayın (100 ila 200 nanoparçacık).
- Parçacıkların yer değiştirmesini analiz etmek için bir parçacık izleme yazılımı kullanın. Burada, nanoparçacık35'in kütle merkezini izlemek için klasik Crocker-Grier algoritmasına dayalı özel olarak yazılmış bir komut dosyası kullanılır (bkz. Ek Dosya 7).
- Parçacık izlemeden, ortalama kare yer değiştirmeyi (MSD) hesaplayın. MSD, kısa uzunluklarda ve zaman ölçeklerinde gözenek boşluğunda serbest difüzyon sergileyecek ve hapsetme nedeniyle büyük uzunluklarda ve zaman ölçeklerinde alt difüzyon ölçeğine geçiş sergileyecektir35.
- Yerel gözenek boyutunu tahmin etmek için alt difüzif ölçeğe geçişin gerçekleştiği uzunluk ölçeğini tanımlayın. Bu uzunluk ölçeğini nanopartikül çapına ekleyerek gözenek boyutunu hesaplayın. Ölçülen her nanopartikül için gözenek boyutu analizini tekrarlayın. Bu, ortalama bir gözenek boyutunun hesaplanabileceği bir gözenek boyutu dağılımı verecektir (örneğin, Şekil 3).
8. 3D baskı işlemi
- Numune kapları için özel yapım 3D baskı tutucular (CAD dosyaları için Ek Dosyalar 4-6'ya bakın). Burada doku kültürü şişeleri ve mikro küvetler için tutucular kullanılır. Tutucular, yazıcının tek bir baskı oturumunda birden fazla örnek yazdıracak şekilde programlanmasına izin verir. Hidrojel ortamlı numune kaplarını yapı platformundaki tutuculara yerleştirin.
- 3D baskı yazılımını açın. Yazılıma önceden programlanmış bir g kodu yükleyin. Temsili sonuçlar için, bakteriyel süspansiyonu 3D yazıcıya yüklemek için adım 3.1 kullanılır.
NOT: Doğrusal dikey geometrileri yazdırmak için bir g kodu örneği Tablo 1'de verilmiştir. - 3D baskı yazılımı aracılığıyla, x-y-z düzlemlerini, baskı kafasını x-y düzleminde ilk kap olacak şekilde ortalamak ve ardından z eksenini barındırmak için hareket ettirin. Hedef arama z ekseni yazıcı kafasını kaldıracaktır. İğnenin ucunda az miktarda bakteri süspansiyonu görülene kadar şırınga pistonuna bastırmak için vidayı manuel olarak yavaşça döndürün.
- Fazla bakteri süspansiyonunu steril tek kullanımlık bir mendille hafifçe silin. Numune tutucunun, iğnenin ve şırınganın yüksekliğine bağlı olarak, 3D baskı yazılımını kullanarak, baskı kafasını tercih edilen numune kabındaki hidrojel ortama sabit bir mesafe indirin. Yazdır'a tıklayarak yazdırma işlemini başlatın.
- Yazdırma işlemi tamamlandıktan sonra numune kaplarını kapatın. Yazıcıyı %70 etanol ile silin. Şırıngayı ve iğneyi uygun şekilde atın.
9. V. cholerae'nin yetiştirilmesi ve görüntülenmesi
- Geniş görüş alanlı görüntüleme için, bir ışık kutusuyla hücre büyümesini görüntülemek için yakınlaştırma lensi eklentisi olan bir kamera kullanın. Numuneleri oda sıcaklığında yazdırdıktan hemen sonra görüntüleyin ve ardından bir inkübatöre aktarın. Deney sırasında görüntüleme seansları arasında numuneleri sabit bir inkübatörde 37 °C'de tutun.
- Granüler hidrojel matrisinde uzun periyotlarda büyüme davranışını gözlemlemek için istenen süre boyunca görüntüler yakalayın.
Representative Results
Granül hidrojel matrisli bir 3D biyoyazıcı kullanmak, biyoyazıcıların bakteri kolonilerini, bunun yerine düz bir alt tabakaya basıldığında, bakteri süspansiyonunun düşük viskozitesi nedeniyle çökecek şekillere basma yeteneklerini genişletir. Burada sunulan yaklaşımın çözünürlüğü, ekstrüzyon hızına, iğnenin boyutuna, baskı kafasının hızına, iğnedeki havaya ve bakteriyel süspansiyonun viskozitesine bağlıdır. Düşük hacimli bakteriyel süspansiyon nedeniyle, bakteriyel süspansiyonun şırınga ve iğneye yüklenmesi sırasında yanlışlıkla hava kabarcıkları ortaya çıkabilir. Bu, son basılı yapıda bir hava kabarcığının birikmesine neden olabilir (Şekil 4). Hava kabarcıklarının baskıya girmesinin bir başka yolu da, baskıdan önce iğnenin ucunda küçük bir damla bakteri süspansiyonu oluşturmak için pistona basılmaması ve iğnenin ucunda bir hava boşluğu bulunmasıdır. Yazdırmadan önce şırınga pistonuna bastırmamak, aynı partide farklı hacimlerde hücrelerin basılmasına da neden olabilir. Bununla birlikte, zaman ilerledikçe, hava kabarcığı, Şekil 4'te gösterildiği gibi çevredeki ortama çözülür.
Ekstrüzyon adımını kalibre etmek için, biriken hacim, baskı kafasının doğrusal aktüatörünün şırınga pistonunu nasıl çevirdiğine bağlıdır, şırınganın iç çapı hacmi doğrudan etkileyecektir. Ayrıca, bakteriyel süspansiyonun reolojik özellikleri, düzgün bir şekilde baskı yapmak için iğne kasılmasını ne kadar kolay kestiklerini etkileyecektir. Bu nedenle, bu kalibrasyon prosedürü her şırınga/iğne/bakteri süspansiyon kurulumu için yeniden yapılmalıdır. Prensip olarak, şırınga kalibrasyonu otomatikleştirilebilir. Bununla birlikte, pratikte, birçok kullanım durumu için geniş çapta geçerli olan böyle bir kod yazmak zor olacaktır. Örneğin, 1 mL'lik bir şırıngadan yaklaşık 300 μL'lik ekstrüzyonu kalibre etmeyi hedefleyen bir kullanıcının, şırıngayı 30 μL'lik bir hedef hacim civarında kalibre eden bir kullanıcıdan çok daha sık yeniden yüklemesi gerekir. Kalibrasyon işlemi başladığında hacim kalibrasyon sabitine E-adımı bilinmediğinden, kullanıcı gerçekte ne sıklıkta yeniden yükleme gerektiğini tam olarak tahmin edemeyebilir. Ayrıca, kalibrasyon işlemini otomatikleştirmek için, önceden tartılmış her bir 1,5 mL tüpün tam konumlarının belirtilmesi gerekir. Doğru kalibrasyon için tüm biyomürekkebin iğneden tüpe bırakıldığından emin olmak için, iğne ile tüp tabanı/duvarı arasında hassas temas yapılmalıdır. İyi temas olmadan, küçük damlacıklar ıslanabilir ve iğneye yapışabilir. Bu nedenle, tüpler arasındaki herhangi bir konumsal değişiklik, kalibrasyon sürecindeki hatalara büyük ölçüde katkıda bulunabilir. Bu nedenlerden dolayı, yazarlar her kullanıcının kendi benzersiz ihtiyaçlarına uygun bir kalibrasyon programı oluşturmasını önermektedir.
Burada sunulan yaklaşımın önemli bir özelliği, görüntüleme kullanarak doğrudan hareketlilik ve büyüme yoluyla çevrelerine yayılan bakterileri görselleştirme yeteneğidir. Görüntüleme protokolünün daha önceki bir versiyonunda, 6 oyuklu plakalar 19 mL granül hidrojel matrisi ile doldurulmuştur. Bununla birlikte, ters çevrilmiş bir mikroskopta gözlemlenebilen yatay bir hücre çizgisinin başarılı bir 3D baskısı ile bile, ortamın üst yüzeyinde yoğun bir koloni de büyüyecek ve parlak alan mikroskobu ile görselleştirmeyi sınırlayacaktır (Şekil 5). Üst yüzeydeki koloni muhtemelen baskı sırasında şırınga iğnesi ortama yerleştirilirken veya ortamdan çıkarılırken kontaminasyondan kaynaklanmıştır. Bu sorunu aşmak için, dikey hücre çizgileri parıldama şişelerine basılmıştır (Şekil 6A). Bununla birlikte, silindirik şişelerin eğriliği, görüntüleme sırasında bozulmaya neden oldu. Bu, baskı için numune kapları olarak düz duvarlı küvetlerin ve doku kültürü şişelerinin seçilmesine yol açtı ve bozulmamış görüntülemeye izin verdi (Şekil 6B-D). Doku kültürü şişelerinin bir sınırlaması, basılabilecek geometrileri sınırlayan küçük eğik boyundur.
Birlikte ele alındığında, bu protokol, uzun zaman ölçeklerinde karmaşık gözenekli ortamlarda bakteri hareketliliğinin ve büyümesinin gözlemlenmesine izin verir. Parlak alan mikroskobu kullanılarak biyofilm oluşturan V. cholerae ve lazer taramalı floresan konfokal mikroskopi kullanılarak E. coli'nin planktonik hücreleri için Şekil 6B-G'de bazı örnekler gösterilmiştir ve bu yaklaşımın çok yönlülüğünü göstermektedir. Gerçekten de, hidrojel matrislerinin potansiyel bir sorunu, floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendiğinde olası otofloresansıdır; bununla birlikte, Şekil 6F,G'de gösterilen görüntüler, burada sunulan deneysel platformda bu tür otofloresansın minimum düzeyde olduğunu göstermektedir. Bu tür optik mikroskopi yaklaşımlarının bir başka sınırlaması, ~ 100 s nanometrede kırınım sınırı tarafından ayarlanan uzamsal çözünürlükleridir; bununla birlikte, bu uzunluk ölçeği, tek bir bakteri hücresinin boyutundan çok daha küçüktür ve bu nedenle, optik teknikler, bakteri hücrelerini tek tek hücreler ölçeğinden (Şekil 6G) daha büyük, çok hücreli kolonilerölçeğine 30,31,32,33 görüntüleme yeteneği sağlar. Ek örnekler aşağıda açıklanmıştır.
Yukarıda belirtildiği gibi, burada sunulan yaklaşım, küçük (1 mL) ve büyük (20 mL) matris hacimlerinde bakteri kolonilerini 3D yazdırmak ve görüntülemek için kullanılabilir. Bu nedenle, farklı hacimler kullanılarak elde edilen sonuçlardaki farklılıklar, temsili örnekler olarak hareketli ve hareketsiz V. cholerae'nin 3D baskılı kolonileri kullanılarak aşağıda açıklanmıştır. Baskının uzamsal çözünürlüğü (çizginin genişliği), nozülün iç çapı tarafından ayarlanır. Aşağıda açıklanan örneklerde, iç çapı 0,6 mm olan bir iğne, 0,6 mm'lik bir ilk silindirik koloni ile sonuçlanır. Önceki çalışmalar, iç çapı ~100-200 μm33 olan çekilmiş bir cam kılcal kullanılarak baskı çözünürlüğünün daha da azaltılabileceğini göstermiştir.
Küçük hacimler için, iki farklı gözenek boyutu dağılımına sahip iki farklı granüler hidrojel matrisi kullanılır: biri bir V. cholerae hücresinin ortalama çapından daha büyük bir ortalama gözenek boyutuna, 0.2-0.4 μm36 ve diğeri bu çaptan daha küçük bir ortalama gözenek boyutuna sahiptir. On iki gün boyunca numuneler, kolonilerin zaman içindeki alansal genişlemesinin görüntü analizi yoluyla görüntülenir ve ölçülür (Şekil 7 ve Şekil 8). Sadece hücresel büyüme yoluyla çevrelerine yayılabilen hareketsiz hücreler için, alansal genişleme oranı, araştırılan farklı matrisler arasında benzerdi (Şekil 7), bu da matris gözenek boyutundaki farklılıkların beklendiği gibi büyüme yoluyla hücresel yayılmayı etkilemediğini gösteriyor. Buna karşılık, aktif hareketlilik yoluyla çevrelerine yayılan hareketli hücreler için, V. cholerae'nin alansal genişleme oranı, daha büyük gözeneklere sahip hidrojel matrisi için daha yüksekti - bunun için hidrojel taneleri tarafından hapsedilme hücresel hareketliliği daha az engelliyor. Bakteri yayılımındaki bu farklılıklar koloni morfolojilerinde de belirgindi(Şekil 8). Daha büyük gözeneklere sahip hidrojel matrislerindeki V. cholerae kolonisi, daha önce gözlemlendiği gibi aktif motilite yoluyla yayılmayı yansıtan pürüzsüz, dağınık tüyler boyunca yayılır (Şekil 8A)32. Gerçekten de, bu yorumla tutarlı olarak, bu dağınık tüyler, hareketsiz hücreler durumunda gözlenmez (Şekil 8C). Ek olarak, gözenekler, hücrelerin gözeneklerden geçerken boncukları itmemesi için yeterince büyüktür. Ayrıca, yüzme ile uygulanan viskoz stres 1 Pa'dan azdır, bu da çevredeki hidrojel matrisini önemli ölçüde deforme etmek için yetersizdir. Buna karşılık, daha küçük gözeneklere sahip hidrojel matrislerindeki koloni, hem hareketli hem de hareketsiz hücreler için yalnızca pürüzlü, fraktal benzeri tüyler yoluyla yayılır (Şekil 8B, D), yalnızca hücresel büyüme yoluyla yayılmayı yansıtırken, hücreler büyürken, geçici olarak deforme olurlar ve çevreleyen matrisi verirler. Aslında, hidrojel matrislerinin akma geriliminin hücrelerin turgor basıncından çok daha küçük olduğu göz önüne alındığında, bu küçük gözenek boyutu sınırında, matris yalnızca hücresel büyümeye karşı zayıf direnç sağlar ve 3D baskılı yapıyı güçlü bir şekilde etkilemiyor gibi görünmektedir.
Büyük hacimli numunelerde yapılan deneyler için de benzer sonuçlar gözlenir; Bununla birlikte, bu örneklerdeki daha fazla besin bolluğu göz önüne alındığında, deneyler daha uzun zaman ölçeklerinde hücresel büyümeyi sürdürebilir. Örnek olarak, ortalama gözenek boyutunun hücre boyutundan daha küçük olduğu granüler hidrojel matrislerini kullanan sonuçlar gösterilmiştir - ve bu nedenle, hücresel yayılma öncelikle büyümeden kaynaklanmıştır. Numuneler, granüler hidrojel matrislerinde ~ 30 gün boyunca görüntülendi ve ilk 150 saat boyunca hem hareketsiz hem de hareketli hücreler için benzer alansal genişleme gözlendi; bununla birlikte, daha da uzun zamanlarda, numuneler arasında güçlü değişkenlik gözlenir ve bazı numuneler daha hızlı yayılma oranları sergiler (Şekil 9 ve Şekil 10). İlginç bir şekilde, deneyden sonra hidrojel matrisinin yeniden örneklenmesi üzerine - hidrojel matrisinin büyük hacminin bir faydası - akma gerilimi, depolama modülü ve kayıp modülünde bir azalma ölçülür (Şekil 11), bu da matrislerin daha yumuşak hale geldiğini gösterir. Bu değişiklik, V. cholerae'nin hidrojel matris özelliklerini değiştiren ve uzun zamanlarda hücresel yayılmayı teşvik eden bir molekül üretmesinden kaynaklanıyor olabilir, bu da gelecekteki araştırmalarda test edilmesi ilginç olacaktır. Bu deneylerle sonuçlanan kaba, fraktal benzeri koloni morfolojilerinin örnekleri Şekil 10'da gösterilmektedir.
Şekil 1: Özel yapım 3D biyoyazıcının görüntüleri. (A) Tek kullanımlık Luer kilit şırıngası ve iğnesi ile modifiye edilmiş bir şırınga pompası ekstruder kafasına sahip biyoyazıcı. Biyoyazıcı ~46 cm genişliğindedir. (B) Sıkışmış hidrojel matrisi ile doldurulmuş şişelerdeki hücrelerin 3D baskısının görüntüsü. Resmin genişliği 87 mm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Granüler hidrojel matrislerinin reolojik özelliklerinin karakterizasyonu. (A) Uygulanan kayma hızının bir fonksiyonu olarak kayma gerilmesi. (B) Salınım frekansının bir fonksiyonu olarak sırasıyla depolama ve kayıp modülleri, G' ve G''. Gösterge, her bir hidrojel matrisini hazırlamak için kullanılan hidrojel kütle fraksiyonunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İki temsili granüler hidrojel matrisinin gözenek boyutu ölçümleri. İzleyiciler izlenerek, her bir hidrojel matrisi için karakteristik gözenek boyutlarının dağılımı belirlenir. Veriler 1-CDF ile temsil edilir, burada CDF kümülatif dağılım fonksiyonudur. Gösterge, her bir matrisi hazırlamak için kullanılan hidrojel kütle fraksiyonunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bakterilerin 3D baskısı sırasında oluşan kabarcık örnekleri. (A) Görüntüleme kurulumunun şeması. (B) LB'de şişmiş% 1.2 hidrojel matrisinde baskının altında (kırmızı kutu) bir kabarcık ile V. cholerae'nin büyümesinin anlık görüntüleri. 37 ° C'de 59 saat büyüdükten sonra, hava kabarcığı tamamen çözülür ve hidrojel matrisinin esnekliği nedeniyle koloni geri çöker. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: LB'de şişmiş %1.2 hidrojel matrisi ve 37 °C'de 48 saatlik inkübasyondan sonra üst yüzeyde oluşan biyofilm ile doldurulmuş altı oyuklu bir plakaya basılmış hareketli V. cholerae'nin yatay çizgisinin görüntüleri. (A) Görüntüleme kurulumunun şeması. (B) 3D baskı sırasında kontaminasyon nedeniyle üst yüzeyde biyofilm oluşumu opaklığı azaltır ve yatay çizginin net bir şekilde görüntülenmesine izin vermez. Üst yüzey, muhtemelen diferansiyel büyüme nedeniyle kırışıklıklar oluşturur. Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bu yöntemde kullanılabilecek farklı numune kaplarına örnekler. (A) V. cholerae, 470 saat sonra% 1.2 granül hidrojel matrisi ile doldurulmuş bir cam şişeye basılmıştır. Şişenin eğriliği, büyümenin görüntülenmesini zorlaştırır. Ölçek çubukları = 5 mm. (B) V. cholerae , %1.2 granül hidrojel matrisi ile doldurulmuş bir mikro küvette basılmıştır. Düz kenarlar net görüntülemeye izin verir, ancak küçük hacimler, hücrelerin büyüme substratları tükenmeden önce deneylerin uzunluğunu sınırlar. (C) %1.2 granüler hidrojel matrisi ile doldurulmuş bir doku kültürü şişesinde basılmış V. cholerae'yi görüntülemek için bir yakınlaştırma lensi ile görüntüleme kurulumu. Mikro küvet kasasına benzer şekilde, düz kenarlar net görüntülemeye izin verir. Doku kültürü şişeleri, daha büyük hacimlerde granüler hidrojel matrisi ile doldurulabilir, bu nedenle deneysel zaman aralığı uzar. (D) 37 °C'de 100 saatlik inkübasyondan sonra %1,2 granül hidrojel matrisi içinde basılmış V. cholerae'nin yakınlaştırma merceğinden alınan görüntü. Ölçek çubuğu = 1 mm. (E) Floresan hücreleri görüntülemek için konfokal mikroskopla görüntüleme kurulumu. (F) 37 ° C'de 10 günlük inkübasyondan sonra% 1.2 granül hidrojel matrisi içinde floresan E. coli'nin konfokal mikrograflarının 3D projeksiyonu. Ölçek çubuğu = 50 μm. (G) Hidrojel matrisi içindeki floresan E. coli'nin tek hücreli çözünürlüklü konfokal mikrografı. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: 1 mL granül hidrojel destek matrislerinde basılmış V. cholerae kolonilerinin zamanının bir fonksiyonu olarak alan genişlemesi. Çizimdeki veriler Şekil 8'in görüntü analizinden alınmıştır. Hareketli hücrelerin (kapalı kırmızı daire ve kare), hareketsiz hücrelere göre daha hızlı yayıldığı, hem büyüme hem de hareketlilik yoluyla yayılmayı yansıttığı gözlendi. Ek olarak, büyük gözenek boyutuna (kırmızı kareler) sahip hidrojel matrisindeki hareketli hücreler, 0.3 μm gözenekli (kırmızı daireler) hidrojel matrisindeki hücrelerden daha hızlı yayılır. Hareketsiz hücreler, sadece büyüdükleri için iki gözenek boyutu arasında alansal genişleme oranında bir fark göstermez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: 1 mL granül hidrojel destek matrislerinde basılmış V. cholerae kolonileri. (A) Gözenek boyutunun ortalama hücre çapından daha büyük olduğu %0.9 granüler hidrojel matrisinde hareketli V. cholerae'nin büyümesinin ve hareketliliğinin anlık görüntüleri. Oklar, hidrojel matrisi boyunca hareket eden hücreler nedeniyle oluşan dağınık bir tüyü gösterir. (B) Gözenek boyutunun ortalama hücre çapından daha küçük olduğu %1.2 granüler hidrojel matrisinde hareketli V. cholerae'nin büyümesinin ve hareketliliğinin anlık görüntüleri. Oklar, hücresel büyüme nedeniyle oluşan pürüzlü, fraktal benzeri tüyleri gösterir. (C) Gözenek boyutunun ortalama hücre çapından daha büyük olduğu %0.9 granüler hidrojel matrisinde hareketsiz V. cholerae'nin zaman evriminin anlık görüntüleri. Bu durumda, hareketliliği yansıtan dağınık tüyler gözlenemez. (D) Gözenek boyutunun ortalama hücre çapından daha küçük olduğu% 1.2 granüler hidrojel destek matrisinde hareketsiz V. cholerae büyümesinin anlık görüntüleri. Bu durumda, büyümeyi yansıtan pürüzlü, fraktal benzeri tüyler tekrar gözlemlenebilir. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: 20 mL'lik %1.2 granül hidrojel destek matrislerinde basılmış V. cholerae kolonilerinin zamanının bir fonksiyonu olarak alan genişlemesi. Hareketsiz (açık daireler) ve hareketli hücrelerin (kapalı daireler) ilk 100 saat boyunca benzer oranlarda yayıldığı gözlenmiştir. 100 saat sonra, potansiyel olarak uzun sürelerde değişkenliğin evrimi nedeniyle alansal genişleme oranlarında farklılıklar gözlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: 37 °C'de yetiştirilen 22 mL %1.2 granül hidrojel matrislerinde basılmış V. cholerae kolonileri. (Üstte) Hareketli V. cholerae'nin büyümesinin anlık görüntüleri. (Altta) Hareketsiz V. cholerae'nin büyümesinin anlık görüntüleri. Her iki durumda da, büyümeyi yansıtan pürüzlü, fraktal benzeri tüyler gözlemlenebilir. Ölçek çubukları = 2 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Deneyden önce (0 saat) ve deneyden sonra (397 saat) %1,2 granül hidrojel matrisinin reolojik özelliklerinin karakterizasyonu. (A) Uygulanan kayma hızının bir fonksiyonu olarak kayma gerilmesi. (B) Uygulanan salınım frekansının bir fonksiyonu olarak sırasıyla depolama ve kayıp modülleri, G' ve G''. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gcode Komutları | Görev | |||
| M82 Serisi | Mutlak ekstrüzyon modu | |||
| M302 S0 | Soğuk ekstrüzyonu etkinleştirin | |||
| M92 E14575 | Ekstrüzyon adımlarını mm başına ayarlayın | |||
| G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 | Z ekseni ve ekstrüzyon konumunu sıfıra ve x, y konumunu 35,71 mm ve y 88 mm olarak ayarlayın, burada g kodu başladığında yazıcı kafası | |||
| M221 S100 T0 | akış hızını %100 olarak ayarlar | |||
| M107 Serisi | Fanı kapatın | |||
| G1 F1 X35.61 Y81 E0.1 | 20 μL biyomürekkebi, mevcut konumun ayarlandığı 50 μL/dak besleme hızında matrise ekstrüde edin | |||
| G0 F200 Z60 | İğneyi matristen dışarı çekin ve 200 mm/dak hızla numune alıcısını | |||
| G0 F500 X65.81 Y81.0 | İğneyi 500 mm/dak hızla bir sonraki numune kabına taşıyın | |||
| G0 F100 Z0 | İğneyi, baskının 100 mm/dak hızla başladığı aynı z konumuna devam eden bir sonraki numuneye indirin | |||
| G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 | 20 μL biyomürekkebi, mevcut konumun ayarlandığı 50 μL/dak besleme hızında matrise ekstrüde edin | |||
| G0 F200 Z60 | İğneyi matristen dışarı çekin ve 200 mm/dak hızla numune alıcısını | |||
| G0 F500 X96.01 Y81.0 | İğneyi 500 mm/dak hızla bir sonraki numune kabına taşıyın | |||
| G0 F100 Z0 | İğneyi, baskının 100 mm/dak hızla başladığı aynı z konumuna kadar numune devamına indirin | |||
| G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 | 20 μL biyomürekkebi, mevcut konumun ayarlandığı 50 μL/dak besleme hızında matrise ekstrüde edin | |||
| G0 F200 Z60 | İğneyi matristen dışarı çekin ve 200 mm/dak hızla numune alıcısını | |||
| G0 F500 X126.21 Y81.0 | İğneyi 500 mm/dak hızla bir sonraki numune kabına taşıyın | |||
| G0 F100 Z0 | İğneyi, baskının 100 mm/dak hızla başladığı aynı z konumuna devam eden bir sonraki numuneye indirin | |||
| G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 | 20 μL biyomürekkebi, mevcut konumun ayarlandığı 50 μL/dak besleme hızında matrise ekstrüde edin | |||
| G0 F200 Z80 | İğneyi matristen dışarı çekin ve 200 mm/dak hızla numune alıcısını | |||
Tablo 1: Bakteriyel süspansiyonun dikey çizgilerini yazdırmak için G kodu programlama.
Ek Dosya 1: Alt kelepçe için STL dosyası Şırınga ekstrüderi için 1 mL tek kullanımlık Luer kilit şırıngaları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: Şırınga ekstrüderi için 1 mL tek kullanımlık Luer kilit şırıngaları için üst kelepçe için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 3: Şırınga ekstrüderi için 1 mL tek kullanımlık Luer kilit şırıngaları için şırınga adaptörü için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 4: Küvet numune tutucusu için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 5: Doku şişesi numune tutucusu için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 6: 6 oyuklu plaka ve 35 mm Petri kabı baskı yatağı için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 7: Parçacık izleme için özel komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Protokoldeki kritik adımlar
Her bir hidrojel matrisini hazırlarken, matrisin steril bir ortamda yapılmasını sağlamak önemlidir. Aksi takdirde, birkaç gün sonra matriste mikrokoloniler (küçük sferoidler) olarak ortaya çıkan kontaminasyon meydana gelebilir. Karıştırma işlemi sırasında, tüm kuru granül hidrojel parçacıklarının çözülmesi önemlidir. Ek olarak, her bir hidrojel matrisinin pH'ını NaOH ile ayarlarken, granüller şişmeye başlayacak, bu da hidrojel matrisinin viskozitesini artırarak karıştırmanın daha zor olmasına neden olacaktır. Stand karıştırıcının kullanılması, NaOH'nin hidrojel matrisine iyice karışmasını sağlamaya yardımcı olacaktır. Her bir bakteri süspansiyonunun yüklenmesi sırasında, iğnede hava cepleri oluşabilir. Bu sorunu önlemek için, iğne ucunun her zaman santrifüj tüpündeki bakteri süspansiyonunda oturduğundan ve tüpün dibinde veya üst yüzeye yakın olmadığından emin olun. Bu sorunun üstesinden gelmenin bir başka yolu, büyük hacimli hücrelerin büyütülmesi ve böylece baskı için daha büyük hacimlerde bakteri süspansiyonuna sahip olmaktır.
Sınırlama
Şu anda, baskı sırasında, bakteriyel süspansiyonun düşük viskozitesi, basılabilecek geometrileri sınırlar ve genellikle eser hücreler nedeniyle hidrojel matris yüzeyinin üstünde bir biyofilm oluşumuna ve büyümesine yol açar. Bakteriyel süspansiyonun viskozitesini artırmak veya 3D yazıcı ayarlarını daha da optimize etmek de dahil olmak üzere bu sınırlamanın üstesinden gelmek için birkaç potansiyel yöntem vardır. Bakteriyel süspansiyonun viskozitesini arttırmak için, bakteri süspansiyonu başka bir polimerle karıştırılabilir - örneğin, bakterilerin düz yüzeylere 3D baskısı için daha önce kullanılmış olan aljinat38. Yazıcı ayarları, iğnenin granüler hidrojel matrisinden çekilmesi sırasında şırınga pistonunun geri çekilmesini sağlamak için daha da optimize edilebilir, bu da iğnenin hidrojel matrisinden çıkarılması sırasında hücrelerin birikmesini durdurma potansiyeline sahip olacaktır.
Yöntemin mevcut/alternatif yöntemlere göre önemi
Burada açıklanan yöntem, bakteri kolonilerinin granül hidrojel matrislerine yazdırılmasına izin verir. Granül hidrojel matrisleri, dış çevresel faktörlerin (örn. gözenek boyutu, matris deforme olabilirliği) bakterilerin hareketliliği ve büyümesi üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir. Ek olarak, bu çalışmada LB, hidrojel matrisini şişirmek için sıvı büyüme ortamı olarak kullanılırken, hidrojel matrisi, antibiyotikli ortamlar da dahil olmak üzere diğer sıvı büyüme ortamları ile şişirilebilir. Kapalı ortamlarda bakterileri incelemek için önceki yöntemler, deney süresinin uzunluğu, polimer ağ boyutu ve çevreleyen hidrojel matris sertliği37,38 ile sınırlıydı. Farklı polimerlerden granül hidrojel matrisleri yapmak için protokoller zaten mevcuttur, bu nedenle farklı çevresel koşulların bakterilerin hareketliliği ve büyümesi üzerindeki etkilerini inceleme potansiyeli çok büyüktür. Bu yöntem, bakterilerin konakçı mukus veya toprak gibi gerçek dünyada yaşadığı ortamları daha kolay özetleyen kontrol ortamlarında bakterilerin incelenmesine izin verir. Diğer birçok yöntemin bir başka sınırlaması, çevreleyen matrisin opaklığıdır; bununla birlikte, optik olarak saydam malzemeler kullanan bu yaklaşım, örneğin 3 boyutlu olarak bakterilerin optogenetik kontrolünü ve modellenmesini keşfetme yeteneği sağlar.
Hareketlilik ve büyümeyi incelemenin ötesinde, burada açıklanan 3D baskı yöntemi, bir alt tabaka üzerinde bir biyomürekkebin birikmesini gerektiren ve bu nedenle üretebilecekleri tasarlanmış canlı materyalin yüksekliği ile sınırlı olan diğer birçok biyo-baskı yönteminin sınırlamasının üstesinden gelir. Gelecekte, bu biyo-baskı protokolü, polimerleri biyofilm oluşturan hücrelerle karıştırarak biyohibrit malzemeler üretmek için daha da genişletilebilir. Granül hidrojel matrisleri, diğer birçok mevcut bakteri biyo-baskı yönteminden daha kalın, daha büyük ölçekli mühendislik canlı malzemeleri ve daha karmaşık geometriler için 3D baskı desteği sağlar. Bu çalışmada sadece V. cholerae ve E. coli kullanılırken, Pseudomonas aeruginosa gibi diğer türler de başarıyla 3D olarak basılmıştır37. Baskının ötesinde, yazıcı, örneğin herhangi bir genetik değişiklik olup olmadığını görmek için büyümeden sonra kontrollü bir bakteri örneklemesi yapacak şekilde uyarlanabilir.
Disclosures
Bu yayında bakteri topluluklarını 3D yazdırmak ve görüntülemek için kullanılan deneysel platform, Princeton Üniversitesi tarafından Tapomoy Bhattacharjee ve S.S.D. (PCT Başvuru numarası PCT/US/2020/030213) adına yapılan bir patent başvurusunun konusudur.
Acknowledgments
R.K.B., Başkanlık Doktora Sonrası Araştırma Görevlileri Programı'ndan destek aldığını kabul eder. Bu materyal aynı zamanda NSF Lisansüstü Araştırma Burs Programı Hibesi DGE-2039656 (AMH'ye) tarafından desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. A.S.D.-M. ve H.N.L. Princeton Üniversitesi'ndeki Lidow Bağımsız Çalışma/Kıdemli Tez Fonu'ndan destek aldığını kabul eder. Ayrıca Bonnie Bassler'in laboratuvarına V. cholerae suşları sağladığı için teşekkür ederiz. S.S.D., NSF Hibeleri CBET-1941716, DMR-2011750 ve EF-2124863'ün yanı sıra Eric ve Wendy Schmidt Dönüştürücü Teknoloji Fonu, New Jersey Sağlık Vakfı, Pew Biyomedikal Akademisyenler Programı ve Camille Dreyfus Öğretmen-Burs Programı'nın desteğini kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| 1 mL Luer lock syringe | BH Supplies | BH1LL | |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| 100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres) | Invitrogen, (ThermoFischer Scientific) | F8803 |
|
| 15 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-237 | |
| 20 G blunt needle | McMaster Carr | 75165A252 | |
| 25 mL tissue culture flasks | VWR | 10861-566 | |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot Mini 2 | |
| 3D printing software | Cura | Cura-Lulzbot | |
| 50 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-239 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Carbomer Granular Hydrogel Particles | Lubrizol | Carbopol 980NF | dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers |
| Centrifuge (2 mL tube capacity) | VWR | 2405-37 | |
| Centrifuge (50 mL tube capacity) | ThermoFischer Scientific | 75007200 | Sorvall (brand) ST 8 (model) |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R+ inverted laserscanning confocal microscope |
|
| Glass bottom petri dish | Cellvis | D35-10-1-N | |
| Lennox LB (Lubria Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap | McMaster Carr | 91290A478 | |
| M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut | McMaster Carr | 93187A300 | |
| Open-source syringe pump | Custom-made | Replistruder 4 | https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791 |
| Petri dish (60 mm round) | ThermoFischer Scientific | FB0875713A | |
| Shear Rheometer | Anton Paar | MCR 501 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-992 |
References
- Persat, A., et al.
- Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system. Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).
- Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores. Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).
- Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387 (2017).
- Grice, E. A., Segre, J. A.
- Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).
- Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more. Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).
- Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).
- Harman, M. W., et al. The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Siitonen, A., Nurminen, M. Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).
- Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola. Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).
- O’Neil, H. S., Marquis, H. Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion. Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).
- Gill, C. O., Penney, N.
- Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding. Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).
- Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration. Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).
- Toley, B. J., Forbes, N. S. Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue. Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).
- Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).
- de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).
- Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots. FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).
- Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. Rhizosphere biology and crop productivity—a review. Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).
- Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment. Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).
- Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources. Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).
- Ford, R. M., Harvey, R. W. Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).
- Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies. Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).
- Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Influence of confinement on the spreading of bacterial populations. PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063 (2022).
- Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. A biophysical threshold for biofilm formation. eLife. 11, e76380 (2022).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).
- Bhattacharjee, T., et al. Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming. Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media. Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. Chemotactic migration of bacteria in porous media. Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).
- Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S.
- Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting. HardwareX. 9, e00170 (2021).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 9671 (2017).
- Martínez-Calvo, A., et al. Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119 (2022).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward approach for 3D bacterial printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Zhang, Q., et al. Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118 (2021).
