Summary
Detta protokoll ger teknisk information för kärlrekonstruktion med hjälp av manschetttekniken vid ortotopisk levertransplantation på möss.
Abstract
Ortotopisk levertransplantation hos möss är en effektiv metod för att undersöka de underliggande mekanismerna för leverischemi och reperfusionsskada. De tekniska utmaningarna utgör dock ett hinder för att använda denna värdefulla experimentella modell och föra dessa färdigheter vidare till nästa generation. Den mest utmanande aspekten av denna procedur är vaskulär rekonstruktion, inklusive portalvenen (PV), infrahepatisk inferior vena cava (IHIVC) och suprahepatisk inferior vena cava. Användningen av plastmanschetter, snarare än suturer, möjliggör en smidigare rekonstruktion av PV och IHIVC. Kärlen rekonstrueras genom att fästa en manschett gjord av en intravenös kateter på toppen av transplantatkärlet och placera manschetten i det mottagande kärlet. De två mest avgörande aspekterna är att visualisera kärlets inre lumen på rätt sätt och undvika att använda överdriven kraft. Vårt mål är att ge en teknisk översikt över vaskulära rekonstruktioner med hjälp av manschetttekniken vid mottagarkirurgi. Dessa tekniska tips för manschetttekniken förväntas hjälpa mikrokirurger att underlätta vaskulär rekonstruktion och främja sin forskning.
Introduction
Ortotopisk levertransplantation hos möss (MOLT) är en effektiv experimentell metod som först rapporterades 19911. Denna experimentella modell, som använder genetiskt modifierade möss och olika forskningsreagenser, har spelat en central roll för att undersöka varm och kall ischemi och reperfusionsskador. Modellens höga tekniska komplexitet har dock hindrat utvecklingen av basmedicin för levertransplantation2. MOLT omfattar tre huvudsteg: (1) uttag av levern från donatormusen, (2) operation av bakbordet och (3) implantation av levern i mottagaren. Bland dessa mottagaringrepp utgör vaskulär anastomos den största utmaningen. Medan den suprahepatiska inferior vena cavastosisen vanligtvis fullbordas genom handsömnad2, kan den infrahepatiska inferior vena cava (IHIVC) och portvenen (PV) rekonstrueras mer effektivt med hjälp av plastmanschetter i stället för handsydda suturer.
Den anhepatiska perioden betecknar intervallet mellan avlägsnandet av mottagarens ursprungliga lever och transplantatimplantationen. För att säkerställa konsekventa resultat är det absolut nödvändigt att begränsa den anhepatiska tiden till mindre än 20 minuter. Följaktligen har studier som använder denna modell begränsats till specifika institutioner 3,4,5,6,7,8,9. Bland de olika stadierna av MOLT är det avgörande att uppnå en jämn rekonstruktion av PV och IHIVC för att minimera anhepatisk tid och säkerställa en framgångsrik transplantation.
PV- och IVC-rekonstruktion utförs i allmänhet med hjälp av vaskulära manschetter eftersom manschetttekniken förenklar vaskulär anastomos jämfört med handsydda suturer 2,5,8. Tekniken som är involverad i vaskulär manschettförberedelse och säker fästning av manschetten påverkar avsevärt komplexiteten i mottagarens vaskulära rekonstruktion. Vårt mål är att ge detaljerad visuell vägledning för många tekniska tips relaterade till manschettmetoden och därigenom minska inlärningskurvan. Dessa videoklipp kommer att ge en tydlig förståelse för hur man fäster manschetten på kärlen och rekonstruerar PV och IHIVC under mottagarkirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försöksprotokollet godkändes av Animal Experimentation Committee vid Kyoto University. I studien användes C57BL/6-möss som var äldre än 10 veckor och vägde mellan 25 g och 30 g, erhållna från en kommersiell källa (se Materialtabell). Alla djur sövdes med 2,5 % isofluran (enligt institutionellt godkända protokoll), under specifika patogenfria förhållanden, och alla experimentella procedurer utfördes i enlighet med Kyoto Universitys regler för djurförsök. De lämpliga instrumenten som används för studien listas i materialtabellen och avbildas i figur 1 och figur 2.
1. Val av djur
- Använd möss med en kroppsvikt på 25-30 g.
OBS: Även om leverallograft2 hos möss är allmänt accepterade över stora histokompatibilitetskomplexbarriärer, valde vi den syngena MOLT-modellen i denna studie för att fokusera på den detaljerade mekanismen för kall ischemireperfusionsskada10. Möss som väger mindre än 25 g rekommenderas inte eftersom det är omöjligt att föra in en inre stent i en tunn gallgång. På samma sätt rekommenderas inte möss som väger mer än 30 g på grund av närvaron av en stor mängd intraabdominellt fett runt kärlen.
2. Tillverkning av manschetter
- Förbered 20 G och 16 G intravenösa katetrar för PV respektive IHIVC.
- Använd en skalpell och skär av katetern för att skapa manschetten. Manschettens huvuddel ska vara 2 mm lång, med ett förlängningshandtag på 1 mm (Figur 3A).
OBS: Om handtaget är för stort kan det bli svårt att sätta in manschetten. - På manschettens yta skapar du ett grunt spår för trådfixering med hjälp av baksidan av skalpellbladet.
OBS: När du applicerar baksidan av skalpellbladet på manschetten, se till att bladets spets är i en vinkel på cirka 60 grader (som visas i figur 3B). Efter att ha gjort det första spåret, fäst skalpellbladet och rotera manschetten. Helst rekommenderas två spår, men ett enda spår kan räcka utan problem.
3. Fäste för manschetten
- Lägg små isbitar i en rektangulär plastbehållare och placera en liten metallkopp (6 cm i diameter) ovanpå. Fyll koppen med organkonserveringsvätska (se Materialtabell) och placera det syngena transplantatet inuti.
- Rulla försiktigt det syngena levertransplantatet (extraherat från en annan donatormus) med en bomullspinne, se till att porta hepatis är vänd uppåt. Avlägsna noggrant allt blod som lagrats i IVC:s lumen med organkonserveringsvätska.
- Trä PV:n genom manschetten med en tråd som är fäst, t.example, i mjältvenen (se figur 4A).
- Med manschetthandtaget vid klockan 12, säkra både handtaget och manschetten med en bulldog clamp (se materialtabell), placera den 2 till 3 mm från PV-kanten.
- Fäst bulldoggen clamp ytterligare med en stor vaskulär pincett och en fixeringsform för att etablera det operativa fältet (se figur 4B).
- Inspektera noggrant PV-lumen vid cirka 15 till 20x förstoring. Vid behov kan droppande vatten förbättra synligheten av lumen.
- Ta försiktigt tag i PV-lumen och tryck ut den genom manschetten.
- När den är helt externaliserad, säkra den med en dubbel ligering med 8-0 silkestråd längs manschettens spår (Figur 4C,D).
OBS: Se till att ligaturen inte är lös. Se också till att ligaturpunkten inte är för stor, eftersom det kan störa manschettinsättningen. Ligaturpunkten kan placeras i vilken riktning som helst. - Fäst manschetten på IHIVC med en procedur som liknar den som används för PV (Figur 4E).
OBS: När du klämmer fast IHIVC med manschetten, undvik att bita i leverparenkymet. Eftersom halsen är kortare än PV:n, bestäm noggrant klämpositionen. - Skapa en slipknot genom att föra tråden runt basen av IHIVC för att tillfälligt ligera IHIVC (Figur 5). Denna tråd kommer att tas bort efter reperfusion.
4. Rekonstruktion av portalvenen
- Bedöva mottagarmusen genom att inducera anestesi med isofluran vid 2,5 % och minska den till 0,6 % innan den naturliga levern extraheras enligt beskrivningen i publicerad litteratur2. Dinsinfect operationsområdet minst tre gånger med alternerande omgångar av jodfor och 70 % etanol före laparotomi.
- Se till att leverloben är korrekt placerad och att den manschettförsedda PV:n är fri från veck och vridning.
- Ta försiktigt tag i mottagarens PV-kant med en Pean-pincett och fäst den med ett skruvstäd.
OBS: I den här artikeln hänvisar ett skruvstäd till en mekanisk apparat som används för att säkra Pean-pincett på bordet. Mer information om skruvstycke finns i Materialförteckning. - Applicera en vaskulär klämma på mottagarens PV och passera en 8-0 silkestråd runt den.
- Skapa en 1/4 omkrets cirka 0.5 mm från PV-kanten (Figur 6A). Förstora hålet samtidigt som saltlösning passerar genom lumen med hjälp av ett specialiserat instrument (en 27 G nål med spetsen avskuren och böjd till en L-form).
- Använd en rak pincett för att ta tag i manschetthandtaget och sätt in det i lumen.
- När den är helt isatt, fäst manschetten med en 8-0 silke tråd. En enda ligering räcker för fixering.
- Ta bort kärlklämman och reperfundera levern.
- Släpp försiktigt ut Pean-pincetten och slutför rekonstruktionen av portalvenen. Hela rekonstruktionsprocessen för solceller bör ta cirka 5 minuter.
5. Infrahepatisk inferior vena cava rekonstruktion
- Placera leverloben på lämpligt sätt och flytta tången som är fäst vid mottagarens IHIVC dorsal till transplantatets högra nedre lob och säkra den med ett skruvstäd.
- Eliminera eventuell kvarvarande levervävnad runt mottagarens IVIHC genom att försiktigt gnugga med en bomullspinne.
- Passera en 8-0 silkestråd runt mottagarens IVIHC.
- Skapa en 1/4 omkretssektion cirka 0,5 mm från mottagarens IVIHC-kant (figur 6B).
- Efter att ha fört in normal koksaltlösning i lumen, sätt in manschetten i lumen.
OBS: På grund av den korta halsen sätts manschetten ofta in ytligare än i PV. - Fäst försiktigt manschetten med en 8-0 silkestråd och ta sedan bort kärlklämman och Peanpincetten.
6. Postoperativ vård
- Använd en värmedyna och en värmelampa för att underlätta återhämtningen efter operationen.
- Övervaka kontinuerligt blodtryck, hjärtfrekvens, andningsfrekvens, kroppstemperatur samt mat- och vattenkonsumtion.
- Adminsiter subkutan injektion av karprofen (5 mg/kg, var 6:e timme eller tills det behövs) för att lindra postoperativ smärta. Följ lokala institutionella riktlinjer.
OBS: Om mössens tillstånd försämras kommer experimentet att stoppas omedelbart och mössen avlivas genom inandning av koldioxid. - För att samla in vävnadsprovet, beöva mössen på nytt och avliva dem med en IACUC-godkänd metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PV-rekonstruktionen är framgångsrik när det inte finns någon tortuositet när portvenen lossas och levern är jämnt perfunderad. Anepatiska tider bör vara under 20 minuter, eftersom anhepatiska tider som överstiger 25 minuter ökar risken för musdöd. IHIVC-rekonstruktion anses vara framgångsrik om det inte finns någon bloduppstötning från transplantatet.
Förvaring av transplantatet vid kalla temperaturer i 1 timme med organkonserveringslösning resulterar i en serumnivå av alaninaminotransferas på cirka 2 000 E/l 6 timmar efter reperfusion (Figur 7A). Överlevnaden är 100 % 7 dagar efter transplantation (Figur 7B). Men i vår modell utan leverartäranastomos kan mottagarmöss duka under för intrahepatiskt bilomrelaterade problem cirka 30 dagar efter transplantationen
Figur 1: Instrument för vaskulär rekonstruktion. Rak eller böjd pincett används efter behov för situationen och det operativa fältet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mikroskopet. Mikroskopet är utrustat med en objektivlins med 10x förstoring och en okularlins med minst 0,8x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förberedelse av manschetten. (A) Manschetten för PV och IHIVC. (B) En schematisk representation av processen att skapa ett spår på manschetten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Manschettfäste. (A) Tråden som är fäst vid PV:en förs in i manschetten. (B) Instrumentuppsättning för manschettfäste. (C) Säkra manschetten med 8-0 silke ligationer. (D) Schematisk illustration av vaskulär externalisering och fixering till manschetten. (E) Färdig manschettfäste. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Temporär ligering av IHIVC-roten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Vaskulär rekonstruktion. Den här illustrationen visar platserna för att skapa hål för (A) PV och (B) IHIVC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Postoperativa resultat. (A) Serumnivåer av alaninaminotransferas (ALAT) 6 timmar efter reperfusion. CIT, kall ischemisk tid; Tx, transplantation. p < 0,0001. (B) Överlevnad för mottagaren efter MOLT. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att lära sig vaskulär rekonstruktion är den mest utmanande aspekten för att uppnå framgångsrik MOLT. Manschettens kvalitet påverkar avsevärt rekonstruktionens svårighetsgrad, med tanke på den lilla storleken på möss5. Den här artikeln ger ett detaljerat protokoll för förberedelse, fastsättning och rekonstruktion av manschetten.
Även om det inte finns några större skillnader från tidigare rapporter när det gäller manschettförberedelse och anslutning 2,5, bör några mindre punkter beaktas. För det första bör manschetthandtagets tjocklek begränsas till cirka 1/6 av den totala omkretsen. Om den är för tunn kan handtaget lätt böjas och bli svårt att greppa. Om den är för tjock kan den vara utmanande att hantera i mottagarens buk. Det är viktigt att tidigt identifiera dina personliga preferenser.
För det andra är det avgörande att lumen syns vid den bakre tabellen. En 10-0 nylontråd används, fäst vid givarens mjältven som ett landmärke för att bekräfta PV-lumen. Nylontråden placeras vid 8-tiden för att förhindra överdriven vridning. Kärlväggen externaliseras genom att ta tag i den klockan 3 och 9 med två pincett och trycka den mot manschettväggen klockan 6. Fixering med 8-0 Silkestråd kräver försiktiga rörelser. Tillräcklig fixering uppnås genom att säkra den i spåret. Efter fastsättning, lyft manschetten för att bekräfta att den inte lossnar.
För det tredje, under rekonstruktionen är det viktigt att inte skapa ett för stort hål i mottagarkärlet eftersom hålet naturligt förstoras när manschetten sätts in. Att göra ett stort hål kan leda till att kärlet spricker, den vanligaste orsaken till fel. Särskilt vid IHIVC-rekonstruktion bör mindre hål göras eftersom den kortare längden på IHIVC gör det lättare att dra ut än en PV. När du för koksaltlösning genom lumen, stöd manschetten att sättas in genom att applicera uppåtriktad kraft snarare än nedåt.
Vanliga orsaker till fel och försiktighetsåtgärder har diskuterats i detalj. De viktigaste punkterna är att säkerställa tydlig visualisering av det inre kärlets lumen och att undvika onödig kraft vid införandet av manschetten för att förhindra att kärlet spricker. Dessa tekniska tips för manschettmetoden tros höja kompetensen och främja forskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga författare har några intressekonflikter att uppge.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av 2022 års JST grundforskning (The Japanese Society for Transplantation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
