Summary
A exploração do comportamento celular sob estresse mecânico é fundamental para avanços na mecânica celular e mecanobiologia. Apresentamos a técnica de Fluorescence Micropipeette Aspiration (fMPA), um novo método que combina estimulação mecânica controlada com análise abrangente da sinalização intracelular em células únicas. Esta técnica investiga novos estudos aprofundados da mecanobiologia de células vivas.
Abstract
Os ensaios de aspiração por micropipetas têm sido uma pedra angular para a investigação da mecânica de células vivas, oferecendo informações sobre as respostas celulares ao estresse mecânico. Este trabalho detalha uma adaptação inovadora do ensaio de aspiração por micropipeta acoplada à fluorescência (fMPA). O ensaio de fMPA introduz a capacidade de administrar forças mecânicas precisas enquanto monitora simultaneamente os processos de mecanotransdução de células vivas mediados por canais iônicos. A configuração sofisticada incorpora uma micropipeta de vidro borossilicato projetada com precisão conectada a um reservatório de água finamente regulado e sistema de aspiração pneumática, facilitando a aplicação de pressão controlada com incrementos tão refinados quanto ± 1 mmHg. Um aumento significativo é a integração da imagem de epifluorescência, permitindo a observação e quantificação simultâneas das alterações morfológicas celulares e dos fluxos intracelulares de cálcio durante a aspiração. O ensaio de fMPA, através de sua combinação sinérgica de imagens de epifluorescência com aspiração por micropipeta, estabelece um novo padrão para o estudo da mecanosensing celular em ambientes mecanicamente desafiadores. Esta abordagem multifacetada é adaptável a vários arranjos experimentais, fornecendo insights críticos sobre os mecanismos de mecanosensing de célula única.
Introduction
Os desdobramentos das descobertas no mundo dos comportamentos celulares têm acentuado o papel de estímulos mecânicos, como tensão, tensão de cisalhamento de fluidos, compressão e rigidez do substrato, em ditar atividades celulares dinâmicas, como adesão, migração e diferenciação. Esses aspectos mecanobiológicos são de suma importância na elucidação de como as células interagem e respondem a seus ambientes fisiológicos, impactando diversos processos biológicos 1,2.
Na última década, ensaios de aspiração baseados em micropipetas têm se destacado como uma ferramenta versátil no estudo de diversas respostas celulares a estímulos mecânicos. Esta técnica oferece informações valiosas sobre as propriedades mecânicas intrínsecas de células vivas em nível de célula única, incluindo módulo elástico celular, rigidez e tensão cortical. Esses ensaios permitem a mensuração de vários parâmetros mecânicos, como tensão da membrana celular, pressão exercida sobre a membrana celular e tensão cortical (resumidos na Tabela 1). O estudo das forças aspiracionais enriqueceu nossa compreensão de como elas influenciam as funções e os processos celulares, particularmente no âmbito da dinâmica da membrana, incluindo fragmentação, alongamento e brotamento 3,4.
| Parâmetro mecânico | Descrição | Abordagens seminais |
| Rigidez Celular | Medição da rigidez mecânica e elasticidade de uma célula. | Aspiração da membrana celular e análise da resposta da deformação à pressão negativa20,21. |
| Força de Adesão | Avaliação da aderência das células às superfícies. | Aplicação de sucção controlada para desprender as células aderidas de um substrato2,22. |
| Tensão da membrana | Avaliação da tensão ou estresse dentro das membranas celulares. | Medida da deformação da membrana em resposta à pressão aplicada23,24. |
| Propriedades viscoelásticas | Caracterização do comportamento viscoso e elástico combinado de uma célula. | Análise da resposta tempo-dependente da deformação à aspiração23,25. |
| Deformabilidade | Determinação da facilidade com que uma célula pode mudar de forma. | Avaliação da extensão da deformação sob sucção controlada20,24. |
| Tensão superficial | Medição da tensão na superfície da célula. | Avaliação da pressão necessária para formar uma protrusão da membrana da micropipeta26. |
| Interação Célula-Material | Estudo de interações entre células e materiais ou substratos. | Aspiração de células em contato com diferentes materiais e observação de interações2,24. |
| Interação célula-célula | Exame de interações entre células vizinhas. | Aspiração de um grupo de células e análise de suas forças intercelulares27. |
Tabela 1: Parâmetros mecânicos caracterizados pelo ensaio de aspiração por micropipeta.
A técnica de aspiração por micropipeta tem sido amplamente utilizada no estudo das hemácias, avaliando a deformabilidade e as diversas características mecânicas das hemácias, o que é essencial para o entendimento de sua função no sistema circulatório. As hemácias apresentam notável adaptabilidade, preservando sua versatilidade mecânica contra deformações ao navegar pela intrincada rede capilar e fendas interendoteliais 5,6. Durante esse trajeto, as hemácias devem atravessar passagens tão estreitas quanto 0,5-1,0 μm, sujeitando-se a uma infinidade de forças mecânicas, incluindo tensão e compressão 7,8,9. Também apresentam alta sensibilidade ao estresse de cisalhamento gerado pelo fluxo sanguíneo durante a circulação10. Esses processos promovem a ativação de mecanismos regulatórios envolvendo o influxo de cálcio, um evento sinalizador crucial com papéis bem estabelecidos nas respostas celulares a estímulos mecânicos11,12. Os complexos mecanismos que governam a mecanosensing mediada por cálcio permanecem como temas de investigação em andamento.
Nesse contexto, o fMPA apresenta-se como uma abordagem eficaz para revelar a extensão da mobilização de cálcio sob forças mecânicas precisamente controladas, permitindo a aplicação simultânea de modulação mecânica (usando o sistema de aspiração de micropipetas) e visualização da intensidade de cálcio (usando indicadores fluorescentes). Ele imita particularmente o cenário fisiológico quando o eritrócito viaja através do estreitamento dos vasos sanguíneos. Vale ressaltar que o sistema fMPA que desenvolvemos pode gerar pressão com resolução de 1 mmHg. A câmera de alta velocidade implementada pode alcançar uma resolução temporal de 100 ms e uma resolução espacial no nível de submícrons. Essas configurações garantem a aplicação precisa de forças mecânicas às células vivas e, simultaneamente, capturam a sinalização celular resultante. Além disso, devido à natureza de engenharia integrativa deste setup, o ensaio de aspiração de micropipetas pode ser prontamente adaptado para complementar outros equipamentos ou técnicas, permitindo uma maior exploração dos meandros da mecânica celular. Essa versatilidade é uma vantagem adicional dessa abordagem.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade de Sydney. Consentimento informado foi obtido dos doadores para este estudo.
1. Isolamento de hemácias humanas
OBS: A etapa 1.1 deve ser realizada por flebotomista treinado, utilizando protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição.
- Retirar 5 ml de sangue da veia cubital mediana utilizando uma agulha de borboleta de 19 G.
- Transferir o sangue coletado para um tubo de 15 mL contendo 1:200 enoxaparina para evitar a coagulação.
- Diluir 5 μL de sangue anticoagulado com enoxaparina em 1 mL de tampão carbonato/bicarbonato (tampão C, pH = 8,5-9; Tabela de Materiais).
- Centrifugar a amostra de sangue diluído a 900 × g por 1 min para sedimentar as hemácias. Decantar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet.
- Realizar duas lavagens do pellet de hemácias com 1 mL de tampão C (Tabela de Materiais), centrifugando cada vez a 900 × g por 1 min.
- Em seguida, lavar o pellet de RBC 2x com 1 mL de tampão de Tyrode usando as mesmas condições de centrifugação e, em seguida, ressuspender o pellet final em 1 mL de tampão de Tyrode para obter a suspensão de RBC de caldo lavado.
2. Carregamento do indicador de cálcio
- Ajustar a concentração da solução de hemácias de material lavado para 10 × 106 células/mL no tampão de Tyrode, com base na contagem de células obtida usando um contador automático de células (Tabela de Materiais).
- Rotular o cálcio dentro das hemácias incubando com 16,67 μM Cal-520 AM, um corante sensível ao cálcio, enquanto agita em um misturador de tubo rotativo por 1 h.
- Diluir as hemácias em tampão Tyrode contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) na proporção de 1:50. As células estão agora prontas para uso experimental.
3. Fabricação de micropipetas
- Monte o tubo capilar de vidro borossilicato (1 mm de diâmetro externo x 0,6 mm de diâmetro interno) no extrator de micropipeta P-1000 para produzir duas micropipetas correspondentes com pontas fechadas no local de tração usando o programa de tração predefinido. Para essa configuração, use os seguintes valores de programa de tração: calor 516, tração 150, velocidade 75, tempo 250 e pressão 500.
NOTA: Os parâmetros de aquecimento e tração definidos no programa de tração podem ser personalizados e dependem das configurações desejadas do planejamento experimental12. CHECKPOINT (ver Tabela Suplementar S1). - Abra a ponta fechada montando uma das micropipetas fechadas obtidas após puxar o cortador de micropipetas. Ajuste a temperatura de aquecimento para aproximadamente 50-60 °C.
- Localize a micropipeta usando uma ocular de 10x. Mova a micropipeta para perto do talão de vidro borossilicato usando os botões para ajuste.
- Mude a ocular para 30x antes de posicionar a micropipeta o mais próximo possível do talão de vidro borossilicato sem dobrar a ponta da pipeta.
- Suavize o talão de vidro borossilicato usando calor pisando no pedal de aquecimento. Insira suavemente a ponta da micropipeta fechada crua no talão amolecido até que o ponto final desejado, o diâmetro de abertura, tenha sido atingido.
- Solte o pedal e deixe o talão de vidro esfriar. Certifique-se de que a ponta da micropipeta permaneça sempre dentro do talão.
NOTA: Inserir a ponta ainda leva a maiores diâmetros de abertura. - Extraia suavemente a micropipeta, levando a um corte reto claro na micropipeta fechada. Confirme se o diâmetro final do capilar é de 1 μm.
NOTA: CHECKPOINT (consulte a Tabela Suplementar S1)
4. Preparação da câmara celular
- Use um lápis de diamante para dividir uma tampa de vidro padrão de 40 mm x 22 mm x 0,17 mm em três tiras iguais.
- Adera um pedaço da tampa de vidro cortada ao fundo de um suporte de câmara caseiro com graxa a vácuo.
NOTA: O suporte da câmara é composto por dois quadrados de metal (cobre/alumínio) que estão ligados por uma alça curva. A distância entre os blocos metálicos deve ser inferior a 40 mm para que a lamínula cortada grude no suporte forme uma câmara paralela. - Adera a segunda peça da tampa de vidro cortada à parte superior do suporte de câmara caseiro com graxa a vácuo.
NOTA: CHECKPOINT (consulte a Tabela Suplementar S1) - Injetar 200 μL da suspensão de hemácias marcadas entre duas lamínulas usando uma pistola de pipeta de 200 μL (Figura 1).
Figura 1: Ilustração da câmara celular. Duas peças cortadas de uma tampa de vidro de 40 mm x 22 mm x 0,17 mm são aderidas ao suporte da câmara usando graxa. Entre as duas lamínulas de vidro cortadas, aproximadamente 200 μL da solução celular no tampão de Tyrode é semeado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Conjunto de aspiração da micropipeta
- Monte a câmara celular no estágio do suporte presente na plataforma do microscópio. Ajuste a posição para que a câmara celular fique diretamente acima da objetiva (Figura 2B).
- Abaixe o suporte da micropipeta para abaixo do nível de fluido do reservatório de água conectado.
- Injete água desmineralizada ou tampão de Tyrode na micropipeta fabricada e remova cuidadosamente todas as bolhas de ar usando uma seringa acoplada a uma agulha de 34 G (consulte a Tabela de Materiais).
- Desparafuse a extremidade do suporte da micropipeta até a metade e deixe a água escorrer do suporte da micropipeta por alguns segundos.
NOTA: CHECKPOINT (consulte a Tabela Suplementar S1) - Insira a micropipeta na ponta do suporte. Aperte o parafuso do suporte para garantir que a micropipeta seja fixada.
- Insira a micropipeta na câmara celular e localize a micropipeta e as hemácias sob o microscópio. Use o micromanipulador para ajustar a posição.
- Abaixe ainda mais a ponta da micropipeta para garantir que a ponta esteja nivelada com o RBC localizado.
NOTA: CHECKPOINT (consulte a Tabela Suplementar S1) - Zere a pressão hidráulica na ponta da micropipeta ajustando a altura do reservatório de água. Em seguida, eleve levemente o reservatório de água para gerar uma pressão positiva sutil na ponta.
6. Realizar o ensaio de aspiração por micropipeta acoplada à fluorescência
- Ligue a fonte de luz de excitação fluorescente de 488 nm. Não ligue o obturador de fluorescência nesta fase para evitar o fotoclareamento (Figura 2C). Ligue a câmera de fluorescência e a câmera transmitida.
NOTA: Ambas as câmeras são operadas usando o software apropriado (consulte a Tabela de Materiais). - Definir o tempo de exposição desejado (100 ms para ambas as câmeras neste estudo), região de interesse (ROI), tamanho do binning (nenhum para este estudo) para ambas as câmeras no software. Abra o painel de aquisição multidimensional para configurar o número do quadro de aquisição, 2.000 para este estudo, e o diretório de salvamento.
Observação : o número de quadro de aquisição é dependente do número desejado de eventos de aspiração que devem ser registrados. Para 1 evento de aspiração, o intervalo do número de aquisição deve ser definido dentro de 100-500, que é de aproximadamente 10-50 s. - Encontre a micropipeta sob o campo de visão usando o micromanipulador.
- Ligue a pinça de pressão pneumática, incluindo a caixa de controle e o sistema de fixação (Figura 2A). Verifique se a caixa de controle está no modo EXTRNL. Compense qualquer pressão de deslocamento dentro do sistema girando lentamente o botão.
- Ligue o software separado que controla a braçadeira pneumática. O software possui um painel de controle elétrico para controlar a entrada analógica discreta para o sistema de grampo. A pressão é controlada com um fator de conversão de 20 mV/mmHg.
- Zerar a pressão dentro do sistema. Ajuste cuidadosamente a micropipeta perto das hemácias. Ajuste a posição do reservatório de água até que uma pressão positiva sutil seja notada na ponta da micropipeta.
- Inicie a aquisição no software operacional da câmera. Ligue o obturador de fluorescência.
- Aspirar um RBC digitando a magnitude da tensão calculada no painel de controle para atingir a pressão desejada.
NOTA: A pressão para aspirar um eritrocitário está tipicamente na faixa de Δp = -5 a -40 mmHg. Deve haver um alongamento de língua perceptível dentro da ponta da micropipeta (Figura 2D). - Segure a pressão por um período predefinido; Em seguida, libere a pressão.
- Mova a micropipeta para pegar a próxima célula e repita o experimento.
7. Análise da intensidade da fluorescência
- Carregue as imagens de fluorescência salvas no software de análise.
- Ajuste o limite de intensidade usando a guia de ajuste de exibição . Faça isso inserindo manualmente os valores ou usando o controle deslizante para garantir que as imagens de fluorescência mostrem um contraste claro da célula no software de análise (consulte Arquivo Suplementar 1-Figura Suplementar S1).
- Role até a linha do tempo na parte inferior do software. Localize o evento de aspiração designado.
- Clique em Adicionar novas superfícies. Defina o ROI da análise.
NOTA: O software fornece um processo guiado de cinco etapas para ajustar e concluir a segmentação (consulte Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3).
NOTA: Mantenha o ROI o menor possível para economizar recursos computacionais. - Use o controle deslizante de subtração em segundo plano e ajuste o limite de segmentação usando o controle deslizante para obter o melhor resultado de segmentação.
NOTA: Isso significa que, além do evento de aspiração, o plano de fundo deve ser segmentado com a maior precisão possível (consulte Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar S4 e Figura Suplementar S5). - Adicione um filtro de área para excluir ruídos de fundo (consulte Arquivo suplementar 1-Figura suplementar S6).
Observação : isso é concluído no estágio de pós-processo. - Selecione a guia estatísticas | guia detalhada | guia Valores médios . Role para localizar e selecionar a média de intensidade (consulte Arquivo Suplementar 1 – Figura Suplementar S7).
- Exporte o rastreamento de sinal de fluorescência ao longo do tempo para um arquivo .csv.
- Abra o arquivo csv exportado. Subtrair os sinais de fundo, Fb, de todas as medições.
- Calcular a variação da intensidade do cálcio, ΔFmáx, usando a equação (1):
(1º)
Onde ΔFmax é a mudança máxima da intensidade de cálcio, Fb é a intensidade de fundo e F0 é a intensidade de repouso.
(1º)
Figura 2: Conjunto de aspiração de micropipetas acopladas a fluorescência. (A) Uma visão geral do sistema de hardware fMPA incorporando o microscópio invertido combinado com as câmeras de campo brilhante e fluorescência. O lado esquerdo da imagem mostra o manômetro de água caseiro e a caixa de controle que permite ajustar com precisão a pressão da bomba de pressão pneumática. (B) A etapa do microscópio representando a câmara celular do experimento e o sistema micromanipulador com uma única micropipeta. (C) Esquema da configuração do sistema fMPA. Imagem simultânea de sinais de campo brilhante (amarelo) e fluorescência (emissão azul, excitação verde) utilizando dois espelhos dicroicos para direcionar os caminhos da luz da fonte de luz de fluorescência (azul) para o alvo, em seguida, para as câmeras para aquisição de imagens (verde). (D) A linha superior representa as imagens de campo brilhante, enquanto a linha inferior demonstra as imagens de fluorescência. A esquerda representa a posição da micropipeta antes da aspiração quando o CH está em repouso. A coluna do meio retrata o processo de aspiração onde o eritrocitário experimenta uma pressão negativa de -40 mmHg. A direita representa a morfologia celular após experimentar a pressão negativa de aspiração. Barra de escala = 5 μm. Abreviações: fMPA = Fluorescence-coupled Micropipeette Aspiration; DM = espelho dicroico; Hematácias = hemácias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Para estabelecer ensaios de aspiração por micropipeta, construímos primeiramente uma câmara celular personalizada composta por dois quadrados metálicos (cobre/alumínio) conectados por uma alça. Duas lamínulas de vidro de terceiro corte (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) foram afixadas para criar uma câmara preenchida com 200 μL de hemácias suspensas no tampão de Tyrode. Depois de introduzir hemácias na câmara, uma micropipeta de borossilicato sob medida foi fixada em um suporte e cuidadosamente posicionada dentro da câmara usando um micromanipulador. Posteriormente, a micropipeta foi aproximada para capturar a hemácia alvo.
Para a aspiração celular, o método utilizou uma pinça pneumática de alta velocidade para ajustar a pressão negativa de aspiração. A imagem de fluorescência foi então realizada para investigar a mobilização de cálcio nas diferentes pressões negativas de aspiração aplicadas.
Usando o fMPA para investigar como as hemácias respondem a pressões de aspiração negativas variáveis, nossos achados revelam que há uma clara relação proporcional entre a pressão negativa aplicada e o influxo de cálcio presente na hemácia aspirada. Para determinar a mudança na intensidade do cálcio, a intensidade máxima da célula aspirada (Fmax) menos a intensidade de fundo (Fb) foi dividida pela intensidade de repouso (F0) menos Fb. Houve um aumento correspondente no influxo de íons cálcio para as hemácias quando a pressão foi incrementalmente aumentada entre -10 mmHg (Figura 3A) a -40 mmHg (Figura 3D). Isso sugere que as hemácias possuem a capacidade de detectar mudanças em sua mecânica e responder por atividades rápidas de canais específicos de cálcio14,15.
Figura 3: Imagem de fluorescência com representação gráfica das mudanças de intensidade normalizadas em relação ao tempo. Horizontalmente através mostra instantâneos de fluorescência das hemácias em repouso (esquerda) e as hemácias humanas sendo aspiradas pela micropipeta (meio). Traços representativos das hemácias sendo aspiradas em múltiplas pressões negativas de aspiração (Δp) podem ser vistos à direita. A pressão de aspiração negativa é aumentada gradualmente, iniciando-se em (A) Δp = -10 mmHg, (B) Δp = -20 mmHg, (C) Δp = -30 mmHg e (D) Δp = -40 mmHg. Quando a língua da hemácia é alongada durante a aspiração, uma mobilização significativa de cálcio pode ser observada, como mostrado pelo aumento da alteração da prega Cal-520 AM. F/F0 foi utilizado para investigar a mobilização de cálcio no interior da hemácia aspirada. A partir das curvas acima, a tendência observada demonstrou que o sinal Cal-520 AM aumentou proporcionalmente com o aumento da pressão de aspiração negativa aplicada. Barra de escala = 5 μm. Abreviação: Hemácias = hemácias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela suplementar S1: Pontos de verificação para etapas críticas nos protocolos de preparação do fMPA. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: Um processo guiado para ajustar e executar a segmentação. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Os ensaios de aspiração de micropipetas incorporam uma metodologia refinada, empregando modulação de pressão substancial, orquestração espacial exata e discernimento temporal confiável para sondar os meandros profundos da biomecânica celular. Este estudo coloca ênfase particular na aplicação de fMPA como uma ferramenta crucial para desvendar as respostas mecanossensíveis nuançadas apresentadas por eritrócitos sob estímulos variados. O uso concomitante de sinais de campo claro e fluorescência possibilitou uma exploração multifacetada dos fenômenos celulares, avançando no monitoramento e detecção do influxo intracelular de cálcio em tempo real. Esta abordagem fornece uma visão integrativa sobre as complexas reações mecanosensing das hemácias.
É importante ressaltar que a aplicabilidade da técnica de fMPA vai além das hemácias, pois pode ser empregada com outros tipos celulares que desaplicam alta sensibilidade mecânica, como plaquetas eneurônios9. Além disso, devido ao seu mínimo impacto na integridade celular durante o manuseio experimental, o fMPA garante a preservação do estado natural da célula, tornando-a altamente adequada para uso com célulasprimárias1. Além disso, o método fMPA oferece versatilidade através da geometria ajustável das micropipetas, permitindo uma gama mais ampla de projetos experimentais adaptados a questões específicas de pesquisa e a exploração efetiva de várias condições mecânicas.
Além disso, com o aprimoramento da via óptica que aumenta o uso simultâneo de imagens de multifluorescência, o sistema fMPA permite a detecção em tempo real da concentração de cálcio intracelular na aspiração. Essa capacidade abre uma oportunidade para explorar moléculas relacionadas ao cálcio, como o canal iônico mecanossensível, PIEZO1, que demonstrou mediar e perceber pistas mecânicas do ambiente externo 7,14. A literatura recente destaca o aumento da tensão da membrana como um fator significativo estimulador da atividade do canal PIEZO1, facilitando posteriormente o influxo de Ca2+ 6. Isso ressalta uma aplicação crucial do fMPA, que é investigar a interação entre tensão de membrana, PIEZO1 e influxo de cálcio, lançando luz sobre os intrincados processos mecanosensing dentro das células.
Do ponto de vista técnico, vale ressaltar que os dois principais componentes do sistema fMPA, responsáveis por gerar a força de aspiração (estímulos mecânicos) e conduzir imagens de fluorescência em tempo real, são a bomba de pressão pneumática e a câmera de fluorescência, respectivamente. A seleção da bomba e da câmera apropriadas para o sistema deve ser baseada no tipo de célula específica e no processo biológico em estudo. A bomba empregada em nosso sistema opera dentro de uma faixa de pressão de estado estacionário de ± 200 mmHg e pode responder a comandos para mudanças de pressão tão significativas quanto ± 200 mmHg. O tempo de elevação e queda da pressão não deve exceder 6-8 ms para um passo de 20 mmHg e 15-20 ms para um passo de 200 mmHg. Para garantir a resolução da força, o nível de ruído do sistema HSPC deve ser menor que ± 0,5 mmHg, pico-a-pico. Esses requisitos são aplicados nesta configuração; entretanto, uma faixa de ± 40 mmHg é suficiente para obter uma resposta para o protocolo experimental15. Em relação à câmera de fluorescência, selecionamos características de 95% de eficiência quântica e um chip de tamanho de pixel de 11 μm x 11 μm. Esta configuração de sensor sensível captura eficientemente o sinal de fluorescência em alta velocidade. Além disso, é crucial manter uma mediana de ruído de leitura de 1,6e- para uma adequada relação sinal-ruído durante a aquisição de imagens16.
Do ponto de vista processual, a execução do fMPA requer um conjunto de habilidades avançadas. Por exemplo, a confecção de micropipetas usando o cortador de micropipetas exige precisão e destreza, juntamente com controle meticuloso de temperatura e posicionamento. O posicionamento da micropipeta dentro do campo de visão do microscópio requer um esforço meticuloso para evitar danos tanto à ponta da micropipeta quanto à câmara celular. Além disso, um desafio comum associado à imagem por fluorescência é o fotoclareamento. Para mitigar esse problema, é importante minimizar o tempo de exposição da amostra ao sistema de iluminação. Com referência ao protocolo de aspiração de micropipetas acopladas a fluorescência, o obturador de fluorescência da fonte de luz de excitação permanece desligado até que todos os parâmetros sejam inseridos através do software operacional da câmera e o sistema de aspiração esteja pronto para experimentos. Só então o obturador de fluorescência é ligado para iniciar a geração de imagens. Para reduzir ainda mais o fotoclareamento, recomenda-se utilizar a intensidade mínima da fonte de luz que ainda produza expressão adequada de fluorescência na amostra.
Além disso, a atual operação manual necessária para ensaios de fMPA torna essa técnica trabalhosa. Consequentemente, as inconsistências que podem surgir neste ensaio decorrem principalmente de variáveis operador-dependentes, bem como dos fatores associados a variações no pré-aquecimento dos filamentos e nas características dos vidros capilares. No futuro, a otimização do desempenho desta técnica requer a consideração de possíveis implementações em tandem. Por exemplo, quando combinada com dispositivos microfluídicos, a aspiração por micropipeta pode ser transformada em uma plataforma de alto rendimento, aumentando significativamente a taxa experimental de cerca de 20 células por hora para aproximadamente 1.000 células/h 17,18. Essa incorporação também melhora a reprodutibilidade dos dados. Além disso, alguns caminhos têm sido explorados com sucesso pela incorporação de sistemas de automação e análise de imagens19. Notavelmente, a análise por elementos finitos (FEA) é uma ferramenta computacional comumente empregada para modelar ensaios de aspiração de micropipetas. A AFE pode predizer a resposta celular a estímulos mecânicos e caracterizar suas propriedades mecânicas. Tem potencial para otimizar o planejamento de micropipetas e validar ainda mais os resultados experimentais19.
Em conclusão, a abordagem fMPA oferece informações valiosas sobre o comportamento mecanossensível das hemácias na resposta a estímulos mecânicos. Este estudo estabelece uma estrutura fundamental para futuras investigações sobre os intrincados mecanismos de mecanotransdução dentro de hemácias e em sistemas biológicos mais amplos. Tais investigações são uma grande promessa para avançar nossa compreensão desses mecanismos e desvendar suas extensas implicações em vários contextos fisiológicos.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses conflitantes a relatar em relação ao presente estudo.
Acknowledgments
Agradecemos a Nurul Aisha Zainal Abidin e Laura Moldovan pelo recrutamento adicional de doadores, coleta de sangue e apoio à flebotomia. Agradecemos a Tomas Anderson e Arian Nasser pela organização dos equipamentos e reagentes. Esta pesquisa foi financiada pelo Australian Research Council (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); o National Health and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); Concessão de Equipamentos NHMRC-L.A.J.; NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Bolsa de Pesquisador em Início de Carreira-L.A.J.); NSW CVRN-VCCRI Bolsa de Inovação em Pesquisa; Escritório de Engajamento Global e de Pesquisa (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-L.A.J.); L.A.J. é membro da National Heart Foundation Future Leader Fellow Nível 2 (105863) e bolsista da Snow Medical Research Foundation (2022SF176).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µManager | Micro-Manager | Version 2.0.0 | |
| 1 mL Syringe | Terumo | 210320D | Cooperate with the Microfil |
| 200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | Red clood cell preparation |
| 22 x 40 mm Cover Slips | Knittel Glass | MS0014 | Cell chamber assembly |
| 50 mL Syringe | Terumo | 220617E | Connect to the water tower |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000280 | Red clood cell preparation |
| Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL |
| DAQami | Diligent | ||
| Fluorescence light source | CoolLED | pE-300 | Micropipette aspiration hardware system |
| Glass capillary | Narishige | G-1 | Micropipette manufacture |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| High speed GigE camera | Manta | G-040B | Micropipette aspiration hardware system |
| High speed pressure clamp | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
| High speed pressure clamp head stage | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
| Imaris | Oxford Instruments | ||
| Inverted Microscopy | Olympus | Olympus IX83 | Micropipette aspiration hardware system |
| Microfil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip |
| Micropipette Puller | Sutter instrument | P1000 | Micropipette manufacture |
| Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation |
| Pipette microforge | Narishige | MF-900 | Micropipette manufacture |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Pressue Pump | Scientific Instrument | PV-PUMP | Induce controlled pressure during experiment |
| Prime 95B Camera | Photometrics | Prime 95B sCMOS | Flourscent imaging |
| Rotary wheel remote unit | Sensapex | uM-RM3 | Control panel for micropipette position adjustment |
| Scepter 3.0 Handheld Cell Counter | Merck Millipore | PHCC340KIT | Automatic cell counter |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) |
Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Touch screen control unit | Sensapex | uM-TSC | Control panel for micropipette position adjustment |
| X dry Objective | Olympus | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | Micropipette aspiration hardware system |
References
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