Summary
Utforskningen av cellulær oppførsel under mekanisk stress er avgjørende for fremskritt innen cellulær mekanikk og mekanobiologi. Vi introduserer Fluorescence Micropipette Aspiration (fMPA)-teknikken, en ny metode som kombinerer kontrollert mekanisk stimulering med omfattende analyse av intracellulær signalering i enkeltceller. Denne teknikken undersøker nye dybdestudier av levende celle mekanobiologi.
Abstract
Mikropipetteaspirasjonsanalyser har lenge vært en hjørnestein for undersøkelsen av levende cellemekanikk, og gir innsikt i cellulære responser på mekanisk stress. Denne rapporten beskriver en innovativ tilpasning av fluorescenskoblet mikropipetteaspirasjon (fMPA) analyse. FMPA-analysen introduserer evnen til å administrere presise mekaniske krefter samtidig som man overvåker de levende cellemekanotransduksjonsprosessene mediert av ionkanaler. Det sofistikerte oppsettet inneholder en presisjonskonstruert mikropipette av borosilikatglass koblet til et finregulert vannreservoar og pneumatisk aspirasjonssystem, noe som muliggjør kontrollert trykkpåføring med trinn så raffinerte som ± 1 mmHg. En betydelig forbedring er integreringen av epi-fluorescensavbildning, noe som muliggjør samtidig observasjon og kvantifisering av cellemorfologiske endringer og intracellulære kalsiumflukser under aspirasjon. FMPA-analysen, gjennom sin synergistiske kombinasjon av epifluorescensavbildning med mikropipetteaspirasjon, setter en ny standard for studiet av cellemekanosensering i mekanisk utfordrende miljøer. Denne mangefasetterte tilnærmingen kan tilpasses ulike eksperimentelle oppsett, og gir kritisk innsikt i enkeltcelle mekanosenseringsmekanismer.
Introduction
De utfoldende funnene i verden av cellulær atferd har fremhevet rollen som mekaniske stimuli, som spenning, væskeskjærspenning, kompresjon og substratstivhet, i å diktere dynamiske cellulære aktiviteter som vedheft, migrasjon og differensiering. Disse mekanobiologiske aspektene er av avgjørende betydning for å belyse hvordan celler samhandler med og reagerer på deres fysiologiske miljøer, og påvirker ulike biologiske prosesser 1,2.
I løpet av det siste tiåret har mikropipettebaserte aspirasjonsanalyser skilt seg ut som et allsidig verktøy for å studere ulike cellulære responser på mekaniske stimuli. Denne teknikken gir verdifull innsikt i de inneboende mekaniske egenskapene til levende celler på enkeltcellenivå, inkludert cellulær elastisk modul, stivhet og kortikal spenning. Disse analysene muliggjør måling av ulike mekaniske parametere, som cellemembranspenning, trykk utøvd på cellemembranen og kortikal spenning (oppsummert i tabell 1). Å studere de ambisiøse kreftene har beriket vår forståelse av hvordan de påvirker cellulære funksjoner og prosesser, spesielt innen membrandynamikk, inkludert fragmentering, forlengelse og spirende 3,4.
| Mekanisk parameter | Beskrivelse | Seminal tilnærminger |
| Celle stivhet | Måling av en celles mekaniske stivhet og elastisitet. | Aspirasjon av cellemembranen og analyse av deformasjonsrespons på undertrykket20,21. |
| Adhesjon styrke | Evaluering av hvor sterkt celler fester seg til overflater. | Påføring av kontrollert sug for å løsne festede celler fra et substrat2,22. |
| Membran spenning | Vurdering av spenning eller stress i cellemembraner. | Måling av membrandeformasjon som respons på påført trykk23,24. |
| Viskoelastiske egenskaper | Karakterisering av en celles kombinerte viskøse og elastiske oppførsel. | Analyse av tidsavhengig deformasjonsrespons på aspirasjon23,25. |
| Deformabilitet | Bestemmelse av hvor lett en celle kan endre form. | Evaluering av graden av deformasjon under kontrollert sug20,24. |
| Overflatespenning | Måling av spenningen på cellens overflate. | Vurdering av trykket som kreves for å danne et fremspring av mikropipettmembran26. |
| Interaksjon mellom celle og materiale | Studie av interaksjoner mellom celler og materialer eller substrater. | Aspirasjon av celler i kontakt med forskjellige materialer og observasjon av interaksjoner2,24. |
| Celle-celle interaksjon | Undersøkelse av interaksjoner mellom naboceller. | Aspirasjon av en gruppe celler og analyse av deres intercellulære krefter27. |
Tabell 1: Mekaniske parametere karakterisert ved mikropipetteaspirasjonsanalysen.
Den mikropipettebaserte aspirasjonsteknikken har blitt mye brukt til å studere røde blodlegemer (RBC), vurdere deformerbarheten og ulike mekaniske egenskaper ved RBC, noe som er viktig for å forstå deres funksjon i sirkulasjonssystemet. RBC utviser bemerkelsesverdig tilpasningsevne, og bevarer sin mekaniske allsidighet mot deformasjon når de navigerer gjennom det intrikate kapillærnettverket og interendoteliale spalter 5,6. Under denne reisen må RBC-er krysse gjennom passasjer så smale som 0,5-1,0 μm, og utsette seg for en rekke mekaniske krefter, inkludert spenning og kompresjon 7,8,9. De har også høy følsomhet for skjærspenningen som genereres av blodstrømmen under sirkulasjon10. Disse prosessene fremmer aktiveringen av regulatoriske mekanismer som involverer kalsiuminnstrømning, en avgjørende signalhendelse med veletablerte roller i cellulære responser på mekaniske stimuli11,12. De komplekse mekanismene som styrer kalsiummediert mekanosensering forblir overbevisende emner for pågående undersøkelser.
I denne sammenheng står fMPA som en effektiv tilnærming for å avsløre omfanget av kalsiummobilisering under nøyaktig kontrollerte mekaniske krefter, noe som muliggjør samtidig påføring av mekanisk modulering (ved bruk av mikropipetteaspirasjonssystemet) og visualisering av kalsiumintensitet (ved bruk av fluorescerende indikatorer). Det etterligner spesielt det fysiologiske scenariet når RBC reiser gjennom innsnevrende blodkar. Det er verdt å merke seg at fMPA-systemet vi utviklet kan generere trykk med en oppløsning på 1 mmHg. Det implementerte høyhastighetskameraet kan oppnå en tidsmessig oppløsning på 100 ms og en romlig oppløsning på submikronmeternivå. Disse konfigurasjonene sikrer presis bruk av mekaniske krefter til levende celler og fanger samtidig den resulterende cellulære signaleringen. Videre, på grunn av den integrerende konstruerte naturen til dette oppsettet, kan mikropipetteaspirasjonsanalysen lett tilpasses for å utfylle annet utstyr eller teknikker, noe som muliggjør videre utforskning av cellemekanikkens vanskeligheter. Denne allsidigheten står som en ekstra fordel med denne tilnærmingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene til og er godkjent av Human Research Ethics Committee ved University of Sydney. Det ble innhentet informert samtykke fra donorene til denne studien.
1. Menneskelig RBC-isolasjon
MERK: Trinn 1.1 skal utføres av en utdannet flebotomist ved hjelp av en protokoll som er godkjent av Institutional Review Board.
- Trekk ut 5 ml blod fra median alen vene ved hjelp av en 19 G sommerfuglnål.
- Overfør det oppsamlede blodet til et 15 ml rør inneholdende 1:200 enoksaparin for å forhindre koagulering.
- Fortynn 5 μL enoksaparin-antikoagulert blod i 1 ml karbonat/bikarbonatbuffer (C-buffer, pH = 8,5-9; Materialfortegnelse).
- Sentrifuge den fortynnede blodprøven ved 900 × g i 1 min for å sedimentere RBC. Dekanter supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten.
- Utfør to vasker av RBC-pelleten med 1 ml C-buffer (materialfortegnelse), sentrifugerer hver gang ved 900 × g i 1 min.
- Deretter vaskes RBC-pelleten 2x med 1 ml Tyrodes buffer med de samme sentrifugeringsbetingelsene, og deretter resuspenderes den endelige pelleten i 1 ml Tyrodes buffer for å oppnå RBC-suspensjonen som er vasket lager.
2. Kalsiumindikator lasting
- Juster konsentrasjonen av RBC-oppløsningen som vaskes til 10 × 106 celler/ml i Tyrodes buffer, basert på celletallet oppnådd ved hjelp av en automatisk celleteller (materialfortegnelse).
- Merk kalsiumet inne i RBCene ved å inkubere med 16,67 μM Cal-520 AM, et kalsiumfølsomt fargestoff, mens du rører på en roterende rørblander i 1 time.
- Fortynn RBCene i Tyrodes buffer som inneholder 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) i forholdet 1:50. Cellene er nå klare for eksperimentell bruk.
3. Fabrikasjon av mikropipette
- Monter kapillærrøret av borosilikatglass (1 mm ytre diameter x 0,6 mm indre diameter) på P-1000 mikropipettetrekkeren for å produsere to tilsvarende mikropipetter med lukkede spisser på trekkstedet ved hjelp av det forhåndsinnstilte trekkeprogrammet. For dette oppsettet bruker du følgende trekkprogramverdier: varme 516, trekk 150, hastighet 75, tid 250 og trykk 500.
MERK: Oppvarmings- og trekkparametere som er angitt i trekkeprogrammet kan tilpasses og er avhengig av de ønskede innstillingene for eksperimentell design12. SJEKKPUNKT (se tilleggstabell S1). - Åpne den lukkede spissen ved å montere en av de lukkede mikropipettene som er anskaffet etter å ha trukket i mikropipettekutteren. Juster oppvarmingstemperaturen til ca. 50-60 °C.
- Finn mikropipetten ved hjelp av et 10x okular. Beveg mikropipetten nær borosilikatglassperlen ved å bruke knottene til justering.
- Bytt okularet til 30x før mikropipetten plasseres så nær borosilikatglassperlen som mulig uten å bøye pipettespissen.
- Myk opp borosilikatglassperlen ved å bruke varme ved å tråkke på varmepedalen. Sett den rå lukkede mikropipettespissen forsiktig inn i den mykgjorte dråpen til ønsket endepunkt, åpningsdiameteren, er nådd.
- Slipp fotpedalen og la glassperlen avkjøles. Forsikre deg om at spissen på mikropipetten alltid forblir inne i dråpen.
MERK: Hvis du setter inn spissen, fører det ytterligere til større åpningsdiametre. - Trekk forsiktig ut mikropipetten, noe som fører til et tydelig, rett kutt på den lukkede mikropipetten. Bekreft at kapillærens endelige diameter er 1 μm.
MERK: SJEKKPUNKT (se tilleggstabell S1)
4. Forberedelse av cellekammer
- Bruk en diamantblyant til å dele et standard glassdeksel på 40 mm x 22 mm x 0,17 mm i tre like strimler.
- Fest ett stykke av det kuttede glassdekselet til bunnen av en hjemmelaget kammerholder med vakuumfett.
MERK: Kammerholderen består av to metall (kobber / aluminium) firkanter som er forbundet med et buet håndtak. Avstanden mellom metallblokkene må spenne mindre enn 40 mm for at kuttdekselet skal feste seg til holderen for å danne et parallelt kammer. - Fest det andre stykket av det kuttede glassdekselet til toppen av den hjemmelagde kammerholderen med vakuumfett .
MERK: SJEKKPUNKT (se tilleggstabell S1) - Injiser 200 mikrol av den merkede RBC-suspensjonen mellom to dekkslipp ved hjelp av en 200 μL pipettekonon (figur 1).
Figur 1: Illustrasjon av cellekammeret. To kuttstykker av et 40 mm x 22 mm x 0,17 mm glassdeksel festes til kammerholderen ved hjelp av fett. Mellom de to kuttede glassdekslene blir ca. 200 μL av celleløsningen i Tyrodes buffer sådd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Montering av mikropipette aspirasjon
- Monter cellekammeret på holdertrinnet på mikroskopplattformen. Juster posisjonen slik at cellekammeret er rett over målet (figur 2B).
- Senk mikropipetteholderen til under væskenivået i det tilkoblede vannreservoaret.
- Injiser enten demineralisert vann eller Tyrodes buffer inn i den fabrikkerte mikropipetten og fjern forsiktig alle luftbobler med en sprøyte kombinert med en 34 G kanyle (se materialfortegnelsen).
- Skru løs enden av mikropipettholderen halvveis og la vannet dryppe fra mikropipettholderen i noen sekunder.
MERK: SJEKKPUNKT (se tilleggstabell S1) - Sett mikropipetten inn i holderspissen. Stram holderskruen for å sikre at mikropipetten sitter fast.
- Sett mikropipetten inn i cellekammeret og finn mikropipetten og RBC under mikroskopet. Bruk mikromanipulatoren til å justere posisjonen.
- Senk mikropipettespissen ytterligere for å sikre at spissen er i vater med den lokaliserte RBC-en.
MERK: SJEKKPUNKT (se tilleggstabell S1) - Null det hydrauliske trykket ved mikropipettespissen ved å justere høyden på vannbeholderen. Deretter øker du vannbeholderen litt for å generere et subtilt positivt trykk på spissen.
6. Utfør fluorescenskoblet mikropipetteaspirasjonsanalyse
- Slå på 488 nm fluorescerende eksitasjonslyskilde. Ikke slå på fluorescenslukkeren på dette stadiet for å unngå fotobleking (figur 2C). Slå på fluorescenskameraet og det overførte kameraet.
MERK: Begge kameraene betjenes med riktig programvare (se Materialfortegnelse). - Sett opp ønsket eksponeringstid (100 ms for begge kameraene i denne studien), interesseområde (ROI), binning size (ingen for denne studien) for begge kameraene i programvaren. Åpne det flerdimensjonale anskaffelsespanelet for å konfigurere anskaffelsesrammenummeret, 2,000 for denne studien og lagre katalogen.
MERK: Anskaffelsesrammenummeret er avhengig av ønsket antall aspirasjonshendelser som skal registreres. For 1 aspirasjonshendelse bør rekkevidden av anskaffelsesnummeret settes innenfor 100-500, som er omtrent 10-50 s. - Finn mikropipetten under synsfeltet ved hjelp av mikromanipulatoren.
- Slå på den pneumatiske trykkklemmen, inkludert kontrollboksen og klemmesystemet (figur 2A). Kontroller at kontrollboksen er i EXTRNL-modus. Kompenser eventuelt forskyvningstrykk inne i systemet ved å dreie knappen sakte.
- Slå på den separate programvaren som styrer den pneumatiske klemmen. Programvaren har et elektrisk kontrollpanel for å kontrollere den diskrete analoge inngangen til klemmesystemet. Trykket styres med en omregningsfaktor på 20 mV/mmHg.
- Null trykket inne i systemet. Flytt mikropipetten forsiktig nær RBC-ene. Juster vannbeholderens posisjon til et subtilt overtrykk merkes ved mikropipettespissen.
- Start oppkjøpet i kameraoperativsystemet. Slå på fluorescenslukkeren.
- Aspirer en RBC ved å skrive inn den beregnede spenningsstørrelsen i kontrollpanelet for å nå ønsket trykk.
MERK: Trykket for å aspirere en RBC er vanligvis i området Δp = -5 til -40 mmHg. Det skal være en merkbar tungeforlengelse innenfor mikropipettespissen (figur 2D). - Hold trykket i en forhåndsinnstilt periode; Slipp deretter trykket.
- Beveg mikropipetten for å hente neste celle og gjenta eksperimentet.
7. Analyse av fluorescensintensitet
- Last inn de lagrede fluorescensbildene i analyseprogramvaren.
- Juster intensitetsterskelen ved hjelp av skjermjusteringsfanen . Gjør dette ved enten å legge inn verdiene manuelt eller bruke glidebryteren for å sikre at fluorescensbildene viser en klar kontrast av cellen i analyseprogrammet (se tilleggsfil 1 - tilleggsfigur S1).
- Bla til tidslinjen nederst i programvaren. Finn den angitte aspirasjonshendelsen.
- Klikk på Legg til nye overflater. Definer analyseavkastningen.
MERK: Programvaren gir en guidet fem-trinns prosess for å justere og fullføre segmenteringen (se tilleggsfil 1-tilleggsfigur S2 og tilleggsfigur S3).
MERK: Hold avkastningen så liten som mulig for å spare beregningsressurser. - Bruk glidebryteren for bakgrunnssubtraksjon og juster segmenteringsterskelen ved hjelp av glidebryteren for å oppnå det beste segmenteringsresultatet.
MERK: Dette betyr at bortsett fra aspirasjonshendelsen, bør bakgrunnen segmenteres så nøyaktig som mulig (se tilleggsfil 1-tilleggsfigur S4 og tilleggsfigur S5). - Legg til et områdefilter for å ekskludere bakgrunnsstøy (se tilleggsfil 1 – tilleggsfigur S6).
MERK: Dette fullføres i etterbehandlingsfasen. - Velg kategorien Statistikk | Detaljert-fanen | Kategorien Gjennomsnittsverdier . Bla for å finne og velge intensitetsgjennomsnittet (se tilleggsfil 1 – tilleggsfigur S7).
- Eksporter fluorescenssignalsporet over tid til en .csv-fil.
- Åpne den eksporterte csv-filen. Trekk bakgrunnssignalene, Fb, fra alle målinger.
- Beregn kalsiumintensitetsendringen, ΔFmax, ved hjelp av ligning (1):
(1)
Hvor ΔFmax er den maksimale kalsiumintensitetsendringen, er Fb bakgrunnsintensiteten, og F0 er hvileintensiteten.
(1)
Figur 2: Fluorescenskoblet mikropipetteaspirasjonsmontering. (A) En oversikt over fMPA-maskinvaresystemet som inneholder det inverterte mikroskopet kombinert med lysfelt- og fluorescenskameraene. Venstre side av bildet viser det hjemmelagde vannmanometeret og kontrollboksen som gjør det mulig å justere trykket til den pneumatiske trykkpumpen nøyaktig. (B) Mikroskoptrinnet som viser eksperimentcellekammeret og mikromanipulatorsystemet med en enkelt mikropipette. (C) Skjematisk fremstilling av fMPA-systemoppsettet. Samtidig avbildning av lysfelt (gul) og fluorescens (blå utslipp, grønn eksitasjon) signaler ved hjelp av to dikroiske speil for å lede lysbanene fra fluorescenslyskilden (blå) til målet, deretter til kameraene for avbildning (grønn). (D) Den øverste raden viser lysfeltbildene, mens den nederste raden viser fluorescensbildene. Den venstre representerer mikropipettens posisjon før aspirasjon når RBC er i ro. Den midterste kolonnen øyeblikksbilder aspirasjonsprosessen der RBC opplever et undertrykk på -40 mmHg. Høyre skildrer cellemorfologien etter å ha opplevd det negative aspirasjonstrykket. Skala bar = 5 μm. Forkortelser: fMPA = Fluorescenskoblet mikropipetteaspirasjon; DM = dikroisk speil; RBC = røde blodlegemer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å etablere mikropipetteaspirasjonsanalyser konstruerte vi først et tilpasset cellekammer bestående av to metallfirkanter (kobber/aluminium) forbundet med et håndtak. To tredjekuttede glassdeksler (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) ble festet for å skape et kammer fylt med 200 μL RBC opphengt i Tyrodes buffer. Etter å ha introdusert RBC i kammeret, ble en skreddersydd borosilikatmikropipette festet på en holder og nøye plassert i kammeret ved hjelp av en mikromanipulator. Deretter ble mikropipetten brakt nærmere for å fange målet RBC.
For celleaspirasjon brukte metoden en pneumatisk høyhastighets trykkklemme for å finjustere det negative aspirasjonstrykket. Fluorescensavbildning ble deretter utført for å undersøke kalsiummobiliseringen ved de forskjellige negative aspirasjonstrykkene som ble brukt.
Ved å bruke fMPA til å undersøke hvordan RBC reagerer på varierende negativt aspirasjonstrykk, viser våre funn at det er et klart proporsjonalt forhold mellom det påførte negative trykket og kalsiuminnstrømningen som er tilstede i den aspirerte RBC. For å bestemme kalsiumintensitetsendringen ble den maksimale intensiteten til den enkle aspirerte cellen (Fmax) minus bakgrunnsintensiteten (Fb) delt på hvileintensiteten (F0) minus Fb. Det var en tilsvarende økning i tilstrømningen av kalsiumioner til RBC når trykket ble økt trinnvis mellom -10 mmHg (figur 3A) til -40 mmHg (figur 3D). Dette antyder at RBC har evnen til å oppfatte endringer i deres mekaniske og reagere ved raske kalsiumspesifikke kanalaktiviteter14,15.
Figur 3: Fluorescensavbildning med grafisk fremstilling av normaliserte intensitetsendringer mot tid. Horisontalt på tvers viser fluorescensbilder av RBC-ene i ro (venstre) og de menneskelige RBC-ene som aspireres av mikropipetten (midten). Representative spor av RBC som aspireres ved flere negative aspirasjonstrykk (Δp) kan ses til høyre. Det negative aspirasjonstrykket økes trinnvis, og starter ved (A) Δp = -10 mmHg, (B) Δp = -20 mmHg, (C) Δp = -30 mmHg og (D) Δp = -40 mmHg. Når tungen til RBC er langstrakt under aspirasjon, kan en signifikant kalsiummobilisering observeres som vist ved den økte Cal-520 AM-foldendringen. F/F0 ble brukt til å undersøke kalsiummobiliseringen inne i aspirert RBC. Fra kurvene ovenfor viste den observerte trenden at Cal-520 AM-signalet økte proporsjonalt med økningen av det påførte negative aspirasjonstrykket. Skala bar = 5 μm. Forkortelse: RBC = røde blodlegemer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell S1: Kontrollpunkter for kritiske trinn i fMPA-forberedelsesprotokollene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: En veiledet prosess for å justere og utføre segmentering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikropipetteaspirasjonsanalyser legemliggjør en raffinert metodikk, som anvender betydelig trykkmodulering, nøyaktig romlig orkestrering og pålitelig tidsmessig dømmekraft for å undersøke de dype vanskelighetene med cellulær biomekanikk. Denne studien legger særlig vekt på anvendelsen av fMPA som et avgjørende verktøy for å avdekke de nyanserte mekanosensitive responsene som vises av RBC under varierende stimuli. Samtidig bruk av lysfelt- og fluorescenssignaler muliggjorde en mangefasettert utforskning av cellulære fenomener, og fremmet overvåking og deteksjon av intracellulær kalsiuminnstrømning i sanntid. Denne tilnærmingen gir en integrert innsikt i de komplekse mekanosenserende reaksjonene til RBC.
Det er viktig at anvendeligheten av fMPA-teknikken strekker seg utover RBC, da den kan brukes med andre celletyper som ikke bruker høy mekanisk følsomhet, som blodplater og nevroner9. Videre, på grunn av sin minimale innvirkning på celleintegritet under eksperimentell håndtering, garanterer fMPA bevaring av cellens naturlige tilstand, noe som gjør den svært egnet for bruk med primære celler1. Videre tilbyr fMPA-metoden allsidighet gjennom den justerbare geometrien til mikropipettene, noe som muliggjør et bredere spekter av eksperimentelle design skreddersydd for spesifikke forskningsspørsmål og effektiv utforskning av ulike mekaniske forhold.
I tillegg, med forbedringen i den optiske banen som forbedrer samtidig bruk av multifluorescensavbildning, tillater fMPA-systemet sanntidsdeteksjon av intracellulær kalsiumkonsentrasjon ved aspirasjon. Denne evnen åpner en mulighet til å utforske kalsiumrelaterte molekyler, for eksempel den mekanosensitive ionkanalen, PIEZO1, som har vist seg å formidle og oppfatte mekaniske signaler fra de ytre miljøene 7,14. Nyere litteratur fremhever en økning i membranspenning som en signifikant faktor som stimulerer PIEZO1-kanalaktiviteten, og deretter letter Ca2+-tilstrømningen6. Dette understreker en avgjørende anvendelse av fMPA, som er å undersøke samspillet mellom membranspenning, PIEZO1 og kalsiuminnstrømning, og kaste lys over de intrikate mekanosenseringsprosessene i celler.
Fra et teknisk perspektiv er det verdt å nevne at de to primære komponentene i fMPA-systemet, som er ansvarlige for å generere aspirasjonskraften (mekaniske stimuli) og gjennomføre sanntids fluorescensavbildning, er henholdsvis den pneumatiske trykkpumpen og fluorescenskameraet. Valget av riktig pumpe og kamera for systemet bør baseres på den spesifikke celletypen og biologiske prosessen som studeres. Pumpen som brukes i systemet vårt, opererer innenfor et stabilt trykkområde på ± 200 mmHg og kan svare på kommandoer for trykkendringer så betydelige som ± 200 mmHg. Trykkstigningstiden og falltiden bør ikke overstige 6-8 ms for et 20 mmHg trinn og 15-20 ms for et 200 mmHg trinn. For å sikre kraftoppløsning bør støynivået til HSPC-systemet være mindre enn ± 0,5 mmHg, peak-to-peak. Disse kravene brukes i dette oppsettet. Imidlertid er et område på ± 40 mmHg tilstrekkelig til å oppnå et svar for den eksperimentelle protokollen15. Når det gjelder fluorescenskameraet, valgte vi å ha en 95% kvanteeffektivitet og en 11 μm x 11 μm pikselstørrelsesbrikke. Denne følsomme sensorkonfigurasjonen fanger effektivt fluorescenssignalet ved høy hastighet. I tillegg er det avgjørende å opprettholde en median lesestøy på 1,6e- for et tilstrekkelig signal-støy-forhold under avbildning16.
Fra et prosessuelt perspektiv krever utførelse av fMPA et sett med avanserte ferdigheter. For eksempel krever det presisjon og fingerferdighet å lage mikropipetter ved hjelp av mikropipettekutteren, sammen med grundig kontroll av temperatur og posisjonering. Plassering av mikropipetten innenfor mikroskopets synsfelt krever grundig innsats for å unngå skade på både mikropipettespissen og cellekammeret. I tillegg er en vanlig utfordring forbundet med fluorescensavbildning fotobleking. For å redusere dette problemet er det viktig å minimere prøvens eksponeringstid for belysningssystemet. Med henvisning til protokollen "fluorescenskoblet mikropipetteaspirasjonsanalyse", forblir fluorescenslukkeren til eksitasjonslyskilden slått av til alle parametere er lagt inn gjennom kamerabetjeningsprogramvaren og aspirasjonssystemet er klart for eksperimenter. Først da slås fluorescenslukkeren på for å starte avbildningen. For å redusere fotoblekingen ytterligere, anbefales det å bruke den minste lyskildeintensiteten som fortsatt gir tilstrekkelig fluorescensuttrykk i prøven.
Videre gjør den nåværende manuelle operasjonen som kreves for fMPA-analyser denne teknikken arbeidskrevende. Følgelig stammer inkonsekvensene som kan oppstå i denne analysen primært fra operatøravhengige variabler, samt faktorene forbundet med variasjoner i filamentforvarming og kapillærglassegenskaper. I fremtiden krever optimalisering av ytelsen til denne teknikken å vurdere potensielle tandemimplementeringer. For eksempel, når det kombineres med mikrofluidiske enheter, kan mikropipettaspirasjonen transformeres til en plattform med høy gjennomstrømning, noe som øker eksperimentell hastighet betydelig fra å studere rundt 20 celler per time til ca. 1000 celler / t17,18. Denne innlemmelsen forbedrer også reproduserbarheten til dataene. Videre har visse veier blitt utforsket med hell ved å innlemme automatiserings- og bildeanalysesystemer19. Spesielt er endelig elementanalyse (FEA) et beregningsverktøy som vanligvis brukes til å modellere mikropipetteaspirasjonsanalyser. FEA kan forutsi den cellulære responsen på mekaniske stimuli og karakterisere deres mekaniske egenskaper. Det har potensial til å optimalisere mikropipettdesignen og ytterligere validere de eksperimentelle resultatene19.
Avslutningsvis gir fMPA-tilnærmingen verdifull innsikt i den mekanosensitive oppførselen til RBC i å reagere på mekaniske stimuli. Denne studien etablerer et grunnleggende rammeverk for fremtidige undersøkelser av de intrikate mekanismene for mekanotransduksjon innen RBC og på tvers av bredere biologiske systemer. Slike henvendelser holder stort løfte om å fremme vår forståelse av disse mekanismene og unraveling deres omfattende implikasjoner i ulike fysiologiske sammenhenger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser å rapportere om denne studien.
Acknowledgments
Vi takker Nurul Aisha Zainal Abidin og Laura Moldovan for ytterligere giverrekruttering, blodinnsamling og flebotomistøtte. Vi takker Tomas Anderson og Arian Nasser for organiseringen av utstyret og reagensene. Denne forskningen ble finansiert av Australian Research Council (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. AJ); National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australia Ideas Grant (APP2003904-L. AJ); NHMRC Utstyr Grant-LAJ; NSW kardiovaskulær kapasitetsbyggingsprogram (tidlig midtkarriereforsker Grant-LAVJ); NSW CVRN-VCCRI Forskningsinnovasjonsstipend; Office of Global and Research Engagement (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-LAKE); L.A.J. er en National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2 (105863), og en Snow Medical Research Foundation Fellow (2022SF176).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µManager | Micro-Manager | Version 2.0.0 | |
| 1 mL Syringe | Terumo | 210320D | Cooperate with the Microfil |
| 200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | Red clood cell preparation |
| 22 x 40 mm Cover Slips | Knittel Glass | MS0014 | Cell chamber assembly |
| 50 mL Syringe | Terumo | 220617E | Connect to the water tower |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000280 | Red clood cell preparation |
| Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL |
| DAQami | Diligent | ||
| Fluorescence light source | CoolLED | pE-300 | Micropipette aspiration hardware system |
| Glass capillary | Narishige | G-1 | Micropipette manufacture |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| High speed GigE camera | Manta | G-040B | Micropipette aspiration hardware system |
| High speed pressure clamp | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
| High speed pressure clamp head stage | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
| Imaris | Oxford Instruments | ||
| Inverted Microscopy | Olympus | Olympus IX83 | Micropipette aspiration hardware system |
| Microfil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip |
| Micropipette Puller | Sutter instrument | P1000 | Micropipette manufacture |
| Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation |
| Pipette microforge | Narishige | MF-900 | Micropipette manufacture |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Pressue Pump | Scientific Instrument | PV-PUMP | Induce controlled pressure during experiment |
| Prime 95B Camera | Photometrics | Prime 95B sCMOS | Flourscent imaging |
| Rotary wheel remote unit | Sensapex | uM-RM3 | Control panel for micropipette position adjustment |
| Scepter 3.0 Handheld Cell Counter | Merck Millipore | PHCC340KIT | Automatic cell counter |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) |
Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Touch screen control unit | Sensapex | uM-TSC | Control panel for micropipette position adjustment |
| X dry Objective | Olympus | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | Micropipette aspiration hardware system |
References
- González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
- Mierke, C. T. Physics of Cancer, Volume 3 (Second Edition): Experimental biophysical techniques in cancer research. , IOP Publishing. (2021).
- Chen, Y., et al. Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling. Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).
- Shin, J. -W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).
- Liapis, H., Foster, K., Miner, J. H. Red cell traverse through thin glomerular basement membrane. Kidney International. 61 (2), 762-763 (2002).
- Wang, H., et al. Fluorescence-coupled micropipette aspiration assay to examine calcium mobilization caused by red blood cell mechanosensing. European Biophysics Journal. 51 (2), 135-146 (2022).
- Danielczok, J. G., et al. Red blood cell passage of small capillaries is associated with transient Ca2+-mediated adaptations. Frontiers in Physiology. 8, 979 (2017).
- Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -T., Suresh, S. Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease. MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).
- Maître, J. -L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. eLife. 5, e15447 (2016).
- Bogdanova, A., Makhro, A., Wang, J., Lipp, P., Kaestner, L. Calcium in red blood cells-a perilous balance. International Journal of Molecular Sciences. 14 (5), 9848-9872 (2013).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018. , Available from: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf (2018).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Sforna, L., et al. Piezo1 controls cell volume and migration by modulating swelling-activated chloride current through Ca2+ influx. Journal of Cellular Physiology. 237 (3), 1857-1870 (2022).
- High speed pressure clamp. ALA Scientific Instruments. , ALA Scientific. Available from: https://alascience.com/products/hspc-2sb/ (2023).
- Teledyne Imaging Prime 95BTM Scientific CMOS Camera Datasheet. , Available from: https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf (2020).
- Lee, L. M., Lee, J. W., Chase, D., Gebrezgiabhier, D., Liu, A. P. Development of an advanced microfluidic micropipette aspiration device for single cell mechanics studies. Biomicrofluidics. 10 (5), 054105 (2016).
- Weaver, W. M., et al.
- Zhou, E. H., Lim, C. T., Quek, S. T. Finite element simulation of the micropipette aspiration of a living cell undergoing large viscoelastic deformation. Mechanics of Advanced Materials and Structures. 12 (6), 501-512 (2005).
- Oh, M. -J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness. Journal of Visualized Experiments. (67), e3886 (2012).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. Biophysical journal. 4 (4), 303-316 (1964).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European Physical Journal E. 14 (2), 149-167 (2004).
- Hochmuth, R. M.
- Pu, H., et al. Micropipette aspiration of single cells for both mechanical and electrical characterization. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (11), 3185-3191 (2019).
- Guevorkian, K., Maître, J. -L. Chapter 10 - Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods in Cell Biology. , 187-201 (2017).
- Biro, M., Maître, J. -L. Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion. Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).
