Summary
פרוטוקול שלב אחר שלב לייצור רשתות זיקה סטרפטאווידין מסופק לשימוש במחקרים מבניים של דגימות מקרומולקולריות מאתגרות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים.
Abstract
רשתות זיקה סטרפטאווידין מספקות אסטרטגיות להתגבר על אתגרי הכנת דגימות קריו-אלקטרונים נפוצים רבים (cryo-EM), כולל דנטורציה של דגימות וכיוונים מועדפים שיכולים להתרחש עקב ממשק אוויר-מים. רשתות זיקה Streptavidin, לעומת זאת, משמשות כיום על ידי מעבדות cryo-EM מעטות מכיוון שהן אינן זמינות מסחרית ודורשות תהליך ייצור זהיר. גבישי סטרפטאבידין דו-ממדיים גדלים על שכבה חד-שכבתית ליפידית ביוטינילית המיושמת ישירות על רשתות קריו-EM סטנדרטיות של פחמן חורי. האינטראקציה בעלת הזיקה הגבוהה בין סטרפטאווידין לביוטין מאפשרת קשירה עוקבת של דגימות ביוטינילציה המוגנות מממשק אוויר-מים במהלך הכנת דגימות קריו-EM. בנוסף, רשתות אלה מספקות אסטרטגיה לריכוז דגימות זמינות בכמויות מוגבלות וטיהור קומפלקסים חלבוניים בעלי עניין ישירות על הרשתות. כאן, פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב מסופק לייצור חזק של רשתות זיקה סטרפטאווידין לשימוש בניסויי cryo-EM וכתמים שליליים. בנוסף, מדריך לפתרון בעיות כלול עבור אתגרים נפוצים כדי להפוך את השימוש ברשתות זיקה סטרפטווידין לנגיש יותר לקהילת cryo-EM הגדולה יותר.
Introduction
מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-מיקרוסקופית (cryo-EM) חוללה מהפכה בתחום הביולוגיה המבנית בכך שאפשרה קביעת מבנה מקרומולקולרי של דגימות גדולות, גמישות והטרוגניות שבעבר לא היו נגישות באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או תהודה מגנטית גרעינית1. שיטה זו פועלת על ידי מקרומולקולות הקפאת הבזק בתמיסה ליצירת שכבה דקה של קרח זגוגי שניתן לאחר מכן לצלם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. בשנים האחרונות, התקדמות משמעותית הן בחומרת המיקרוסקופ והן בתוכנת עיבוד התמונה הרחיבו עוד יותר את סוגי הדגימות המתאימות לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה על ידי cryo-EM.
עם זאת, הכנת דגימות דקות ומזוגגות נותרה אחד השלבים הקריטיים ביותר בקביעת מבנה מקרומולקולרי על ידי cryo-EM. דגימות ביולוגיות הן לעתים קרובות דינמיות, שבירות, נוטות לדנטורציה, ולפעמים זמינות רק בכמויות קטנות למחקרי cryo-EM. במהלך תהליך הניקוי, חלקיקים אלה מתקשרים עם ממשק אוויר-מים הידרופובי, מה שיכול לגרום לאוריינטציות מועדפות על חלקיקים, פירוק קומפלקסים שבירים, דנטורציה חלקית או מלאה של הדגימה, וצבירה 2,3,4. השימוש בדטרגנטים או חומרים פעילי שטח אחרים, הצלבה כימית וספיחת דגימות לתמיכה בשכבות הן אסטרטגיות נפוצות לשימור דגימות ביולוגיות בתהליך ההקפאה. שכבות תמיכה כגון תחמוצת גרפן 5,6,7 או פחמן אמורפי8 פועלות גם לריכוז חלקיקים ברשת על ידי ספיחה כאשר הדגימה זמינה בכמויות מוגבלות. עם זאת, שיטות אלה אינן כלליות או אמינות, ואופטימיזציה של הכנת הרשת יכולה לגזול זמן רב או להיכשל לחלוטין.
רשתות זיקה סטרפטווידין 9,10 פותחו כדי להתגבר על חסרונות אלה ולספק שיטה מתונה וישימה בדרך כלל לתפוס את מכלול האינטרסים ולהגן עליו מפני ממשק אוויר-מים. רשתות אלה משתמשות בסריג גבישי סטרפטאווידין דו-ממדי (דו-ממדי) הגדל על שכבה אחת של שומנים ביוטיניליים על הרשת. לאחר שהדגימות עצמן עוברות ביוטינילציה (לעתים קרובות בדלילות ובאקראי, כלומר ביוטין אחד בממוצע לכל קומפלקס), ניתן ליישם אותן על הרשת המצופה סטרפטווידין. מכיוון שספיחה של דגימות מסתמכת על זיקה גבוהה מאוד בין סטרפטאווידין לביוטין, ניתן להשתמש בריכוזי דגימה נמוכים של עד 10 ננומטר עם רשתות אלה. ערכות ביוטינילציה זמינות מסחרית עבור חלבונים ופריימרים ביוטיניל עבור קומפלקסים המכילים DNA מקלים יחסית על הצמדת הביוטין הדרוש לרוב הדגימות המעניינות. בנוסף לריכוז הדגימה והרחקתה מהממשק האוויר-מים המזיק במהלך ההכתמה, הביוטינילציה האקראית של שאריות ליזין אחת או רק כמה יכולה לשפר באופן משמעותי את טווח הכיוונים של המולקולה המעניינת ברשת cryo-EM, כפי שהודגם במספר מחקרים11. בעוד שהאות מגביש הסטרפטאווידין הבסיסי קיים בתמונות הגולמיות, ניתן להסיר בקלות סכמות עיבוד נתונים הכוללות סינון פורייה של השתקפויות בראג חדות מהגביש במהלך עיבוד נתונים מוקדם, ובסופו של דבר לאפשר שחזורים ברזולוציה גבוהה של המדגם המעניין 11,12,13 . כאן, פרוטוקול אופטימלי, שלב אחר שלב מסופק לייצור חזק של רשתות זיקה סטרפטאבידין ושימוש לאחר מכן בניסויי cryo-EM. הפרוטוקול שסופק צפוי להסתיים על פני תקופה של שבועיים (איור 1A). החלקים הראשונים של הפרוטוקול מתארים את הכנת הריאגנטים, הטיפול המוקדם ברשתות ואת שלבי אידוי הפחמן הראשונים. לאחר מכן, מתוארות הוראות להכנת מונושכבה שומנים וצמיחה של גבישי סטרפטאבידין על רשתות EM. בנוסף, ניתנות הוראות לשימוש ברשתות זיקה סטרפטווידין בניסויי EM כתמים שליליים ו- cryo-EM. לבסוף, נהלים ניתנים להסרת אות סטרפטווידין ממיקרוגרפים לאחר רכישת נתוני cryo-EM.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים
- לדלל סטרפטווידין שנרכש מסחרית לריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל בחיץ התגבשות (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose). יש לוודא כי ריכוז הטרהלוז הסופי הוא 10%. הקפאת הבזק aliquots של 25-50 μL בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 ° C.
- יש להמיס 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) נתרן מלח לתוך 65:35:8 v/v/v כלורופורם/מתנול/ממס מים לקבלת ריכוז שומנים סופי של 1 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן Aliquots לשימוש חד פעמי של 20-30 μL ב -80 °C בבקבוקוני זכוכית.
הערה: הכנת ממס מדויקת יותר אם היא נעשית לפי משקל. ראשית, שלבו 1.85 גרם מים טהורים במיוחד עם 6.41 גרם מתנול ברמת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) והוסיפו זאת ל-22.42 גרם כלורופורם כדי להכין את הממס.
התראה: אנא קרא והבן את גיליונות נתוני הבטיחות של היצרנים ואת ההוראות המומלצות לטיפול וסילוק של ממיסים אורגניים כלורופורם ומתנול לפני תחילת פרוטוקול זה. יש להימנע ממגע ישיר של מתנול עם העור.
2. טיפול מקדים ברשתות
- שטפו רדיד פחמן על רשתות רשת זהב על ידי טבילה פעמיים ב-100% כלורופורם ופעם אחת ב-100% אתנול. הניחו את הרשתות על נייר מסנן נקי לייבוש. חזרו על תהליך הכביסה במשך שלושה מחזורים בסך הכל.
הערה: הצלחה ניתנת לשחזור הושגה באמצעות רשתות רדיד פחמן זמינות מסחרית בעלות סרט פחמן בעובי 10-12 ננומטר (ראה רשימת חומרים) עם גדלי חורים הנעים בין 0.6-2 מיקרומטר. רשתות רדיד זהב זמינות מסחרית ורשתות פחמן חורי תוצרת בית שהוכנו בעקבות פרוטוקול ננו-ייצור14 של מעבדת רובינשטיין שימשו גם הם בהצלחה. תוצאות פחות ניתנות לשחזור הושגו עם רשתות זמינות מסחרית בעלות יריעות פחמן דקות יותר. אין להשתמש ברשתות נחושת, מכיוון שנחושת מגיבה עם אמינים אורגניים שעשויים להימצא בדגימה. - לאחר שהרשתות מתייבשות, יש לאדות שכבה בעובי 2.5-5 ננומטר של פחמן לצד הפחמן של רשתות הפחמן החוריות. עובי הפחמן נשלט באמצעות מדידת עובי סרט גבישי קוורץ המובנית במאייד הפחמן המסופק בקובץ טבלת החומרים .
- אפשרו לפחמן שזה עתה התאדה להזדקן (כלומר, להיות הידרופובי יותר) למשך שבוע אחד.
3. הכנת סריג סטרפטאבידין
הערה: כדי לגדל גבישי סטרפטאבידין דו-ממדיים על רשתות EM של פחמן חורי, ראשית, מונו-שכבה של שומנים ביוטיניליים מוחלת על החורים של סרט הפחמן (איור 1B) על-ידי העברת Langmuir-Schaefer. חד-שכבת השומנים נוצרת בעקבות השלבים הבאים (איור 2). אבקת טלק יוצרת גבול בין שמן הקיקיון לצלחת הפטרי, ושכבה דקה של שמן קיק מסייעת לשמור על לחץ פנים קבוע בעת יצירת חד-שכבה של השומנים. הצד המכיל את הפחמן המתאדה משלב 2.2 משמש לאיסוף החד-שכבתי, שומנים עודפים נשטפים באמצעות חיץ התגבשות, ותמיסת סטרפטווידין מודגרת על הרשת לצורך התגבשות.
- נקו את אזור הספסל עם 70% אתנול.
- יש לשטוף מזרק זכוכית 5 μL מספר פעמים עם כלורופורם לניקוי. הניחו למזרק להתייבש לחלוטין לפני השימוש.
- שטפו שוב רשתות שהתאדו בפחמן, כלומר ממש לפני השימוש, על ידי טבילתן באתנול 100%. הניחו לרשתות להתייבש על נייר סינון נקי.
- בזמן שהרשתות מתייבשות, שטפו כל פינצטה אנטי-נימית עם 100% כלורופורם ו-100% אתנול. הניחו לפינצטה להתייבש לחלוטין.
- בצד הנקי של הפרפילם, הכינו שלוש טיפות 50 מיקרוליטר של חיץ התגבשות (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose) עבור כל רשת שתיווצר.
- מלאו את המכסה של צלחת פטרי לא מצופה בקוטר 35 מ"מ בחיץ התגבשות (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose). נקו את פני השטח בעזרת נייר עדשה.
- מפזרים אבקת טלק באיכות מדעית סביב היקף צלחת הפטרי. זה משמש לאחר מכן אינדיקטור, בשלב הבא, של כמה רחוק שמן הקיקיון התפשט. הוסיפו מספיק אבקת טלק כדי ליצור מחסום שמגן על שמן הקיקיון מפני נגיעה בשולי צלחת הפטרי. הוספת יותר מדי אבקת טלק מגבילה את השטח הזמין ליצירת שכבה אחידה של השומנים.
- טבלו קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר בשמן הקיקיון לקבלת טיפה בינונית (כ-20 מיקרוליטר) התלויה מקצה הפיפטה. געו בטיפה זו לפני השטח של החיץ בצלחת הפטרי, שם היא תתפשט ליצירת סרט אחיד. הסרט הדק שנוצר של שמן משמש בוכנה15, אשר שומר על לחץ פני השטח קבוע כאשר monolayer שומנים נוצרת (שלב 3.10).
הערה: חשוב להוסיף מספיק שמן קיק ולא מעט מדי, ועדיף להוסיף טיפה אחת. הניחו לשמן הקיקיון להתפשט במלואו לפני יצירת חד-שכבתי השומנים. - שטפו את מזרק הזכוכית 5 μL פעם או פעמיים עם השומנים המומסים לפני נטילת aliquot לשימוש. הימנעו מיצירת בועות אוויר בשומנים הממלאים את המזרק.
הערה: מזרק הזכוכית נשטף בשומנים מומסים למקרה שנשאר כלורופורם שיורי משלב 3.2. כלורופורם שיורי יכול להשפיע על איכות monolayer וכתוצאה מכך. - מוציאים את הנפח הקטן ביותר האפשרי (~0.5 מיקרוליטר) של שומנים מהמזרק ונוגעים בעדינות בטיפה התלויה על פני השטח של סרט שמן הקיק. שימו לב שתמיסת השומנים פורצת דרך סרט שמן הקיקיון בנקודת המגע וכי חד-שכבת השומנים המתקבלת יוצרת עיגול במרכז הסרט הדק של שמן הקיק.
- הוסיפו כמה טיפות של שומנים ברצף או הוסיפו עוד שומנים לאחר יצירת כמה רשתות, אך אם מוסיפים יותר מדי, השומנים יתפשטו מעבר לגבול שמן הקיק אל תוך ההיקף שבו אבקת הטלק וכל חומר פעילי שטח מזהם נתפסו. במקרה כזה, יהיה צורך להפעיל מחדש את התהליך.
- הרימו רשת עם פינצטה אנטי-נימית כך שהזרוע הישרה של הפינצטה והצד המתאדה בפחמן של הרשת יפנו שתיהן לחד-שכבה.
- העבירו חלק מהשכבה החד-שכבתית לפחמן החור על ידי נגיעה בצד המתאדה של הרשת לשכבה החד-שכבתית למשך 1-2 שניות.
הערה: העברה מוצלחת מסומנת על ידי כך שפני השטח של הרשת הופכים הידרופיליים, מה שגורם למכסה חיץ דק וכדורי לכסות את כל הרשת לאחר שהיא הוסרה מצלחת הפטרי. - געו במכסה הכדורי של החיץ שנצמד כעת לרשת, ברצף למשך שנייה אחת כל אחת, בשלוש טיפות 50 μL של חיץ התגבשות שהוכנו על פרפילם בשלב 3.5.
הערה: שלב זה מנסה להסיר ככל האפשר את עודפי השומנים, המכסים את פני השטח של המכסה הכדורי (ולא את סרט הפחמן ההידרופובי לשעבר), על מנת למנוע היווצרות של בועיות שומנים כאשר דגימות נצפות במיקרוסקופ אלקטרונים. - הוסף בזהירות 4 μL של סטרפטאווידין 0.5 מ"ג / מ"ל לתוך המכסה הכדורי הנותר של חיץ התגבשות על הרשת.
- הניחו את הרשת בתא לחות. חזור על שלבים 3.11-3.14 עבור כל קבוצת הרשתות.
- דגרו על הרשתות בטמפרטורת החדר (RT) במשך שעתיים בתוך תא לחות כדי למנוע אידוי.
הערה: חשוב שהצד המוזהב של הרשת לא יירטב בשום שלב לאחר מריחת השכבה החד-שכבתית. - לאחר הדגירה של שעתיים, הכינו טיפה אחת של 300 מיקרוליטר של חיץ שטיפה (10 mM HEPES, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose) לכל רשת בצד הנקי של הפרפילם.
הערה: מאגר השטיפה מכיל 50 mM KCl במקום 150 mM KCl, שנמצא במאגר ההתגבשות המשמש לשלבים 3.5-3.6. - שטפו את עודפי הסטרפטאווידין (הלא קשורים) על ידי הנחת הרשת על טיפת 300 מיקרוליטר של מאגר השטיפה. בצע את שלבים 3.18-3.20 עבור רשת אחת בכל פעם. הימנע מהשארת הרשתות על טיפת מאגר השטיפה של 300 μL לפרקי זמן ממושכים.
הערה: רק שטיפה אחת מבוצעת מכיוון שקריסטל הסטרפטאבידין/מונושכבה שביר בשלב זה. בכל פעם שמרימים רשת מפני השטח של טיפת חיץ כביסה, גשר הנוזלים בין הרשת לטיפת הכביסה נקרע. בזמן הקרע, שיפוע לחץ חולף (לחץ יניקה) מוחל על גבישים חד-שכבתיים הנתמכים על ידי עצמם המשתרעים על פני החורים הפתוחים של סרט הפחמן. לחץ יניקה זה צפוי לגרום לכיפה חולפת של הגביש החד-שכבתי, המלווה בהתרחבות השטח המכוסה על ידי הגבישים. אם הגידול בשטח חורג מהגבול האלסטי של הגביש, הגביש עלול להישבר או להיות לא מסודר. - יבש מיד את הפינצטה נגד נימים עם מגבון ללא סיבים כדי להקל על שחרור הרשת על נייר סינון בשלב הבא. הרימו את הרשת הצפה על טיפת חיץ השטיפה על ידי הדבקת הזרוע המעוקלת של הפינצטה האנטי-נימית לתוך הטיפה.
- הרחיקו את המאגר העודף בעדינות מהצד בעזרת נייר פילטר. הניחו את הרשת על נייר סינון עם צד הזהב כלפי מטה, חזרו על שלבים 3.18-3.20 עבור כל רשת, ואפשרו לרשתות להתייבש במשך 15-20 דקות.
- לאחר שהרשתות יבשות, הפכו אותן כך שצד הזהב פונה כעת כלפי מעלה. התאדו שכבה דקה של פחמן (בעובי של 0.5-2 ננומטר) על הצד המוזהב של הרשתות.
הערה: אחסן רשתות בלחות קבועה, שערכה אינו משנה, וציין כי שינויים מרובים בלחות היחסית צפויים לגרום למחזורי התרחבות והתכווצות. אפשר לרשתות להתיישן במשך שבוע לפני השימוש ב- cryo-EM לקבלת התוצאות הטובות ביותר מכיוון שההידרופוביות של הצד האחורי של הרשת עשויה להיות חשובה ליציבות חד-שכבתית. הרשתות יציבות לפרקי זמן ארוכים, אך לאחר 3 חודשים, הפחמן האחורי עשוי להיות פחות הידרופובי.
4. בדיקת איכות אצווה של רשת זיקה סטרפטאבידין על ידי כתם שלילי
- הכינו שתי טיפות של 50 μL וטיפה אחת של 100 μL של חיץ דגימה (50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP) בצד הנקי של הפרפילם.
- הסר את רשתות הטרהלוז והרט סטרפטאבידין על ידי נגיעה בשתי טיפות 50 μL ותן לרשת לצוף על טיפת 100 μL של מאגר הדגימה למשך 10 דקות.
הערה: עדיף להימנע משימוש בחומר ניקוי במהלך ההתייבשות והדגירות הבאות של קשירת הדגימה. החיץ יתפזר לצד הזהב של הרשתות ויגביל את יעילות השטיפות כדי להסיר דגימות עודפות. - לאחר החזרת נוזלים, הרימו את הרשת עם פינצטה אנטי נימית, כך שהזרוע המחוטבת של הפינצטה האנטי נימית נמצאת בטיפה.
- כתם בעדינות את המאגר העודף הרחק מהצד והחל מחדש במהירות 4 μL של דגימה של 75-100 ננומטר (אופציונלי).
הערה: הימנע מלתת לרשת להתייבש לאחר התייבשות. - יש לדגור על הדגימה בתא לחות למשך 1-5 דקות.
הערה: זמני הריכוז והדגירה יהיו תלויי דגימה ויש למטב אותם. ריכוז הדגימה המסופק וזמן הדגירה מוצעים לנקודות התחלה. - בצד הנקי של הפרפילם, יש לטפטף ארבע טיפות של 30 μL כל אחת הן של חיץ הדגימה והן של כתם 1% אורניל פורמט (UF).
הערה: אנא קרא והבן את גיליונות נתוני הבטיחות של היצרנים ואת ההוראות המומלצות לטיפול וסילוק של פורמט אורניל לפני ביצוע שלב זה. פורמט אורניל הוא תרכובת רעילה ורדיואקטיבית. יש להקפיד על קבלת אישור מוסדי מראש לשימוש בחומר רדיואקטיבי. - שטפו את הדגימה הלא מאוגדת על ידי נגיעה בכל אחת מארבע טיפות מאגר הדגימה.
- הכתימו את הדגימה באמצעות הליכי כתמים שליליים סטנדרטיים עם UF. כתם בעדינות את כתם UF מהצד, משאיר שכבה עבה מאוד של כתם על הרשת. ניתן למרוח 0.5 מיקרוליטר נוסף של כתם על הרשת לאחר הכתמה כדי להפוך את הכתם לעבה יותר במידת הצורך. אפשרו לרשת להתייבש באוויר.
הערה: מכיוון שרשתות הסטרפטאבידין הן הידרופיליות מאוד, כתם שלילי נוטה ליצור סרט אחיד מאוד בכל מקום, בניגוד למה שנראה בדרך כלל בשימוש ברשתות פחמן רציפות המטופלות בפריקת זוהר. כתוצאה מכך, מומלץ להשאיר סרט עבה יותר של תמיסת כתמים.
5. הקפאת רשתות זיקה סטרפטאבידין עם דגימות ביוטינילציה
הערה: ההליך הבא מיועד לבוכנה אוטומטית חד-צדדית המכילה חיישן הדבקה פנימי (ניתן גם לבצע ניקוי ידני חד-צדדי במנגנון צלילה אוטומטי אחר)
- הכינו שתי טיפות של 50 μL וטיפה אחת של 100 μL של חיץ דגימה (למשל, 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP) בצד הנקי של הפרפילם.
- התייבשו רשתות סטרפטווידין על ידי נגיעה בשתי טיפות 50 μL ותנו לרשת לצוף על טיפת 100 μL של מאגר הדגימה למשך 10 דקות.
- לאחר החזרת נוזלים, הרימו את הרשת עם פינצטה אנטי נימית, כך שהזרוע המחוטבת של הפינצטה האנטי נימית נמצאת בטיפה.
- יש לכתם בעדינות את המאגר העודף הרחק מהצד ולמרוח במהירות 4 μL של דגימה של 75-100 ננומטר.
- יש לדגור על הדגימה בתא לחות למשך 1-5 דקות.
הערה: שוב, זמני הריכוז והדגירה יהיו תלויי דגימה ויש לייעל אותם. ריכוז הדגימה המסופק וזמן הדגירה מוצעים לנקודות התחלה. עבור דגימות בריכוזים נמוכים ניתן לדגור לפרקי זמן ארוכים יותר ו/או לקשור את הדגימה לרשתות מספר פעמים. - הכינו שתי טיפות של 10 μL של חיץ הקפאה (למשל, 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP, 3% trehalose, 0.01% NP40) בצד הנקי של parafilm. לאחר הדגירה, שטפו את הדגימה הלא מאוגדת על ידי נגיעה ברשת עד לטיפה הראשונה של מאגר ההקפאה. שחרר את הרשת על הטיפה השנייה של מאגר ההקפאה.
- תפסו במהירות את קצה הרשת עם הפינצטה המחוברת לבוכנה האוטומטית החד-צדדית. מחק בעדינות את המאגר העודף והחל במהירות 4 μL של מאגר הקפאה (50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM KCl, 0.5 mM TCEP, 3% trehalose, 0.01% NP40) על הרשת.
- חברו פינצטה לבוכנה האוטומטית החד-צדדית. התוצאות הטובות ביותר הושגו באמצעות חיישן כתם המזהה את טיפת הנוזל על הרשת עם זמני כתם בין 4-6 שניות. התנאים ישתנו בהתאם לדגימה ולמאגר שבו נעשה שימוש.
6. עיבוד נתונים של סרטי cryo-EM שנאספו מרשתות זיקה סטרפטאווידין
איסוף נתונים על רשתות זיקה סטרפטאבידין יכול להתבצע כמו ברשתות סטנדרטיות, ואין צורך בהתאמות מיקרוסקופ מיוחדות. עם זאת, ההליך המפורט כאן מסיר את אות הסטרפטאבידין רק לאחר תיקון תנועה של המיקרוגרף. לכן, לא ניתן לבצע באופן מהימן שלבי עיבוד נתונים, כגון ליטוש חלקיקים, המסתמכים על מסגרות סרט מקוריות. חיסור אות סטרפטאבידין (נדרש עבור כל עיבוד סטנדרטי במורד הזרם, למעט הערכת CTF) כאן דורש Matlab גרסה R2014b או חדשה יותר הפועלת בסביבת לינוקס. חיסור האות מסתמך על האופי הגבישי של שכבת הסטרפטאווידין, המאפשר מיסוך שיא, ומכאן הסרת אות מהתמרת פורייה של כל מיקרוגרף.
- הגדרת סקריפטי העיבוד
- העתק את כל הקבצים מקבצים משלימים לתיקייה ייעודית בספריית הפרויקט
- הכן ספריה בשם processing_scripts הכוללת את הקבצים הבאים:
lsub.m (קובץ קידוד משלים 1; סקריפט החיסור)
process_subtration.sh (קובץ קידוד משלים 2; סקריפט עטיפה שעובר בלולאה על כל המיקרוגרפים הזמינים, משריץ עבודות מקבילות ועוקב אחר הקלט והפלט)
process_subtraction.cfg (קובץ קידוד משלים 3; קובץ תצורה המכיל את הפרמטרים עבור משימת החיסור, ראה 6.2) - הכן ספריה בשם support_scripts הכוללת את הקבצים הבאים:
bg_drill_hole.m (קובץ קידוד משלים 4)
bg_FastSubtract_standard.מ (קובץ קידוד משלים 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (קובץ קידוד משלים 6)
bg_push_by_rot.מ (קובץ קידוד משלים 7)
ReadMRC.m (קובץ קידוד משלים 8)
WriteMRC.m (קובץ קידוד משלים 9)
WriteMRCHeader.m (קובץ קידוד משלים 10)
- התאם את קובץ התצורה לפי הצורך (process_subtraction.cfg, (עיין באיור 3) לפי הצורך:
- קלט: נתיב לספרייה המכילה את המיקרוגרפים המתוקנים בתבנית MRC. השתמש בספריה או בתבנית כולל תווים כלליים (?, *).
דוגמה:
input="/path/to/project_directory/micrographs/"
או
input="/path/to/project_directory/micrographs/*.mrc" - output_dir: נתיב לספרייה שאליה יש לכתוב את הסריג החסר מיקרוגרפים.
- only_do_unfinished: ציין (true|false) אם יש להחליף או לדלג על מיקרוגרפים קיימים שהוחסרו מראש. פרמטר זה שימושי להפעלת סקריפט חיסור הסריג באמצע הפעלת מיקרוסקופ (ברירת מחדל: true).
- num_parallel_jobs: ציין את מספר המשימות המקבילות. מספר זה תלוי במפרטי החומרה המשמשים לעיבוד ולא אמור להיות גבוה ממספר הליבות הזמינות. במערכות עם 32 ליבות ומערכת קבצים ברשת, ביצועים אופטימליים הושגו עם 14 עבודות מקבילות. לקבלת הביצועים הטובים ביותר, מטב ערך זה עם קבוצת משנה של מיקרוגרפים.
- Pad_Origin_X: 200 עבור גלאי K3 בכיוון לאורך (רוחב תמונה < גובה תמונה) או בעת שימוש בגלאי ריבועי (Falcon III, Falcon IV, K2), 1000 עבור גלאי K3 בכיוון לרוחב (רוחב תמונה > גובה תמונה). FFT מבוצע בקופסאות מרובעות וריפוד נדרש אם הגלאי הוא בעל ממדים שאינם מרובעים.
- Pad_Origin_Y: 1000 לגלאי K3 בכיוון לאורך (רוחב תמונה < גובה תמונה), 200 בעת שימוש בגלאי ריבועי (Falcon III, Falcon IV, K2) או בעת שימוש בגלאי K3 בכיוון לרוחב (רוחב תמונה > גובה תמונה).
- אל תשנה את Inside_Radius_Ang (90) ואת Outside_Radius_Ang (3.0). חיסור הסריג מתבצע בין שתי רזולוציות (היחידה נמצאת באנגסטרום).
- Pixel_Ang: ספק את גודל הפיקסלים כערך נקודה צפה.
- סף: ערך חיתוך סף חיסור להחלפת הסריג ברקע במרחב פורייה. הערכים בשימוש מוצלח הם בין 1.4-1.6. השתמש ב- 1.42 כנקודת התחלה.
- אל תשנה expand_pixel (10) ו- pad_out_opt (0). expand_pixel הוא ערך קוטר המשמש למסיכה סביב פיקסלים עם ערכים גבוהים מסף הסף. pad_out_opt היא אפשרות המחליטה אם אזור מרופד ייכלל בפלט.
- addpath_m: נתיב אל סקריפטי התמיכה.
- path_to_matlab_bin: נתיב לספריית סל ההתקנה Matlab של המערכת.
- path_matlab_script: נתיב לסקריפט החיסור של matlab (lsub.m) שהועתק לעיל בשלב 6.1.2.
- קלט: נתיב לספרייה המכילה את המיקרוגרפים המתוקנים בתבנית MRC. השתמש בספריה או בתבנית כולל תווים כלליים (?, *).
- לאחר שמירת הסקריפט שהשתנה, הפעל את הסקריפט (bash ./process_subtraction.sh ) כדי להחסיר את אות הסטרפטאווידין מהמיקרוגרפים של הקלט. ניתן להפסיק את קובץ ה-script ו/או להפעיל אותו מחדש אם only_do_unfinished הפרמטר מוגדר כ- true (ראה בשלב 6.2.3). אם מתרחשת שגיאה, סקור את הפרמטרים שצוינו בסקריפט bash. ודא שאין רווחים לא מכוונים בין משתני הפרמטרים לבין הערכים שהוקצו להם, מכיוון שזהו מקור נפוץ לטעויות.
- השתמש בסריג שהוחסרו תמונות לעיבוד תמונה סטנדרטי של cryo-EM.
Representative Results
לאחר אידוי הפחמן בשלב 3.21 (בדרך כלל לאחר שבוע), ניתן להשתמש ברשתות זיקה סטרפטווידין להכנת דגימת cryo-EM או כתם שלילי בהתאם להליכים המתוארים בשלבים 4 ו -5. מיקרוגרף מייצג שצולם באמצעות גלאי K3 על טיטאן קריוס בהגדלה של 81,000X עם גודל פיקסל של 1.05 Å של דגימה ביוטינילית שהוקפאה עם רשתות זיקה סטרפטאווידין מוצג באיור 4A. היווצרות סריג מוצלחת נצפית על-ידי תבנית הרשת הרציפה המופיעה ברקע התמונה. ניתן לראות זאת בקלות רבה יותר על-ידי תבנית העקיפה שמופיעה בהתמרת פורייה המהירה (FFT) המוצגת באיור 4A (מימין). לאחר איסוף הנתונים, בהתאם להליך המתואר בשלב 6 של פרוטוקול זה, ניתן להסוות באופן חישובי את האות שנתרם לתמונה על-ידי סריג הסטרפטאווידין כדי לייצר מיקרוגרף מופחת (איור 4B) שניתן להשתמש בו לשלבי עיבוד הנתונים הבאים. FFT באיור 4B (מימין) מראה שתבנית העקיפה שנצפתה באיור 4A (מימין) הוסרה בהצלחה מהתמונה המקורית.
איור 4C מראה מיקרוגרף לדוגמה שצולם במיקרוסקופ Tecnai 12 בהגדלה של 49,000x עם גודל פיקסלים של 1.6 Å של דגימה ביוטינילית הקשורה לרשתות זיקה של סטרפטאווידין ומוכתמת באופן שלילי באמצעות פורמט אורניל. רשתות הוכנו בהתאם להליך המתואר בשלב 4 של פרוטוקול זה, והותירו סרט עבה יותר של כתמים.
ישנן מספר תצפיות נפוצות כאשר הליך ייצור רשת סטרפטאווידין אינו מוצלח המתוארות בהמשך פרק הדיון ובטבלה 1. תרשים 5 מציג מספר דוגמאות לתצפיות אלה. איור 5A מראה מיקרוגרף של רשת זיקה לסטרפטאווידין מוכתמת באופן שלילי ששימשה מאצווה בת יותר משישה חודשים. החד-שכבה התגייסה מהחורים ברדיד הפחמן של רשתות הקוואנטיפויל ונצפתה בממדים דומים לחורים ברשת. איור 5B מראה דוגמה של גבישי סטרפטווידין בעלי פסיפסיות גבוהה שהופכים מופרעים בקלות במהלך הליכי הכנת הדגימה. איור 5C מראה מיקרוגרף מייצג מרשת זיקה סטרפטאווידין שבה אידוי הפחמן בשלב 3.21 דק מדי או מושמט. סריג הסטרפטאבידין הפך מקוטע במהלך תהליך הכנת דגימת cryo-EM. איור 5D מראה רשת זיקה סטרפטאבידין מוכתמת שלילית, שיש לה זיהום משלפוחיות שומנים, ככל הנראה בגלל שטיפות לא מספיקות במהלך שלב 3.13 או שצד הזהב של הרשת נרטב במהלך שלבים 3.13-3.20. עיין בסעיף הדיון ובטבלה 1 לקבלת אסטרטגיות להתגברות על בעיות נפוצות אלה.
איור 1: סכמטי של הליך ייצור רשת זיקה סטרפטאווידין. (A) ציר זמן סקירה כללית של הליך ייצור רשת זיקה סטרפטווידין. ניתן להשלים את ההליך כולו במשך שבועיים הדורשים שני שלבי אידוי פחמן ושבוע לאחר כל אחד מהם כדי לאפשר לפחמן להזדקן מספיק. (B) זום לאור ריבוע רשת של רשת זיקה סטרפטאווידין המציג את השכבות המרכיבות את הרשת לאחר השלמת תהליך הייצור, כולל רשת cryo-EM סטנדרטית עם מטילי זהב וסרט פחמן חורי, שכבת הפחמן המתאדה הראשונה, חד-שכבה ליפידית, גביש סטרפטווידין דו-ממדי ושכבת תמיכת הפחמן המתאדה בישבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התגבשות חד-שכבתית ליפידית וסטרפטאווידין (A) תמונות המדגימות כיצד ליצור בהצלחה את חד-שכבת השומנים בתוך צלחת הפטרי הקטנה תוך שימוש באבקת טלק ליצירת גבול לשמן הקיקיון שיוצר לחץ קבוע על פני השטח תוך יצירת חד-שכבה ליפידית. (B) תמונות המדגימות כיצד לגדל גבישי סטרפטאבידין על רשתות cryo-EM. ראשית, צד הפחמן של הרשתות נוגע בחד-שכבה השומנית ולאחר מכן שלוש שטיפות רצופות במאגר ההתגבשות. Streptavidin מתווסף, רשתות מודגרים בתא לחות במשך 2 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פרמטרים לדוגמה עבור קובץ process_subtraction.cfg לביצוע חיסור סריג סטרפטאווידין ממיקרוגרפים (שלב 6). לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות של ייצור מוצלח של רשת זיקה סטרפטאווידין. (A) מיקרוגרף Cryo-EM של קומפלקסים חלבוניים/נוקלאוזומים ביוטינילטים שהוכנו עם רשתות זיקה סטריפטאווידין ביתיות. ה- FFT מוצג מימין ומראה את דפוס עקיפה של גבישי סטרפטאבידין. (B) אותו מיקרוגרף כמו בלוח A מוצג לאחר הליך חיסור הסריג כדי להסיר את האות מגביש הסטרפטאווידין הדו-ממדי מהתמונה המקורית. (C) דוגמה למיקרוגרף המתקבל מצביעה שלילית של דגימה ביוטינילית הקשורה לרשתות זיקה סטרפטווידין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות מייצגות של ייצור רשת זיקה סטרפטאווידין לא מוצלח . (A) מיקרוגרף המראה את הניוד של חד-שכבת הסטרפטאווידין מחורי הרשת כאשר הרשתות בנות יותר משישה חודשים. (B) מיקרוגרף המראה סריגי סטרפטאבידין עם פסיפס גבוה שניזוקו בקלות במהלך הליכי הכנת דגימות cryo-EM וכתמים שליליים. (C) מיקרוגרף המראה פיצול של סריג הסטרפטאווידין במהלך הכנת דגימת cryo-EM כאשר שכבת אידוי הפחמן בשלב 3.21 דקה מדי או מושמטת. (D) מיקרוגרף מייצג המזוהם בשלפוחיות שומנים ככל הנראה עקב כביסה לא מספקת במהלך שלב 3.13 או שצד הזהב של הרשת נרטב במהלך שלבים 3.13-3.20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: מדריך לפתרון בעיות כדי להתגבר על אתגרים נפוצים שבהם נתקלים במהלך ייצור לא מוצלח של רשת זיקה סטרפטאווידין. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ קידוד משלים 1: lsub.m אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 2: process_subtration.sh אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 3: process_subtraction.cfg אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 4: bg_drill_hole.מ אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 5: bg_FastSubtract_standard.מ אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.מ אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 7: bg_push_by_rot.מ אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 8: ReadMRC.m אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 9: WriteMRC.m אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 10: WriteMRCHeader.m אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
Discussion
הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד ליצור רשתות זיקה סטרפטאווידין ולהשתמש בהן וכיצד לעבד את הנתונים המכילים את אות עקיפה סטרפטאווידין. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול הדורשים תשומת לב מיוחדת.
ניתן לייחס אצוות רשת לא מוצלחות למספר שגיאות נפוצות. מקור השגיאה הנפוץ ביותר מגיע משימוש בריאגנטים מיושנים או באיכות ירודה. חשוב במיוחד להכין את תמיסת השומנים הביוטיניליים בדיוק כפי שמתואר בפרוטוקול. יתר על כן, כל זיהומים, כגון שאריות חומרי ניקוי על כלי המעבדה או שמנים נוכחים באופן טבעי על העור, יכול להשפיע על איכות גבישי סטרפטווידין, ומכאן, את איכות התמונות המתקבלות. לכן מומלץ לבצע שלושה מחזורי שטיפה לרשתות לפני אידוי הפחמן הראשון כדי להסיר זיהום פעילי שטח אפשרי מיצרן הרשת (שלב 2.1). בנוסף, זיהום או טומאה של שמן קיק נצפו כדי לעכב היווצרות גבישים על הרשת.
ביצוע ואיסוף monolayer שומנים היא משימה כי יש לתרגל כמה פעמים כדי לקבל תחושה של נפחי שומנים קטנים. אין זה יוצא דופן ששלב זה נכשל בפעמיים או שלוש הראשונות לפני שניתן לייצר שכבה אחידה מספקת של שומנים, כפי שמשתקף בסופו של דבר באיכות גבישי הסטרפטאבידין שנראים ברשתות מוכתמות באופן שלילי (איור 4C).
חשוב לעולם לא לתת לחלק האחורי (צד הזהב, צד השומנים) של הרשת להירטב במהלך תהליך ייצור הרשת (שלבים 3.12-3.20). במקרה שהישבן נרטב, מומלץ להשליך את הרשת. הדבר עלול לגרום להופעתן של בועיות שומנים גדולות המשבשות את איכות התמונה (איור 5D) (שורה 3, טבלה 1). שלפוחיות שומנים ניתן לראות גם עקב כביסה מספקת לאחר monolayer השומנים מוחל (שלב 3.13). שלוש שטיפות עוקבות באמצעות חיץ התגבשות מומלצות לאחר נגיעה בשכבה האחידה של השומנים לפני הוספת סטרפטווידין.
לאחר ששכבה דקה של פחמן התאדה על רשתות משובצות טרהלוז, החלק האחורי של הרשת יכול להיות רטוב מבלי לפגוע באיכות הסריג. לדוגמה, הרטבה של החלק האחורי נצפתה לעתים קרובות כאשר מאגר הדגימה מכיל אפילו כמויות מינימליות של חומר ניקוי. הרטבה של החלק האחורי על ידי הדגימה עלולה לגרום לקשירה לא ספציפית של דגימות לסרט הפחמן הדק בצד האחורי, מה שמקטין את היעילות של מניעת התפזרות חלקיקים לממשק אוויר-מים או שימוש בקשירת זיקה לאסטרטגיות טיהור ברשת. במידת האפשר, הוסף את הדגימה לרשת בהיעדר חומר ניקוי. לאחר מכן ניתן להוסיף חומרי ניקוי ותוספים אחרים במהלך שלבי שטיפת הרשת או להוסיף בשלב אחרון לפני ויטריפיקציה. זוהי מגבלה אחת לשימוש ברשתות זיקה סטרפטווידין; עם זאת, אם המטרה היא לשפר את האוריינטציה המועדפת, הכנת הדגימה עם חוצצים, כולל חומר ניקוי, בוצעה בהצלחה11.
מקור טעות נפוץ ניתן לייחס לגיל הרשתות ביחס לשני שלבי אידוי הפחמן (שלב 2.3 ושלב 3.21). בפרוטוקול זה, תקופת ההמתנה המומלצת היא 5-7 ימים לאחר אידוי הפחמן האחורי לפני השימוש ברשתות סטרפטווידין עבור cryo-EM. כאשר נעשה שימוש ברשתות זמן קצר מדי לאחר הייצור, הסריג וחד-שכבת השומנים נצפו מתגייסים החוצה מחורי הרשת. תצפית דומה יכולה להתבצע כאשר הרשתות ישנות מדי ומשתמשים בהן לאחר שישה חודשים (איור 5A) (שורה 1, טבלה 1). אנו משערים כי תצפית זו מוסברת על ידי שינויים בהידרופוביות של גב הפחמן המיושם לייצוב גבישי החד-שכבה והסטרפטאבידין. בנוסף, סריגי סטרפטאבידין עשויים להיראות פסיפס (איור 5B) (שורה 3, טבלה 1) ושבורים הן בכתם שלילי והן ב-cryo-EM אם החד-שכבה מיושמת על רשתות שבהן שכבת אידוי הפחמן הראשונה (שלב 2.3) לא התיישנה מספיק.
מקור נפוץ נוסף לטעות ניתן לייחס לשבריריות של החד-שכבה הגבישית סטרפטאבידין (חד-שכבה שומנית היא עצמה נוזלית ויכולה להתרחב או לדחוס באופן הפיך). אידוי הפחמן האחורי (שלב 3.21) מספק יציבות קריטית הן לסריג החד-שכבתי והן לסריג הסטרפטאבידין במהלך ספיחת הדגימה, השטיפה ותהליך הכתמת cryo-EM. בהיעדר אידוי פחמן מספק לחלק האחורי של הרשת, סריגי סטרפטווידין ייראו לעתים קרובות מקוטעים לאחר כתמים/הקפאה (איור 5C) (שורה 2, טבלה 1). בפרוטוקול זה, אנו מציעים להשתמש במקפיא צלילה אוטומטי חד צדדי לכתמים חד צדדיים. שיטה זו מניבה תנאי הכתמה הניתנים לשחזור גבוה המשמרים את סריג הסטרפטאבידין בתהליך ההקפאה ומאפשרים אופטימיזציה יעילה של יישום הדגימה ופרמטרי ההקפאה. לחלופין, נעשה שימוש במכשירים אוטומטיים אחרים להקפאת צלילה בשילוב עם הקפאה ידנית. לשם כך, פונקציית הניקוי בפועל מושבתת בהגדרות המכשיר, והרשת נמחקת במקום זאת על ידי הגעה עם זוג פינצטה המחזיקה נייר ניקוי דרך הכניסה הצדדית. שיטה זו יכולה להשיג תוצאות באיכות גבוהה עבור מעבדות ללא מכשיר הקפאה חד צדדי והקפאה; עם זאת, יכולת השחזור מרשת לרשת מאתגרת.
בעוד שלשימוש ברשתות זיקה סטרפטווידין יש יתרונות רבים, יש לקחת בחשבון כמה מגבלות של שיטה זו. בשל אופי ההליך, בדרך כלל לא ניתן להעריך את איכות סריג הסטרפטאווידין עד להשלמת התהליך כולו. מומלץ לסנן במהירות את האיכות של כל אצווה על ידי כתם שלילי לפני הקפאת דגימות. בשל האות שנתרם על ידי סריג סטרפטווידין לתמונות הגולמיות, זה יכול להיות מאתגר במקרים מסוימים להעריך, מתוך התמונות בלבד, אם יש מספר מספיק של חלקיקים שלמים ומפוזרים. מאותה סיבה, עיבוד מהיר של נתוני cryo-EM במהלך רכישת נתונים אינו אפשרי אלא אם הליך חיסור אות סטרפטאווידין נכלל בצינור טרום עיבוד הנתונים. מכיוון שאות הסטרפטאווידין מופחת בדרך כלל מהתמונות המתוקנות בתנועה ולא מהמסגרות עצמן, ליטוש בייסיאני, כפי שמיושם בחבילות תוכנה פופולריות, עלול להיכשל בעת שימוש בפרוצדורות החיסור כמתואר. לכן מומלץ לבצע תיקון תנועה במספר טלאים כדי למזער את תנועת החלקיקים מתחילת עיבוד הנתונים16.
למרות מגבלות אלה, רשתות זיקה סטרפטווידין מציעות יתרונות רבים. שני יתרונות עיקריים שרשתות זיקה סטרפטאווידין מספקות על פני רשתות קריו-EM סטנדרטיות עם חורים פתוחים הם אמצעי להגן על דגימות מממשק אוויר-מים ולרכז דגימות בשפע נמוך (10-100 ננומטר) ברשת. שכבות תמיכה אחרות, כגון פחמן ותחמוצת גרפן, יכולות לשמש גם כאסטרטגיות להתגבר על צווארי בקבוק אלה בהכנת הדגימות. בדוגמה אחת, רשתות זיקה סטרפטווידין היו הפתרון היחיד להשגת שחזור שלם של אינטראקציה חלבונית-חומצת גרעין שלא התאימה לגישות הצלבה. 12
יתרון משמעותי נוסף שמספקות רשתות זיקה סטרפטאבידין הוא פתרון לדגימות הנספחות לשכבות תמיכה אחרות, כגון פחמן או תחמוצת גרפן, עם כיוונים מועדפים המעכבים את היכולת לקבל שחזור תלת ממדי של הדגימה המעניינת. ביוטינילציה אקראית של דגימות באמצעות ערכות זמינות מסחריות מאפשרת חיבור אקראי של הדגימה המעניינת לשכבה החד-שכבתית של סטרפטאבידין כדי להשיג תצוגות פוטנציאליות נוספות כדי להתגבר על אתגר זה.
בנוסף, רשתות זיקה סטרפטווידין מציעות יתרונות ייחודיים לרשתות מבוססות זיקה. הזיקה הגבוהה והספציפיות של אינטראקציית סטרפטווידין-ביוטין מאפשרות צימוד של רשתות זיקה סטרפטווידין עם זרימות עבודה אחרות המערבות ביוטין כדי לטהר קומפלקסים של עניין. באחת הדוגמאות שפורסמו, המחברים שיתקו קומפלקס על רשתות זיקה סטרפטאווידין ודגרו על שותף מחייב של סטויכיומטריה לא ידועה בעודף גדול. לאחר שטיפת כל חלבון לא קשור, סופר מורכב כראוי התקבל וניתן לנתח מיד עם cryo-EM11. יישום עתידי אפשרי אחד עשוי להיות שילוב תגי חלבון קושרי סטרפטווידין, מערכת Avi-tag, או גישות תיוג קרבה עם רשתות זיקה סטרפטווידין כדי לחלץ חלבונים בודדים ו / או קומפלקסים חלבוניים ישירות ממקורות רקומביננטיים או אנדוגניים ללא תוכניות טיהור משוכללות סטנדרטיות.
על ידי מתן פרוטוקול זה, מעבדות אמורות להיות מסוגלות לשחזר בקלות את הייצור של רשתות זיקה סטרפטאווידין ולבסס אותן ככלי נפוץ יותר לניתוח מבני של קומפלקסים חלבוניים על ידי cryo-EM.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
T.C. נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים, מענק הכשרה לביופיזיקה מולקולרית GM-08295 ומלגת מחקר לתואר שני של הקרן הלאומית למדע תחת מענק מספר DGE 2146752. ר.ג. וב.ה. נתמכו על ידי מענק R21-GM135666 של המכון הלאומי לבריאות שהוענק לר.ג. וב.ה. עבודה זו מומנה חלקית באמצעות מענק R35-GM127018 של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים שהוענק ל- E.N. E.N. הוא חוקר במכון הרפואי הווארד יוז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
- Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Williams, R. C., Glaeser, R. M. Ultrathin carbon support films for electron microscopy. Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).
- Han, B. -G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).
- Han, B. -G., et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals. Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).
- Domínguez-Martín, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
- Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).
- Lahiri, I., et al. 3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids. Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Levine, M. J., Schwarz, J. A. Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques. Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
