מדידת התיישבות חיידקים על שורשי Arabidopsis thaliana במצב הידרופוני

Summary

התיישבות של ריזובקטריה מעודדת גדילה של צמחים (PGPR) בריזוספרה חיונית להשפעתו מעודדת הצמיחה. יש צורך לתקנן את שיטת הזיהוי של התיישבות ריזוספרה חיידקית. במאמר זה אנו מתארים שיטה הניתנת לשחזור לכימות התיישבות חיידקים על פני השטח של השורש.

Abstract

מדידת התיישבות חיידקים על שורש Arabidopsis thaliana היא אחד הניסויים השכיחים ביותר במחקרי אינטראקציה בין צמחים למיקרובים. שיטה סטנדרטית למדידת התיישבות חיידקים בריזוספרה נחוצה כדי לשפר את יכולת הרבייה. תחילה תרבינו A.thaliana סטרילית בתנאים הידרופוניים ולאחר מכן חיסנו את תאי החיידק בריזוספרה בריכוז סופי של OD₆₀₀ של 0.01. יומיים לאחר החיסון, רקמת השורש נקטפה ונשטפה שלוש פעמים במים סטריליים כדי להסיר את תאי החיידקים הלא מיושבים. לאחר מכן נשקלו השורשים, ותאי החיידק שהתיישבו על השורש נאספו על ידי מערבולת. מתלה התא דולל בשיפוע עם חיץ מלח חוצץ פוספט (PBS), ואחריו ציפוי על תווך אגר לוריא-ברטאני (LB). הצלחות הודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות, ולאחר מכן, המושבות הבודדות על לוחות LB נספרו ונורמלו כדי לציין את תאי החיידקים שהתיישבו על שורשים. שיטה זו משמשת לזיהוי התיישבות חיידקים בריזוספרה בתנאי מונו-אינטראקציה, עם יכולת שחזור טובה.

Introduction

קיימות שיטות כמותיות ואיכותיות לאיתור התיישבות ריזוספרה על ידי זן חיידק יחיד. בשיטה האיכותית יש להשתמש בזן המבטא פלואורסצנטיות באופן מכונן ולבחון את התפלגות הפלואורסצנטיות ועוצמתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מכשירי לייזר קונפוקליים ^1,2. אסטרטגיות אלה יכולות בהחלט לשקף התיישבות חיידקים באתרו³, אך הן אינן מדויקות כמו שיטות ספירת לוחות מסורתיות בכימות. חוץ מזה, בגלל המגבלה של הצגת אזורי שורש חלקיים בלבד מתחת למיקרוסקופ, לפעמים זה יכול להיות מושפע מהטיה סובייקטיבית.

במאמר זה אנו מתארים שיטה כמותית, הכוללת איסוף תאי החיידק המאוכלסים וספירת ה-CFUs החיידקיים על צלחת. שיטה זו מבוססת על דילול וציפוי שבאמצעותם ניתן לספור את הזנים המושבלים שהופשטו משורשי הצמח, ולחשב את מספר החיידקים המיושבים הכולל על השורש ^4,5.

ראשית, A. thaliana תורבית בתנאים הידרופוניים, ולאחר מכן תאי חיידקים חוסנו בריזוספרה בריכוז סופי של 0.01 OD₆₀₀. רקמות השורש הנגועות נקצרו יומיים לאחר החיסון ונשטפו במים סטריליים כדי להסיר את תאי החיידקים הלא מיושבים. יתר על כן, תאי חיידקים שהתיישבו על השורש נאספו, נמהלו במאגר מלח חוצץ פוספט (PBS), וצופו על מדיום אגר לוריא-ברטאני (LB). לאחר הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות, נספרו ונורמלו מושבות בודדות על לוחות LB כדי לקבוע את תאי החיידקים המאוכלסים על השורשים.

שיטה זו ישימה מאוד, בעלת יכולת חזרה טובה, והיא מתאימה יותר לקביעת התיישבות חיידקית מדויקת בריזוספרה.

Protocol

1. הידרופוני סטרילי א. גידול תאליאנה

1. הכינו שתילי A. thaliana .
   1. הכינו תרבית שתילי A. thaliana בינוני, המורכב מ 1/2 MS בינוני (Murashige ו Skoog) עם 2% (wt / vol) סוכרוז ו 0.9% (wt / vol) אגר.
   2. יוצקים את אמצעי העיקור המוכן לכלי פטרי מרובעים סטריליים (13X13 ס"מ) לפני המיצוק. יש להימנע מייבוש באוויר כדי לשמור על לחות.
   3. לטבול זרעי A. thaliana בצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל מלא 1 מ"ל של מים סטריליים ב 4 ° C במשך יותר מ 12 שעות, ולאחר מכן לעקר את הזרעים עם 1 מ"ל של 2% (vol / vol) NaClO במשך 2 דקות.
   4. שטפו היטב את הזרעים במים סטריליים שש פעמים כדי להסיר את תמיסת NaClO. זורעים את הזרעים על צלחות פטרי עם מדיום אגר MS עם קצה סטרילי של 1 מ"ל.
   5. אטמו את צלחות הפטרי בסרט רפואי נושם והניחו אותן במאונך באינקובטור קל לגידול במשך שבוע. הגדר את יחס היום/לילה של אינקובטור האור ל -16 שעות / 8 שעות, שמור על הטמפרטורה על 23 ° C והלחות על 40%-60%.
2. השתלה א. תליאנה.
   1. חותכים חורים בקוטר 5 מ"מ על מכתים בגודל נקבוביות בגודל 40 מיקרומטר ומעקרים אותם.
   2. השתילו שלושה צמחי A. thaliana בני 7 ימים דרך חורים של מסננת תאים והכניסו אותם לצלחת 6 בארות המכילה 3 מ"ל של נוזל סטרילי 1/2 MS בינוני עם 0.5% סוכרוז.
   3. הניחו את לוחות 6 הקידוחים באינקובטור אור (איור 1A) ודגרו במשך 10 ימים.

2. טיפוח חיידקים וחיסון

1. הכינו תרחיף חיידקי לחיסון.
   1. עבור Bacillus velezensis, לחסן תאי חיידקים לתוך LB סטרילי בינוני לדגור ב 37 ° C עם רעד ב 170 סל"ד עד שהוא מגיע OD₆₀₀ של 0.8-1.2.
   2. לאסוף את תאי החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 6000 x גרם במשך 2 דקות ולהשהות מחדש את התאים במאגר PBS (2 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 136 mM NaCl, 2.6 mM KCl). חזור על שלבי הצנטריפוגה וההשהיה מחדש 3 פעמים כדי להסיר את מדיום LB ואת המטבוליטים החיידקיים.
   3. להשהות את תאי החיידק בתווך טרי של 1/2 MS בריכוז סופי של OD₆₀₀ 0.01. לחסן את תרחיפים חיידקים על צלחות 6 באר לגדל שתילי A. thaliana , מניחים את צלחות 6 באר באינקובטור אור, ולטפח אותם במשך 2 ימים.

3. מדידת חיידקים המתיישבים על שורשים

1. קוצרים את רקמת השורש ולוחצים את התאים המיושבים.
   הערה: כל השלבים צריכים להתבצע במצב גנוטוביוטי
   1. שקלו את צינורות 2 מ"ל ורשמו את המשקל כ-W₀.
   2. קצרו את רקמות שורש A. thaliana בתרבית משותפת ושטפו אותן במים סטריליים 3 פעמים. הניחו את השורש על נייר סינון כדי להסיר את עודפי המים.
   3. הכניסו את השורש לצינור המיקרוצנטריפוגה השקולה, שקלו את השורשים יחד עם הצינור ורשמו אותו כ-W₁.
   4. הוסף 1 מ"ל PBS לכל צינור ומערבל את הצינורות במשך 8 דקות במהירות המרבית.
   5. מדללים את התרחיפים עם תאי החיידקים שנאספו ממושבות שורש ל 1 x ^10-1-1 x ^10-4 (בהתאם ליכולת התיישבות החיידקים). מורחים את התרחיפים החיידקיים המדוללים על צלחות המכילות מדיום אגר LB ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 10 שעות.
2. לספור את המושבות ולנרמל את הנתונים.
   1. ספרו את מושבות החיידקים על לוחות LB.
   2. חישוב CFUs על פי דילול המתאים לנרמל את הנתונים עם משקל טרי שורש (W_{1-W 0}). התוצאות הסופיות מצביעות על ספירת תאי חיידקים שהתיישבו לגרם של שורש יומיים לאחר החיסון (איור 1B).

Representative Results

כדי לבדוק את הדיוק של יכולת התיישבות החיידקים שזוהתה בשיטה זו בריזוספרה A. thaliana חיסנו את Bacillus velezensis SQR9 WT ומוטציה נגזרת Δ8mcp לתוך A . thaliana rhizosphere בנפרד. Δ8mcp היא מוטציה שחסרה את כל הגנים המקודדים לכימורצפטור, ויש לה ירידה משמעותית בנשאות⁶. מדדנו את הנשאות שלהם יומיים לאחר החיסון על ידי בדיקת נשאות השורש הנוכחית. התוצאות הראו ירידה משמעותית בהתיישבות השורשים של Δ8mcp, מה שמצביע על כך שהמצב והשיטה האלה מודדים ביעילות את התיישבות החיידקים (איור 1C).

איור 1: גידול A. thaliana והתיישבות השורש של Bacillus velezensis SQR9 ו-Δ8mcp. (A) מבט מלמעלה על A. thaliana בן 7 ימים הגדל בצלחות 6 בארות עם מכתים תאים במצב הידרופוני. (B) מבט מהצד של א. תליאנה בת 7 ימים הגדלה בצלחות בנות 6 בארות, שכל באר מכילה 3 שתילים. (C) נשאות של B. velezensis wild-type SQR9 ו-Δ8mcp שנמדדו באמצעות הבדיקה המוצגת. שישה עותקים משוכפלים נכללו, והנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

כדי להשיג יכולת שחזור טובה, ישנם ארבעה שלבים קריטיים לתהליך זיהוי הקולוניזציה של פרוטוקול זה. ראשית, יש לוודא שמספר תאי החיידקים המחוסנים זהה לחלוטין בכל ניסוי. שנית, יש צורך גם בשליטה על עוצמת ניקוי החיידקים הבלתי מיושבים באמצעות מים סטריליים. שלישית, כל תהליך דילול דגימה צריך להיות מערבול לפני ביצועו כדי לאפשר לדגימה להיות במצב ערבוב מלא כדי למנוע טעויות ספיגה עקב המאפיינים של חיידקים שקל לשקוע בצינור המיקרוצנטריפוגה. לכן, אנו ממליצים להשתמש במכשיר מערבולת כדי לערבב את התרחיף החיידקי לפני כל ספיגה. רביעית, asepsis יש להבטיח בקפידה במהלך כל הפעולות באמצעות שיטה זו כדי למנוע כל אפשרות של זיהום.

שיטה זו משמשת כדי לקבוע את החיידקים התיישבו על פני השורש. מלבד חיידקי שטח השורש, חיידקים אנדופיטיים ופטריות מאכלסים גם את הריזוספרה של הצמח⁷. עדיין ניתן לזהות את יכולת ההתיישבות של חיידקים אנדופיטיים באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה, אך יש לטחון את רקמת השורש כדי לשחרר חיידקים אנדופיטיים. עם זאת, הפטריות האנדופיטיות שונות מחיידקים. רוב השיטות המקובלות משתמשות במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) כדי לצפות בצמיחת קורים, שהיא שיטת זיהוי איכותית הדומה לחיידקי תיוג פלואורסצנטי לצורך הדמיה⁸.

כאשר משווים את הנשאות של זנים שונים, אין לחסן אותם בצלחת אחת של 6 בארות כדי למנוע את ההשפעה של תרכובות נדיפות חיידקיות⁹ ותרכובות נדיפות צמחיות^10,11. בחרנו יומיים לאחר החיסון לגילוי שורש מכיוון שהנשאות של SQR9 הגיעה למקסימום בין יומיים לארבעה ימים; ניתן להתאים את הזמן לגילוי התיישבות החיידקים בהתאם לזנים.

בהשוואה לשיטות אחרות המתוארות, שיטה זו מדויקת וקלה לתפעול. לדוגמה, בשיטה שתוארה על ידי נועם ואחרים יש את הערבידופסיס המוצק מחוסן בחיידקים מיד עם השתלתו במצב הידרופוני^12,13. כאן, אנו מציעים לחסן את החיידקים לריזוספרה לאחר מספר ימים של השתלה כדי למנוע את ההשפעה של הסתגלות הצמח לסביבת הגידול שהשתנתה. השיטה המתוארת במחקר זה טובה גם לצמחים לשחרר הפרשה שורשית, המשפיעה על ההתיישבות.

כדי לאפשר לנבטי הצמח לגדול בנפרד באוויר והרחק לחלוטין מהטבילה הנוזלית, ביצענו כמה שינויים קלים ועיבוד על מכתים התא כדי להפוך אותם לזמינים לשיטה הידרופונית זו. יתר על כן, שיטה זו מתאימה יותר לקביעת התיישבות חיידקים מדויקת בכמויות קטנות אך לא לכמויות גדולות של הפרשות שורשים שנאספו בהידרוקולטורה¹⁴. חשוב לציין כי שיטה זו שונה בהתבסס על מחקרים שפורסמו בעבר 12,14,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E