Summary
ストレプトアビジンアフィニティーグリッドを作製するためのステップバイステップのプロトコルは、クライオ電子顕微鏡法による困難な高分子サンプルの構造研究で使用するために提供されています。
Abstract
ストレプトアビジンアフィニティーグリッドは、サンプルの変性や気水界面によって発生する可能性のある優先配向など、クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)で一般的に遭遇する多くのサンプル調製の課題を克服するための戦略を提供します。しかし、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドは、市販されておらず、慎重な製造プロセスを必要とするため、現在、クライオ電子顕微鏡ラボで利用されているものはほとんどありません。2次元ストレプトアビジン結晶は、ビオチン化脂質単分子膜上に成長し、標準的な穴あき炭素クライオ電子顕微鏡グリッドに直接塗布されます。ストレプトアビジンとビオチンの親和性が高い相互作用により、クライオ電子顕微鏡サンプル調製中に空気-水界面から保護されたビオチン化サンプルのその後の結合が可能になります。さらに、これらのグリッドは、限られた量で入手可能なサンプルを濃縮し、目的のタンパク質複合体をグリッド上で直接精製するための戦略を提供します。ここでは、クライオ電子顕微鏡およびネガティブ染色実験で使用するストレプトアビジンアフィニティーグリッドの頑健な作製のために、段階的に最適化されたプロトコルを提供します。さらに、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドの使用をより大きなクライオ電子顕微鏡コミュニティが利用しやすくするための、一般的に経験される課題に関するトラブルシューティングガイドも含まれています。
Introduction
クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)は、これまでX線結晶構造解析や核磁気共鳴1ではアクセスできなかった、大きくて柔軟で不均一なサンプルの高分子構造決定を可能にすることで、構造生物学の分野に革命をもたらしました。この方法は、溶液中の高分子を瞬間凍結してガラス質の氷の薄層を作成し、その後電子顕微鏡を使用して画像化することができます。近年、顕微鏡ハードウェアと画像処理ソフトウェアの大幅な進歩により、クライオ電子顕微鏡による高分解能構造決定に適した試料の種類がさらに拡大しています。
それにもかかわらず、薄いガラス化サンプルの調製は、クライオ電子顕微鏡による高分子構造決定において最も重要なステップの1つです。生体サンプルは動的で壊れやすく、変性しやすいことが多く、クライオ電子顕微鏡研究用に少量しか入手できないこともあります。ブロッティングプロセス中、これらの粒子は疎水性の空気-水界面と相互作用し、粒子が好む配向、壊れやすい錯体の分解、サンプルの部分的または完全な変性、および凝集を引き起こす可能性があります2,3,4。界面活性剤やその他の界面活性剤の使用、化学的架橋、および層を支持するためのサンプルの吸着は、凍結プロセス中に生物学的サンプルを保存するための一般的な戦略です。酸化グラフェン5,6,7やアモルファスカーボン8などの支持層も、サンプルが限られた量しか入手できない場合に、吸着によって粒子をグリッド上に濃縮する機能も備えています。しかし、これらの方法は一般的でも信頼性もなく、グリッド準備の最適化には非常に時間がかかるか、完全に失敗する可能性があります。
ストレプトアビジン親和性グリッド9,10は、これらの欠点を克服し、目的の複合体を隔離し、空気-水界面から保護するための穏やかで一般的に適用可能な方法を提供するために開発されました。これらのグリッドは、グリッド上のビオチン化脂質の単層上に成長した2次元(2D)ストレプトアビジン結晶格子を利用します。サンプル自体がビオチン化された後(多くの場合、まばらかつランダムに、つまり複合体ごとに平均して1つのビオチンを意味します)、ストレプトアビジンでコーティングされたグリッドに適用できます。サンプルの吸着は、ストレプトアビジンとビオチンの非常に高い親和性に依存しているため、これらのグリッドでは10 nMという低い濃度のサンプルを使用できます。市販のタンパク質用ビオチン化キットおよびDNA含有複合体用ビオチン化プライマーにより、目的のほとんどのサンプルに必要なビオチン部分を比較的容易に結合させることができます。ブロッティング中にサンプルを濃縮し、有害な空気と水の界面から遠ざけることに加えて、1つまたはわずか数個のリジン残基をランダムにビオチン化することで、クライオ電子顕微鏡グリッド上の目的分子の配向範囲を大幅に改善できることが、多くの研究で実証されています11。基礎となるストレプトアビジン結晶からのシグナルは生の画像に存在しますが、結晶からの鋭いブラッグ反射のフーリエフィルタリングを含むデータ処理スキームは、初期のデータ処理中に簡単に除去でき、最終的に目的のサンプルの高解像度再構成が可能になります11,12,13.ここでは、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドの頑健な産生とその後のクライオ電子顕微鏡実験での使用のために、最適化された段階的なプロトコルが提供されています。提供されるプロトコルは、2週間で完了することが期待されています(図1A)。プロトコルの最初の部分では、試薬の調製、グリッドの前処理、および最初の炭素蒸発ステップについて説明します。次に、脂質単分子膜の調製およびEMグリッド上でのストレプトアビジン結晶の成長に関する説明を説明する。さらに、ネガティブ染色EMおよびクライオ電子顕微鏡実験におけるストレプトアビジンアフィニティーグリッドの使用に関する説明書も記載されています。最後に、クライオ電子顕微鏡データを取得したら、顕微鏡写真からストレプトアビジンシグナルを除去する手順を示します。
Protocol
1. 試薬の調製
- 市販のストレプトアビジンを結晶化バッファー(50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、5 mM EDTA、10%トレハロース)で最終濃度0.5 mg/mLに希釈します。最終的なトレハロース濃度が10%であることを確認してください。25〜50μLのアリコートを液体窒素中で急速凍結し、-80°Cで保存します。
- 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)ナトリウム塩を65:35:8 v/v/vクロロホルム/メタノール/水溶媒に溶解し、最終脂質濃度を1 mg/mLにします。20〜30μLの単回使用アリコートを-80°Cでガラスバイアルに保管してください。
注:溶媒の調製は、重量で行うとより正確になります。まず、1.85gの超純水と6.41gの高速液体クロマトグラフィー(HPLC)グレードのメタノールを混ぜ合わせ、これを22.42gのクロロホルムに加えて溶媒を調製します。
注意: このプロトコルを開始する前に、クロロホルムおよびメタノール有機溶剤の取り扱いと廃棄に関するメーカーの安全データシートと推奨手順を読み、理解してください。メタノールが皮膚に直接触れないようにしてください。
2. グリッドの前処理
- 100%クロロホルムに2回、100%エタノールに1回浸して、金メッシュグリッド上のカーボンホイルを洗浄します。グリッドをきれいな濾紙の上に置いて乾かします。洗浄プロセスを合計3サイクル繰り返します。
注:0.6〜2μmの範囲の穴サイズで厚さ10〜12nmのカーボンフィルム(材料リストを参照)を持つ市販のカーボンフォイルグリッドで再現性のある成功が達成されています。市販の金箔グリッドと、ルービンシュタイン研究所のナノファブリケーションプロトコル14 に従って調製された自家製の穴あき炭素グリッドも成功裏に使用されています。炭素膜が薄い市販のグリッドでは、再現性の低い結果が得られています。銅はサンプル中の有機アミンと反応するため、銅グリッドは使用しないでください。 - グリッドが乾いたら、2.5〜5nmの厚さの炭素層を穴のある炭素グリッドの炭素側に蒸発させます。炭素の厚さは、 材料表 ファイルで提供されている炭素蒸発器に組み込まれている水晶の膜厚測定によって制御されます。
- 新しく蒸発した炭素を1週間熟成させる(つまり、疎水性を高める)のを待ちます。
3. ストレプトアビジン格子の調製
注:ホール状炭素EMグリッド上で2Dストレプトアビジン結晶を成長させるには、まず、ビオチン化脂質単層をLangmuir-Schaefer転写により炭素膜の正孔に塗布します(図1B)。脂質単層は、その後の工程に従って形成されます(図2)。タルカムパウダーはヒマシ油とシャーレの間に境界を作り、ヒマシ油の薄い層は、脂質単層が形成されるときに一定の表面圧力を維持するのに役立ちます。ステップ2.2で蒸発した炭素を含む側を使用して単層をピックアップし、余分な脂質を結晶化バッファーで洗い流し、ストレプトアビジン溶液をグリッド上でインキュベートして結晶化します。
- ベンチエリアを70%エタノールで清掃します。
- 5 μLのガラスシリンジをクロロホルムで数回すすぎ、洗浄します。使用前にシリンジを完全に乾かしてください。
- 炭素蒸発したグリッドを、使用直前に100%エタノールに浸して再度洗浄します。グリッドをきれいな濾紙で乾かします。
- グリッドが乾燥している間に、各毛細血管防止ピンセットを100%クロロホルムと100%エタノールで洗います。ピンセットを完全に乾かします。
- パラフィルムの清浄な面で、作製するグリッドごとに50 μLの結晶化バッファー(50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、5 mM EDTA、10%トレハロース)を3滴調製します。
- コーティングされていない35 mmのシャーレの蓋に結晶化緩衝液(50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、5 mM EDTA、10%トレハロース)を入れます。レンズペーパーで表面をきれいにします。
- ペトリ皿の周囲に科学グレードのタルカムパウダーを振りかけます。これは、次のステップで、ヒマシ油がどこまで広がったかを示す指標として機能します。十分なタルカムパウダーを追加して、ヒマシ油がペトリ皿の端に触れないように保護するバリアを作成します。タルカムパウダーを添加しすぎると、脂質単層を作るための利用可能なスペースが制限されます。
- 200 μLのピペットチップをヒマシ油に浸し、ピペットチップからぶら下がる中程度の滴(約20 μL)を得ます。この滴をペトリ皿の緩衝液の表面に触れると、広がりが広がり、均一な膜を形成します。得られた油の薄膜は、脂質単層が形成されるときに一定の表面圧力を維持するピストン15として機能します(ステップ3.10)。
注:ひまし油は少なすぎるのではなく、十分な量を加えることが重要であり、1滴として加えることをお勧めします。脂質単層を作る前に、ひまし油を完全に広げてください。 - 5 μLのガラスシリンジを溶解した脂質で1〜2回すすぎ、アリコートを使用して使用してください。シリンジを満たす脂質に気泡を作らないでください。.
注意: ガラスシリンジは、ステップ3.2から残留クロロホルムが残っている場合に備えて、溶解した脂質ですすいでください。残留クロロホルムは、得られる単層の品質に影響を与える可能性があります。 - シリンジから可能な限り最小の容量(~0.5 μL)の脂質を分注し、ぶら下がっている液滴をヒマシ油膜の表面にそっと触れます。.なお、脂質溶液は接触点でヒマシ油膜を突き破り、得られた脂質単層はヒマシ油の薄膜の中心に円を形成する。
- 脂質を数滴順に加えるか、グリッドを作成した後に脂質を追加しますが、添加しすぎると、脂質はヒマシ油の境界を越えて、タルカムパウダーと汚染された界面活性剤が隔離された周囲に広がります。これが発生した場合は、プロセスを再起動する必要があります。
- 毛細管現象防止ピンセットでグリッドをピックアップし、ピンセットのまっすぐなアームとグリッドの炭素蒸発側の両方が単層に面するようにします。
- グリッドの炭素蒸発面を単層に1〜2秒間接触させることにより、単層の一部を穴の開いた炭素に転写します。
注:転送が成功すると、グリッドの表面が親水性になり、ペトリ皿から持ち上げられた後、薄い球形のバッファーキャップがグリッド全体を覆うようになります。 - グリッドに接着したバッファーの球状キャップを、ステップ3.5でパラフィルム上に調製した3つの50 μL滴の結晶化バッファーに、それぞれ1秒間連続して接触させます。
注:このステップでは、サンプルを電子顕微鏡で観察したときに脂質小胞の形成を避けるために、球状キャップの表面(以前の疎水性炭素膜ではなく)を覆う余分な脂質を可能な限り除去しようとします。 - 4 μL の 0.5 mg/mL ストレプトアビジンを、グリッド上の結晶化バッファーの残りの球状キャップに慎重に添加します。
- グリッドを湿度チャンバーに入れます。手順 3.11 から 3.14 をグリッドのバッチ全体に対して繰り返します。
- 蒸発を防ぐために、グリッドを室温(RT)で湿度チャンバー内で2時間インキュベートします。
注意: グリッドの金面は、単層を適用した後、どの時点でも濡れないことが重要です。 - 2時間のインキュベーション後、パラフィルムの清浄な面のグリッドごとに、300 μLのリンスバッファー(10 mM HEPES、pH 7.5、50 mM KCl、5 mM EDTA、10%トレハロース)を1滴調製します。
注:リンスバッファーには、ステップ3.5〜3.6で使用した結晶化バッファーに含まれる150 mM KClではなく、50 mM KClが含まれています。 - 過剰な(結合していない)ストレプトアビジンを、300 μL滴のリンスバッファーの上にグリッドを置いて洗浄します。手順 3.18 から 3.20 を一度に 1 つのグリッドに対して実行します。グリッドを300 μLのリンスバッファードロップに長時間放置することは避けてください。
注:この時点ではストレプトアビジン結晶/単層が壊れやすいため、洗浄は1回のみ行われます。グリッドが洗浄バッファーの滴の表面から持ち上げられるたびに、グリッドと洗浄液滴の間の液体ブリッジが破裂します。破断時には、炭素膜の開孔に広がる自立した単層結晶に過渡的な圧力勾配(吸引圧力)が加わります。この吸引圧力により、単層結晶の過渡的なドーム化が起こり、結晶が被覆する面積が拡大することが予想されます。面積の増加が結晶の弾性限界を超えると、結晶が破損したり乱れたりすることがあります。 - 糸くずの出ないワイプですぐに毛細管防止ピンセットを乾かし、次の手順でグリッドをろ紙に解放しやすくします。抗毛細管ピンセットのよじれたアームを滴に突き刺して、すすぎ緩衝液の滴に浮かんでいるグリッドを拾います。
- 余分な緩衝液をろ紙で側面からやさしく拭き取ります。金面を下にしてグリッドをろ紙の上に置き、グリッドごとに手順3.18〜3.20を繰り返し、グリッドを15〜20分間乾かします。
- グリッドが乾いたら、金色の面が上を向くように裏返します。炭素の薄い層(厚さ約0.5〜2 nm)をグリッドの金面に蒸発させます。
注:グリッドは一定の湿度で保管し、その値は重要ではないようですが、相対湿度の複数の変化により、膨張と収縮のサイクルが発生することが予想されることに注意してください。グリッドの裏面の疎水性は単層の安定性にとって重要である可能性があるため、最良の結果を得るには、クライオ電子顕微鏡を使用する前にグリッドを1週間熟成させます。グリッドは長期間安定していますが、3か月後には裏面の炭素の疎水性が低下する可能性があります。
4.ネガティブステインによるストレプトアビジンアフィニティーグリッドバッチ品質の確認
- パラフィルムの清浄な面に、50 μLの2滴と100 μLのサンプルバッファー(50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP)を1滴調製します。
- トレハロースを除去し、ストレプトアビジングリッドを 2 つの 50 μL 滴に触れて再水和し、グリッドを 100 μL 滴のサンプルバッファーに 10 分間浮かせます。
注:再水和およびその後のサンプル結合インキュベーション中は、界面活性剤の使用を避けるのが最善です。緩衝液はグリッドの金面に分散し、余分なサンプルを除去するための洗浄の効率を制限します。 - 水分補給後、毛細血管防止ピンセットでグリッドを持ち上げて、抗毛細血管ピンセットのよじれた腕がドロップに入るようにします。
- 余分なバッファーを側面から静かに吸い取り、4 μLの75-100 nMサンプル(オプション)をすばやく再適用します。
注意: 水分補給後はグリッドを乾かさないでください。 - サンプルを湿度チャンバーで1〜5分間インキュベートします。
注:濃度とインキュベーション時間はサンプルに依存するため、最適化する必要があります。提供されたサンプル濃度とインキュベーション時間は、推奨される開始点です。 - パラフィルムのクリーンな面に、サンプルバッファーと1%ギ酸ウラニル(UF)染色剤をそれぞれ30 μLずつ4滴垂らします。
注意: この手順を実行する前に、ギ酸ウラニルの取り扱いと廃棄に関するメーカーの安全データシートと推奨手順を読んで理解してください。ギ酸ウラニルは有毒で放射性化合物です。放射性物質の使用については、必ず事前に機関の許可を得てください。 - 4滴のサンプルバッファーのそれぞれに触れて、結合していないサンプルを洗い流します。
- UFによる標準的なネガティブ染色法を用いてサンプルを染色します。側面からUFの汚れをそっと拭き取り、グリッドに非常に厚い汚れの層を残します。ブロッティング後にさらに0.5 μLの染色剤をグリッドに塗布し、必要に応じて染色剤を厚くすることができます。グリッドを風乾させます。
注:ストレプトアビジングリッドは非常に親水性であるため、ネガティブ染色は、グロー放電処理された連続カーボングリッドを使用する場合に一般的に見られるものとは対照的に、どこにでも非常に均一な膜を形成する傾向があります。そのため、ステイン液の膜を厚く残すことをお勧めします。
5. ビオチン化サンプルによるストレプトアビジンアフィニティーグリッドの凍結
注:次の手順は、ブロッティングセンサーを内蔵した片面自動プランジャーを対象としています(他の自動プランジ装置での片側手動ブロッティングも可能です)
- パラフィルムの清浄な面に、50 μLを2滴、100 μLを1滴のサンプルバッファー(例:50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP)を調製します。
- ストレプトアビジンのグリッドを 2 つの 50 μL 滴に触れて再水和し、グリッドを 100 μL 滴のサンプルバッファーに 10 分間浮かせます。
- 水分補給後、毛細血管防止ピンセットでグリッドを持ち上げて、抗毛細血管ピンセットのよじれた腕がドロップに入るようにします。
- 余分なバッファーを側面から静かに吸い取り、4 μLの75-100 nMサンプルをすばやく適用します。
- サンプルを湿度チャンバーで1〜5分間インキュベートします。
注:繰り返しになりますが、濃度とインキュベーション時間はサンプルに依存するため、最適化する必要があります。提供されたサンプル濃度とインキュベーション時間は、推奨される開始点です。低濃度のサンプルの場合、より長い期間インキュベートしたり、サンプルをグリッドに数回結合させたりすることができます。 - パラフィルムの清浄な面に、10 μLの凍結緩衝液(例:50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP、3%トレハロース、0.01% NP40)を2滴調製します。インキュベーション後、凍結バッファーの最初の滴にグリッドを接触させて、結合していないサンプルを洗浄します。グリッドを凍結バッファーの 2 番目のドロップにドロップします。
- 片側自動プランジャーに取り付けられたピンセットでグリッドの端をすばやくつかみます。余分なバッファーを穏やかに吸い取り、4 μLの凍結バッファー(50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP、3%トレハロース、0.01% NP40)をグリッドにすばやく適用します。
- 片側自動プランジャーにピンセットを取り付けます。最良の結果は、4〜6秒のブロット時間でグリッド上の液滴を検出するブロットセンサーを使用して得られました。使用するサンプルや緩衝液によって条件が異なります。
6. ストレプトアビジンアフィニティーグリッドから収集したクライオ電子顕微鏡動画のデータ処理
ストレプトアビジンアフィニティーグリッドのデータ収集は、標準的なグリッドと同様に行うことができ、特別な顕微鏡調整は必要ありません。しかしながら、ここで詳述する手順は、顕微鏡写真の動きを補正した後にのみストレプトアビジンシグナルを除去する。そのため、元のムービーフレームに依存する粒子研磨などのデータ処理工程を確実に行うことができない。ストレプトアビジンシグナルの減算 (CTF 推定を除くすべての標準ダウンストリーム処理に必要) には、Linux 環境で実行されている Matlab バージョン R2014b 以降が必要です。シグナルの減算は、ストレプトアビジン層の結晶性に依存しているため、ピークマスキングが可能になり、各顕微鏡写真のフーリエ変換からシグナルを除去することができます。
- 処理スクリプトのセットアップ
- 補足ファイルからプロジェクトディレクトリ内の専用フォルダにすべてのファイルをコピーします
- 次のファイルを含む processing_scripts というディレクトリを準備します。
lsub.m (Supplemental Coding File 1、減算スクリプト)
process_subtration.sh (Supplemental Coding File 2; 利用可能なすべての顕微鏡写真をループ処理し、並列ジョブを生成し、入力と出力を追跡するラッパースクリプト)
process_subtraction.cfg (補足コーディングファイル 3、減算ジョブのパラメータを含む設定ファイル、6.2 を参照) - 次のファイルを含む support_scripts というディレクトリを準備します。
bg_drill_hole.m (補足コーディング ファイル 4)
bg_FastSubtract_standard.m (補足コーディングファイル 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (補足コーディング・ファイル 6)
bg_push_by_rot.m (補足コーディング・ファイル7)
ReadMRC.m (補足コーディング・ファイル 8)
WriteMRC.m (補足コーディング・ファイル 9)
WriteMRCHeader.m (補足コーディング ファイル 10)
- 必要に応じて、構成ファイル(process_subtraction.cfg( 図3を参照))を調整します。
- 入力: mrc形式のモーション補正顕微鏡写真を含むディレクトリへのパス。ディレクトリまたはワイルドカード (?、*) を含むパターンを使用します。
例：
input="/path/to/project_directory/micrographs/"
又は
input="/path/to/project_directory/micrographs/*.mrc" - output_dir: 格子を差し引いた顕微鏡写真を書き込むディレクトリへのパス。
- only_do_unfinished: 既存の減算顕微鏡写真を上書きまたはスキップする場合は、(true|false)を指定します。このパラメータは、顕微鏡セッションの途中で格子減算スクリプトを開始するのに便利です(デフォルト: true)。
- num_parallel_jobs: 並列ジョブの数を指定します。この数は、処理に使用されるハードウェアの仕様によって異なり、使用可能なコアの数を超えてはなりません。32 コアとネットワークファイルシステムを持つシステムでは、14 個の並列ジョブで最適なパフォーマンスが達成されました。最高のパフォーマンスを得るには、顕微鏡写真のサブセットを使用してこの値を最適化します。
- Pad_Origin_X:縦向き(画像幅<画像高さ)のK3検出器、または正方形検出器(Falcon III、Falcon IV、K2)を使用する場合は200、横向き(画像の幅>画像の高さ)のK3検出器の場合は1000。FFTは正方形のボックスで実行され、検出器の寸法が正方形でない場合はパディングが必要です。
- Pad_Origin_Y:縦向きのK3検出器(画像の幅<画像の高さ)の場合は1000、正方形の検出器(Falcon III、Falcon IV、K2)を使用する場合、またはK3検出器を横向き(画像の幅>画像の高さ)で使用する場合は200。
- Inside_Radius_Ang (90) と Outside_Radius_Ang (3.0) は変更しないでください。格子減算は、2つの解像度(単位はオングストローム)の間で実行されます。
- Pixel_Ang: ピクセル サイズを浮動小数点値として指定します。
- 閾値: フーリエ空間の背景で格子を置き換える減算閾値のカットオフ値。正常に使用される値は 1.4 から 1.6 の間です。開始点として 1.42 を使用します。
- expand_pixel (10) と pad_out_opt (0) は変更しないでください。expand_pixelは、しきい値のカットオフよりも高い値を持つピクセルの周囲をマスクするために使用される直径の値です。pad_out_opt は、パディングされた領域を出力に含めるかどうかを決定するオプションです。
- addpath_m: サポート スクリプトへのパス。
- path_to_matlab_bin: システムの Matlab インストール bin ディレクトリへのパス。
- path_matlab_script: 上記の手順 6.1.2 でコピーした MATLAB 減算スクリプト (lsub.m) へのパス。
- 入力: mrc形式のモーション補正顕微鏡写真を含むディレクトリへのパス。ディレクトリまたはワイルドカード (?、*) を含むパターンを使用します。
- 変更したスクリプトを保存した後、スクリプト(bash ./process_subtraction.sh )を実行して、入力顕微鏡写真からストレプトアビジンシグナルを差し引きます。パラメータonly_do_unfinishedがtrueに設定されている場合、スクリプトを中断または再起動できます(ステップ6.2.3を参照)。エラーが発生した場合は、bash スクリプトで指定されているパラメーターを確認します。パラメーター変数とそれに割り当てられた値の間に意図しないスペースがないことを確認してください (これは間違いの一般的な原因であるため)。
- 格子減算された画像を標準的なクライオ電子顕微鏡画像処理に使用します。
Representative Results
ステップ 3.21 の炭素蒸発後(通常は 1 週間後)、ステップ 4 および 5 で説明した手順に従って、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドをクライオ電子顕微鏡またはネガティブ染色サンプル調製に使用できます。 図 4A は、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドで凍結したビオチン化サンプルを、拡大率 81,000 倍、ピクセルサイズ 1.05 Å の titan Krios の K3 検出器で撮影した代表的な顕微鏡写真です。格子形成の成功は、画像の背景に現れる連続したグリッドパターンによって観察されます。これは、 図4A (右)に示す高速フーリエ変換(FFT)に現れる回折パターンによってより簡単に観察できます。データ収集後、本プロトコルのステップ6で概説した手順に従って、ストレプトアビジン格子によって画像に寄与するシグナルを計算的にマスクして、後続のデータ処理ステップに用いることができる減算顕微鏡写真(図4B)を生成することができる。 図4B (右)のFFTは、 図4A (右)で観察された回折パターンが元の画像から正常に除去されたことを示しています。
図4C は、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドに結合し、ギ酸ウラニルでネガティブ染色したビオチン化サンプルを、ピクセルサイズ1.6 ÅのTecnai 12顕微鏡で倍率49,000倍で撮影した顕微鏡写真の例を示しています。グリッドは、このプロトコルのステップ4で概説された手順に従って準備され、より厚い染色の膜が残りました。
ストレプトアビジングリッド作製手順が失敗した場合の一般的な観察結果がいくつかありますが、これらについては、考察のセクションおよび表1で詳しく説明します 。 図5 は、これらの観察結果の例をいくつか示しています。 図5A は、6ヶ月以上経過したバッチから使用したネガティブ染色のストレプトアビジンアフィニティーグリッドの顕微鏡写真を示しています。単層は、量子箔グリッドの炭素箔の穴から動員され、グリッドの穴と同様の寸法で観察されます。 図5B は、高いモザイク性を有するストレプトアビジン結晶の例を示しており、サンプル調製手順中に容易に摂動されます。 図5C は、ステップ3.21の炭素蒸発が薄すぎるか省略されているストレプトアビジンアフィニティーグリッドの代表的な顕微鏡写真を示しています。ストレプトアビジン格子は、クライオ電子顕微鏡サンプル調製プロセス中に断片化しています。 図5D は、脂質小胞による汚染がある陰性染色のストレプトアビジンアフィニティーグリッドを示していますが、これはおそらく、ステップ3.13で洗浄が不十分であったか、ステップ3.13-3.20でグリッドの金側が濡れたことが原因です。これらの一般的な問題を克服するための戦略については、ディスカッションセクションと 表1 を参照してください。
図1:ストレプトアビジンアフィニティーグリッド作製手順の概略図。 (A)ストレプトアビジンアフィニティーグリッド作製手順の概要タイムライン。手順全体は2週間で完了でき、2つの炭素蒸発ステップと、炭素が十分に熟成するまでの各ステップの後に1週間が必要です。(B)ストレプトアビジンアフィニティーグリッドのグリッド正方形を拡大し、金の延べ棒と穴の開いた炭素膜を備えた標準的なクライオ電子顕微鏡グリッド、第1蒸発炭素層、脂質単分子層、2D-ストレプトアビジン結晶、裏面蒸着炭素支持層など、製造プロセス完了後にグリッドを構成する層を示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:脂質単分子膜とストレプトアビジンの結晶化(A) タルカムパウダーを利用してヒマシ油の境界を作り、脂質単分子層を形成しながら一定の表面圧を生み出す小さなペトリ皿内で脂質単層をうまく形成する方法を示す画像。(B)ストレプトアビジン結晶をクライオ電子顕微鏡グリッド上に成長させる方法を示す画像。まず、グリッドの炭素側を脂質単層に接触させ、続いて結晶化バッファーで3回連続して洗浄します。ストレプトアビジンを添加し、グリッドを加湿チャンバー内で2時間インキュベートします。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:顕微鏡写真からストレプトアビジン格子減算を行うためのprocess_subtraction.cfgファイルのパラメータ例(ステップ6)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:ストレプトアビジンアフィニティーグリッド作製の成功例。 (A)自家製ストレプトアビジンアフィニティーグリッドで調製したビオチン化タンパク質/ヌクレオソーム複合体のクライオ電子顕微鏡写真。FFTは右に示されており、ストレプトアビジン結晶の回折パターンを示しています。(B)パネルAと同じ顕微鏡写真を、元の画像から2Dストレプトアビジン結晶からのシグナルを除去するための格子減算手順に続いて示している。(C)ストレプトアビジン親和性グリッドに結合したビオチン化サンプルのネガティブ染色から得られた顕微鏡写真の例。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:ストレプトアビジンアフィニティーグリッド作製に失敗した代表的な結果。 (A)グリッドが6ヶ月以上経過している場合のグリッドホールからのストレプトアビジン単分子膜の動員を示す顕微鏡写真。(B)クライオ電子顕微鏡とネガティブ染色の両方のサンプル調製手順で損傷しやすい高いモザイク性を持つストレプトアビジン格子を示す顕微鏡写真。(C)ステップ3.21の炭素蒸着層が薄すぎるか省略されている場合のクライオ電子顕微鏡試料調製中のストレプトアビジン格子のフラグメンテーションを示す顕微鏡写真。(D)ステップ3.13の洗浄が不十分であるか、ステップ3.13-3.20でグリッドの金面が濡れたことが原因である可能性が高い脂質小胞で汚染された代表的な顕微鏡写真。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:ストレプトアビジンアフィニティーグリッド作製に失敗した際に遭遇する一般的な課題を克服するためのトラブルシューティングガイド。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
当社のプロトコールでは、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドの作成方法と使用方法、およびストレプトアビジン回折シグナルを含むデータの処理方法を説明しています。プロトコルには、特別な注意が必要ないくつかの重要なステップがあります。
グリッドバッチの失敗は、いくつかの一般的なエラーにまでさかのぼることができます。エラーの最も一般的な原因は、古い試薬や低品質の試薬を使用することです。ビオチン化脂質溶液は、プロトコールに記載されているとおりに調製することが特に重要です。さらに、実験器具の界面活性剤の残留物や皮膚に自然に存在する油分などの不純物は、ストレプトアビジン結晶の品質、ひいては得られる画像の品質に影響を与える可能性があります。したがって、最初の炭素蒸発の前にグリッドの洗浄サイクルを3回実行して、グリッドメーカーから界面活性剤汚染の可能性を除去することをお勧めします(ステップ2.1)。さらに、ひまし油の汚染または不純物は、グリッド上の結晶形成を妨げることが観察されています。
脂質単層を作って拾う作業は、少量の脂質の感触をつかむために数回練習する必要がある作業です。ネガティブ染色されたグリッドに見られるストレプトアビジン結晶の品質に最終的に反映されるように、適切な脂質単分子膜が生成される前に、このステップが最初の2〜3回失敗することは珍しくありません(図4C)。
グリッド製造プロセス(ステップ3.12-3.20)中にグリッドの裏側(金側、脂質側)を濡らさないことが重要です。裏面が濡れた場合は、グリッドを廃棄することをお勧めします。これにより、画質を損なう大きな脂質小胞が出現する可能性があります(図5D)( 表1の行3)。脂質単層を塗布した後の洗浄が不十分なために、脂質小胞が観察されることもあります(ステップ3.13)。ストレプトアビジンを添加する前に、脂質単層に触れた後、結晶化緩衝液を使用したその後の3回の洗浄が推奨されます。
炭素の薄い層がトレハロース包埋グリッド上に蒸発した後、格子品質を損なうことなくグリッドの裏側を濡らすことができます。例えば、サンプルバッファーに最小限の界面活性剤が含まれている場合でも、裏面の濡れが頻繁に観察されます。サンプルによる裏面の湿潤化は、サンプルが裏面の薄い炭素膜に非特異的に結合する可能性があり、粒子が空気と水の界面に拡散するのを防ぐ効果や、オングリッド精製戦略のためのアフィニティー結合の使用の有効性を低下させます。可能であれば、界面活性剤なしでサンプルをグリッドに追加します。洗剤やその他の添加剤は、グリッド洗浄ステップ中に後で追加することも、ガラス化前の最終ステップで追加することもできます。これは、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドの使用に対する1つの制限です。ただし、優先配向を改善することが目的である場合、界面活性剤を含むバッファーを使用したサンプル前処理は正常に実行されています11。
エラーの一般的な原因は、両方の炭素蒸発ステップ(ステップ2.3とステップ3.21)に対するグリッドの年齢にまでさかのぼることができます。このプロトコルでは、クライオ電子顕微鏡にストレプトアビジングリッドを使用する前に、裏面炭素蒸発後5〜7日間の待機期間が推奨されています。製造後すぐにグリッドを使用すると、格子と脂質単層がグリッドの穴から移動することが観察されています。グリッドが古すぎて6か月後に使用した場合も、同様の観察を行うことができます(図5A)(表1の行1)。この観察は、脂質単層とストレプトアビジン結晶を安定化させるために適用される炭素バッキングの疎水性の変化によって説明されるという仮説を立てています。さらに、ストレプトアビジン格子は、第1の炭素蒸発層(ステップ2.3)が十分に経年変化していないグリッドに単層を適用すると、モザイク状(図5B)(表1の行3)に現れ、ネガティブ染色とクライオ電子顕微鏡の両方で壊れることがあります。
その他の一般的なエラーの原因は、ストレプトアビジン結晶性単層の脆弱性に起因します(脂質単分子膜自体が流動的であり、可逆的に膨張または圧縮する可能性があります)。裏面炭素蒸着(ステップ3.21)は、サンプルの吸着、洗浄、クライオ電子顕微鏡ブロッティングプロセスにおいて、単層とストレプトアビジン格子の両方に重要な安定性をもたらします。グリッドの裏側への炭素蒸発が十分でない場合、ブロッティング/凍結後にストレプトアビジン格子が断片化しているように見えることがよくあります(図5C)( 表1の行2)。このプロトコルでは、片面ブロッティングに片面自動プランジフリーザーの使用を提案します。この方法により、凍結プロセス中にストレプトアビジン格子が保持され、サンプルアプリケーションとブロッティングパラメーターの合理化された最適化を可能にする、再現性の高いブロッティング条件が得られます。或いは、他の自動プランジ凍結装置が手動ブロッティングと組み合わせて使用されている。これを行うには、デバイスの設定で実際のブロッティング機能を無効にし、代わりに、吸い取り紙を保持したピンセットをサイドエントリに通してグリッドをブロットします。この方法は、片面ブロッティングおよびプランジ凍結装置なしでラボで高品質の結果を達成できます。ただし、グリッド間の再現性は困難です。
ストレプトアビジンアフィニティーグリッドの使用には多くの利点がありますが、この方法にはいくつかの制限を考慮する必要があります。手順の性質上、通常、プロセス全体が完了するまでストレプトアビジン格子の品質を評価することはできません。サンプルを凍結する前に、ネガティブ染色によって各バッチの品質をすばやくスクリーニングすることをお勧めします。ストレプトアビジン格子が生の画像に寄与するシグナルのため、画像のみから十分な数の無傷の分散粒子があるかどうかを評価することが困難な場合があります。同じ理由で、データ取得中のクライオ電子顕微鏡データのオンザフライ処理は、ストレプトアビジンシグナルの減算手順がデータ前処理パイプラインに含まれていない限り不可能です。ストレプトアビジンシグナルは通常、フレーム自体ではなく、動き補正された画像から差し引かれるため、一般的なソフトウェアスイートで実装されているベイジアン研磨は、説明されている減算手順を使用すると失敗する可能性があります。それゆえ、データ処理の開始から粒子の動きを最小化するために、複数のパッチでモーション補正を行うことが推奨される16。
これらの制限にもかかわらず、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドには多くの利点があります。ストレプトアビジンアフィニティーグリッドが標準的なオープンホールクライオ電子顕微鏡グリッドよりも優れている2つの主な利点は、サンプルを空気と水の界面から保護し、グリッド上に低存在量(10-100 nM)のサンプルを濃縮する手段です。炭素や酸化グラフェンなどの他の支持層も、これらのサンプル調製のボトルネックを克服するための戦略として使用できます。一例では、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドは、架橋アプローチと互換性のないタンパク質-核酸相互作用の無傷の再構築を得るための唯一のソリューションでした。12名
ストレプトアビジンアフィニティーグリッドがもたらすもう一つの大きな利点は、炭素や酸化グラフェンなど、他の支持層に吸着し、目的のサンプルの3D再構成を得る能力を妨げる好ましい配向を持つサンプルに対するソリューションです。市販のキットを用いたサンプルのランダムビオチン化により、目的のサンプルをストレプトアビジン単分子膜にランダムに結合させることで、この課題を克服するためのより多くの潜在的な見解を得ることができます。
さらに、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドには、アフィニティーベースのグリッドに特有の利点があります。ストレプトアビジン-ビオチン相互作用の高い親和性と特異性により、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドと、ビオチンが関与する他のワークフローを結合して目的の複合体を精製することができます。発表された1つの例では、ストレプトアビジン親和性グリッド上の複合体を固定化し、未知の化学量論の結合パートナーを大量にインキュベートしました。結合していないタンパク質を洗い流した後、正しく組み立てられたスーパー複合体が得られ、クライオ電子顕微鏡11 ですぐに分析することができました。将来的には、ストレプトアビジン結合タンパク質タグ、Aviタグシステム、または近接標識アプローチをストレプトアビジンアフィニティーグリッドと組み合わせて、標準的な精巧な精製スキームを使用せずに、組換え体または内因性の供給源から直接単一のタンパク質および/またはタンパク質複合体を抽出することが考えられます。
このプロトコールを提供することで、ラボはストレプトアビジンアフィニティーグリッドの作製を容易に再現し、クライオ電子顕微鏡によるタンパク質複合体の構造解析に一般的に使用されるツールとして確立できるはずです。
Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
T.C.は、米国国立総合医学研究所の分子生物物理学研修助成金GM-08295および米国国立科学財団大学院研究フェローシップ(助成金番号DGE 2146752)の支援を受けました。R.G.とB.H.は、R.G.とB.H.に授与された国立衛生研究所の助成金R21-GM135666の支援を受けました。この研究は、E.N.E.N.に授与された国立総合医学研究所の助成金R35-GM127018によって部分的に資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
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