Summary
이 프로토콜은 마우스 orthotopic 간 이식에서 커프 기술을 사용하여 혈관 재건을 위한 기술 정보를 제공합니다.
Abstract
마우스 orthotopic 간 이식은 간 허혈 및 재관류 손상의 근본적인 메커니즘을 조사하기 위한 효과적인 방법론입니다. 그러나 기술적 과제는 이 귀중한 실험 모델을 활용하고 이러한 기술을 다음 세대에 전달하는 데 장벽이 됩니다. 이 절차에서 가장 어려운 측면은 문맥(PV), 하대정맥(IHIVC) 및 상하정맥을 포함한 혈관 재건입니다. 봉합사 대신 플라스틱 커프를 사용하면 PV 및 IHIVC 재구성을 보다 원활하게 할 수 있습니다. 혈관은 정맥 카테터로 만든 커프를 이식 혈관의 끝에 부착하고 커프를 수용 혈관에 삽입하여 재건합니다. 가장 중요한 두 가지 측면은 혈관의 내부 내강을 적절하게 시각화하고 과도한 힘을 가하지 않는 것입니다. 우리의 목표는 수혜자 수술에서 커프 기술을 사용하여 혈관 재건에 대한 기술적 개요를 제공하는 것입니다. 커프 기술에 대한 이러한 기술 팁은 미세 외과 의사가 혈관 재건을 촉진하고 연구를 발전시키는 데 도움이 될 것으로 기대됩니다.
Introduction
생쥐 기형간 이식(MOLT)은 1991년에 처음 보고된 효과적인 실험 방법입니다1. 유전자 변형 마우스와 다양한 연구 시약을 활용한 이 실험 모델은 온열 및 냉간 허혈 및 재관류 손상을 조사하는 데 중추적인 역할을 했습니다. 그러나 이 모델의 높은 기술적 복잡성은 간 이식을 위한 기초 의학의 개발을 저해하고 있다2. MOLT는 (1) 기증 마우스에서 간을 채취하고, (2) 백테이블 수술, (3) 수혜자에게 간을 이식하는 세 가지 주요 단계를 포함합니다. 이러한 수혜자 시술 중 혈관 문합술이 가장 큰 도전입니다. 상하정맥 문합술은 일반적으로 수작업스티칭 2으로 완료되지만, IHIVC(infrahepatic inferior vena cava) 및 문맥(PV)은 손으로 꿰매는 봉합사 대신 플라스틱 커프를 사용하여 보다 효율적으로 재건할 수 있습니다.
무간주기는 수혜자의 본래 간이 제거된 시점과 이식편 이식 사이의 간격을 의미합니다. 일관된 결과를 보장하려면 무간 시간을 20분 미만으로 제한하는 것이 필수적입니다. 결과적으로, 이 모델을 채택한 연구는 특정 기관에 국한되어 있었다 3,4,5,6,7,8,9. MOLT의 다양한 단계 중에서 원활한 PV 및 IHIVC 재건을 달성하는 것은 무간 시간을 최소화하고 성공적인 이식을 보장하는 데 매우 중요합니다.
PV 및 IVC 재건술은 일반적으로 혈관 커프를 사용하여 수행되는데, 이는 커프 기술이 손으로 꿰매는 봉합사 2,5,8에 비해 혈관 문합을 단순화하기 때문입니다. 혈관 커프 준비 및 커프의 안전한 부착과 관련된 기술은 수혜자 혈관 재건의 복잡성에 상당한 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 커프 방법과 관련된 수많은 기술 팁에 대한 자세한 시각적 지침을 제공하여 학습 곡선을 줄이는 것입니다. 이 비디오 클립은 이식자 수술 중 커프를 혈관에 부착하고 PV 및 IHIVC를 재구성하는 방법에 대한 명확한 이해를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
실험 프로토콜은 교토 대학의 동물 실험 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구는 10주 이상 숙성되고 무게가 25g에서 30g 사이인 C57BL/6 마우스를 사용했으며, 상업용 출처에서 얻었습니다( 재료 표 참조). 모든 동물은 2.5% 이소플루란(기관에서 승인된 프로토콜에 따름)으로 마취하고, 특정 병원체가 없는 조건에서 유지하고, 모든 실험 절차는 교토 대학의 동물 실험에 관한 규정에 따라 수행되었습니다. 연구에 사용되는 적절한 도구는 재료 표 에 나열되어 있으며 그림 1 및 그림 2에 나와 있습니다.
1. 동물 선택
- 체중이 25-30g인 마우스를 사용하십시오.
참고: mouse liver allografts2 는 일반적으로 주요 조직적합성 복합체 장벽에서 받아들여지지만, 본 연구에서는 냉간허혈 재관류 손상의 상세한 메커니즘에 초점을 맞추기 위해 syngeneic MOLT 모델을 선택했다10. 무게가 25g 미만인 마우스는 얇은 담관에 내부 스텐트를 삽입하는 것이 불가능하기 때문에 권장하지 않습니다. 마찬가지로, 체중이 30g 이상인 쥐는 혈관 주변에 많은 양의 복강 내 지방이 존재하기 때문에 권장되지 않습니다.
2. 커프 제작
- PV 및 IHIVC를 위해 각각 20G 및 16G 정맥 카테터를 준비합니다.
- 메스를 사용하여 카테터를 절단하여 커프를 만듭니다. 커프 본체의 길이는 2mm이고 확장 핸들은 1mm여야 합니다(그림 3A).
알림: 손잡이가 너무 크면 커프를 삽입하기 어려울 수 있습니다. - 커프의 표면에 메스 블레이드의 뒷면을 사용하여 실 고정을 위한 얕은 홈을 만듭니다.
알림: 메스 칼날의 뒷면을 커프에 적용할 때 칼날 끝이 약 60도 각도에 있는지 확인하십시오( 그림 3B 참조). 첫 번째 홈을 만든 후 메스 블레이드를 고정하고 커프를 회전시킵니다. 이상적으로는 두 개의 홈이 권장되지만 문제 없이 단일 홈으로 충분할 수 있습니다.
3. 커프 부착
- 직사각형 플라스틱 용기에 작은 얼음 조각을 넣고 그 위에 작은 금속 컵(지름 6cm)을 놓습니다. 컵에 장기 보존 액체를 채우고( 재료 표 참조) 그 안에 합성 이식편을 놓습니다.
- 면봉을 사용하여 합성 간 이식편(다른 기증자 마우스에서 추출)을 부드럽게 굴려 간장이 위쪽을 향하도록 합니다. 장기 보존액으로 IVC의 내강에 저장된 혈액을 철저히 제거합니다.
- 예를 들어 비장 정맥에 부착된 실을 사용하여 커프를 통해 PV를 끼웁니다( 그림 4A 참조).
- 커프 핸들이 12시 위치에 있는 상태에서 핸들과 커프를 모두 불독 cl로 고정합니다.amp ( 재료 표 참조), PV 가장자리에서 2-3mm 위치에 위치합니다.
- 불독 cl을 고정amp 큰 혈관 집게와 고정 금형을 사용하여 작동 필드를 설정합니다( 그림 4B 참조).
- 약 15-20x 배율로 PV 루멘을 주의 깊게 검사합니다. 필요한 경우 물방울을 떨어뜨리면 루멘의 가시성을 높일 수 있습니다.
- PV 루멘을 부드럽게 잡고 커프를 통해 외부화합니다.
- 완전히 외부화되면 8-0을 사용하여 이중 결찰로 고정합니다. 커프의 홈을 따라 실크 실(그림 4C,D).
알림: 합자가 느슨하지 않은지 확인하십시오. 또한 합자 점이 너무 크지 않도록 주의하십시오. 커프 삽입을 방해할 수 있습니다. 합자 점은 어느 방향으로나 배치할 수 있습니다. - PV에 사용된 것과 유사한 절차를 사용하여 커프를 IHIVC에 부착합니다(그림 4E).
알림: 클립을 할 때amp커프로 IHIVC를 끼우면 간 실질에 물지 마십시오. 넥이 PV보다 짧기 때문에 클램핑 위치를 신중하게 결정하십시오. - IHIVC를 임시로 결찰하기 위해 IHIVC 바닥 주위에 실을 통과시켜 슬립매듭을 만듭니다(그림 5). 이 실은 재관류 후에 제거됩니다.
4. 문맥 재건
- 게재문헌2에 기술된 바와 같이 이소플루란 2.5%로 마취를 유도하여 수용 마우스를 마취하고 0.6%로 줄인 후 본래의 간을 추출한다. Dins는 개복술 전에 요오드와 70% 에탄올을 번갈아 가며 수술 부위를 최소 3회 감염시킵니다.
- 간엽이 올바른 위치에 있고 커프가 있는 PV에 꼬임과 비틀림이 없는지 확인하십시오.
- Pean 집게를 사용하여 수혜자의 PV 가장자리를 부드럽게 잡고 바이스로 고정합니다.
알림: 이 기사에서 바이스는 테이블에 Pean 집게를 고정하는 데 사용되는 기계 장치를 나타냅니다. 바이스에 대한 자세한 내용은 재료 테이블을 참조하십시오. - 혈관 클램프를 수혜자의 PV에 적용하고 8-0을 전달합니다. 그 주위에 실크 실.
- PV 가장자리에서 약 0.5mm 떨어진 곳에 1/4 원주 단면을 만듭니다(그림 6A). 특수 기구(끝이 잘리고 L자 모양으로 구부러진 27G 바늘)를 사용하여 내강을 통해 식염수를 통과시키면서 구멍을 확대합니다.
- 직선 집게를 사용하여 커프 손잡이를 잡고 내강에 삽입합니다.
- 완전히 삽입되면 커프를 8-0으로 고정합니다. 비단실. 단일 결찰로 고정에 충분합니다.
- 혈관 클램프를 제거하고 간을 재관류합니다.
- Pean 집게를 조심스럽게 풀어주고 문맥 재건을 완료합니다. 전체 PV 재구성 프로세스는 약 5분 정도 소요됩니다.
5. Infrahepatic 하대정맥 재건술
- 간엽을 적절하게 배치하고 수혜자 IHIVC 등쪽에 부착된 Pean 겸자를 이식편의 오른쪽 하엽으로 이동하여 바이스로 고정합니다.
- 면봉으로 부드럽게 문질러 수혜자의 IVIHC 주변에 남아 있는 간 조직을 제거합니다.
- 패스 8-0 수혜자의 IVIHC 주위에 실크 실.
- 착용자의 IVIHC 가장자리에서 약 0.5mm 떨어진 곳에 1/4 원주 단면을 만듭니다(그림 6B).
- 내강에 생리식염수를 주입한 후 커프를 내강에 삽입합니다.
알림: 목이 짧기 때문에 커프가 PV보다 더 얕게 삽입되는 경우가 많습니다. - 커프를 8-0으로 조심스럽게 고정합니다. 실크 실을 뽑은 다음 혈관 클램프와 Pean 집게를 제거합니다.
6. 수술 후 관리
- 수술 후 회복을 용이하게 하기 위해 가열 패드와 보온 램프를 사용하십시오.
- 혈압, 심박수, 호흡수, 체온, 음식 및 물 섭취량을 지속적으로 모니터링합니다.
- 수술 후 통증을 완화하기 위해 카프로펜의 피하 주사(5mg/kg, 6시간마다 또는 필요할 때까지). 현지 기관 지침을 따르십시오.
참고: 생쥐의 상태가 악화되면 실험은 즉시 중단되고 생쥐는 이산화탄소 흡입으로 안락사됩니다. - 조직 샘플을 수집하려면 마우스를 다시 마취하고 IACUC 승인 방법으로 안락사시킵니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PV 재건술은 문맥을 풀어줄 때 비틀림이 없고 간이 균일하게 관류될 때 성공적입니다. 무반수소 시간은 25분을 초과하면 쥐 폐사 위험이 증가하므로 20분 미만이어야 합니다. IHIVC 재건술은 이식편에서 혈액 역류가 없는 경우 성공적인 것으로 간주됩니다.
장기 보존 용액을 사용하여 이식편을 저온에서 1시간 동안 보관하면 재관류 후 6시간에 혈청 알라닌 아미노전이효소 수치가 약 2,000U/L가 됩니다(그림 7A). 이식 후 7일 시점의 생존율은 100%입니다(그림 7B). 그러나 간 동맥 문합이 없는 모델에서 수혜자 마우스는 이식 후 약 30일 후에 간내 빌종 관련 문제에 굴복할 수 있습니다
그림 1: 혈관 재건을 위한 기구. 직선 또는 곡선 집게는 상황과 수술 분야에 따라 필요에 따라 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 현미경. 현미경에는 10배 배율의 대물 렌즈와 최소 0.8배 배율의 접안 렌즈가 장착되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 커프 준비. (A) PV 및 IHIVC용 커프. (B) 커프에 홈을 만드는 과정의 개략적인 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 커프 부착. (A) PV에 부착된 나사산이 커프로 전달됩니다. (B) 커프 부착을 위한 기기 설정. (C) 8-0으로 커프를 고정 실크 결찰. (D) 혈관 외부화와 커프에 대한 고정의 개략도. (E) 커프 부착이 완료되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: IHIVC 루트의 임시 결찰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 혈관 재건. 이 그림은 (A) PV 및 (B) IHIVC에 대한 구멍을 생성하는 위치를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 수술 후 결과. (A) 재관류 후 6시간에 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 혈청 수준. CIT, 차가운 허혈성 시간; Tx, 이식. p < 0.0001입니다. (B) MOLT 후 수취인의 생존. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
혈관 재건술을 배우는 것은 성공적인 MOLT를 달성하는 데 가장 어려운 측면입니다. 커프의 품질은 마우스의 크기가 작다는 점을 감안할 때 재건의 어려움에 큰 영향을 미친다5. 이 문서에서는 커프 준비, 부착 및 재건에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
커프 준비 및 연결 2,5에 관한 이전 보고서와 큰 차이점은 없지만 몇 가지 사소한 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 커프 핸들의 두께는 전체 둘레의 약 1/6로 제한되어야 합니다. 너무 얇으면 손잡이가 쉽게 구부러져 잡기 어려워질 수 있습니다. 너무 두꺼우면 받는 사람의 복부에서 다루기 어려울 수 있습니다. 초기에 개인 선호도를 파악하는 것이 중요합니다.
둘째, 뒤쪽 테이블에서 루멘의 가시성이 중요합니다. 10-0 나일론 실이 사용되어 PV 내강을 확인하기 위한 랜드마크로 기증자의 비장 정맥에 부착됩니다. 나일론 실은 과도한 꼬임을 방지하기 위해 8시 방향에 배치되어 있습니다. 혈관 벽은 3시 방향과 9시 방향에 두 개의 집게로 잡고 6시 방향에 커프 벽에 대고 눌러 외부화됩니다. 8-0으로 고정 명주실은 신중한 움직임이 필요합니다. 홈에 고정하여 적절하게 고정할 수 있습니다. 부착 후 커프를 들어 올려 빠지지 않는지 확인하십시오.
셋째, 재건 시 커프가 삽입됨에 따라 구멍이 자연스럽게 커지기 때문에 수용 혈관에 너무 큰 구멍을 만들지 않는 것이 중요합니다. 큰 구멍을 만들면 가장 흔한 고장 원인인 용기가 갈라질 수 있습니다. 특히 IHIVC 재구성에서는 IHIVC의 길이가 짧아 PV보다 쉽게 빼낼 수 있기 때문에 더 작은 구멍을 만들어야 합니다. 내강을 통해 식염수를 통과시킬 때 아래쪽이 아닌 위쪽으로 힘을 가하여 커프 삽입을 지지합니다.
실패의 일반적인 원인과 주의 사항에 대해 자세히 설명했습니다. 가장 중요한 포인트는 혈관 내부 내강을 명확하게 시각화하고 커프 삽입 시 불필요한 힘을 피하여 혈관 갈라짐을 방지하는 것입니다. 커프 방법에 대한 이러한 기술 팁은 기술을 향상시키고 연구를 발전시키는 것으로 믿어집니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
어떤 저자도 공개해야 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 2022 JST 기초 연구(일본 이식 학회)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
