Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لفحص عدوى المبيضات عن طريق الفم في المرضى الذين يعانون من متلازمة سجوجرن الأولية ، والتي يمكن استخدامها للعلاج في الوقت المناسب ، وبعد ذلك ، تجنب المضاعفات ذات الصلة.
Abstract
متلازمة سجوجرن الأولية (pSS) هي أحد أمراض المناعة الذاتية التي تتميز بأعراض مثل جفاف الفم وجفاف العين وأعراض منهجية أخرى. بسبب نقص اللعاب الذي يعاني منه مرضى pSS ، غالبا ما يحدث دسباقتريوز الفم. المضاعفات الشائعة ل pSS هي عدوى المبيضات الفموية. في هذه المقالة ، يصف المؤلفون طرقا منهجية يمكنها تشخيص عدوى المبيضات الفموية بشكل فعال وتحديد سلالات المبيضات باستخدام اللعاب أو مسحات الغشاء المخاطي للفم أو غسول الفم من مرضى pSS. يتم استخدام أجار سكر العنب من Sabouraud (SDA) ، ومقايسة تكوين hyphal ، واختبار مسحة هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) ، ومقايسة تلطيخ الكالكوفلور الأبيض (CFW) لتشخيص عدوى المبيضات عن طريق الفم. يستخدم أجار تشخيص المبيضات لتحديد سلالات المبيضات . أخيرا ، يتم استخدام اختبار الحساسية للفطريات لتحديد العلاج المناسب للفطريات. يمكن أن تعزز هذه الطريقة الموحدة التشخيص والعلاج والبحث المستقبلي لعدوى المبيضات الفموية المرتبطة ب pSS. التشخيص المبكر ، باستخدام هذه الطريقة ، يمكن أن يمنع أيضا أي مضاعفات تنشأ بسبب التأخير في تلقي العلاج المناسب.
Introduction
المبيضات سببها المبيضات النيابة، والتي هي مسببات الأمراض الانتهازية. تشمل السلالات الشائعة المبيضات البيض ، المبيضات كروسي ، المبيضات غلابراتا ، المبيضات parapsilosis ، والمبيضات دبلينينسيس1. تشمل العدوى الانتهازية التي تسببها المبيضات التهابات المبيضات السطحية وداء المبيضات الغازي. داء المبيضات الغازية يحدث بشكل رئيسي في الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة. على سبيل المثال ، في المرضى الذين يعانون من متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) ، يمكن أن يهدد داء المبيضات الغازي بشكل كبير نوعية الحياة أو حتى العمرالافتراضي 2. عدوى المبيضات السطحية ، مثل داء المبيضات المخاطي الجلدي ، أكثر شيوعا في المرضى3.
داء المبيضات الفموي ، عدوى المبيضات السطحية ، هو العدوى الفطرية البشرية الأكثر شيوعا. المبيضات البيض هو متعايش طبيعي للفم. تم الإبلاغ عن أن معدل نقل المبيضات spp. يتراوح من 20٪ إلى 75٪ في عموم السكان دون أي أعراض4. يمكن أن يؤدي فرط نمو المبيضات إلى عدم الراحة المحلية لدى المرضى ، مثل تغير طعم الإحساس ، والإحساس بالحرقة في الفم ، وعسر البلع بسبب سوء التغذية ، وتأخر الشفاء ، والإقامة الطويلة في المستشفى. يمكن أن يؤدي داء المبيضات الفموي طويل الأمد إلى داء المبيضات الغازي الشديد ، مما يؤدي إلى مراضة ووفيات كبيرة5. داء المبيضات الفموي يمكن أن يزيد أيضا من خطر الإصابة بسرطان الفم5. ضعف وظيفة الغدد اللعابية هو من بين عوامل الخطر لداء المبيضات الفموي6. بدء العدوى هو التصاق المبيضات بجدران الخلايا الظهارية. ويلي ذلك انتشار وخيوط المبيضات وتشكيل ونضج الغشاء الحيوي7. من الصعب للغاية القضاء على الأغشية الحيوية وهي مقاومة للعلاج التقليدي المضاد للفطريات ، مما يجعل العلاج السريري تحديا لعدوى المبيضات الفموية المرتبطة بالأغشية الحيوية7.
متلازمة سجوجرن الأولية (pSS) هي أحد أمراض المناعة الذاتية التي تتميز بجفاف الفم وجفاف العين وأعراض منهجية أخرى8. جفاف الفم هو أكثر أعراض pSS شيوعا. اللعاب له وظائف فسيولوجية مهمة مضادة للفطريات. من ناحية ، يمكن أن يخفف وينظف الفم وبعد ذلك يزيل الكائنات الحية من الغشاء المخاطي. من ناحية أخرى ، يحتوي اللعاب على بروتينات مضادة للميكروبات ، مثل اللاكتوفيرين ، سيالوبيروكسيديز ، الليزوزيم ، الببتيدات الغنية بالهيستيدين ، والأجسام المضادة المضادة المضادة للفحم ، والتي يمكن أن تتفاعل مع الغشاء المخاطي للفم وتمنع فرط نمو المبيضات6. قد يؤدي انخفاض تدفق اللعاب إلى تعريض مرضى pSS لداء المبيضات الفموي. وجدت دراسة مقطعية قائمة على الملاحظة أجريت على 61 مريضا من مرضى pSS أن 13.1٪ من مرضى pSS قدموا علامات فموية لداء المبيضات ووحدة تشكيل المستعمرة (CFU) / مل من المبيضات البيض تم العثور عليها بشكل كبير وسلبي مع مستويات اللعاب الكامل غير المحفز (UWS) واللعاب الكامل المحفز (SWS) 9.
يمكن للطرق المقدمة في هذه المخطوطة تحديد عدوى المبيضات الفموية بناء على السمات المورفولوجية المميزة (على سبيل المثال ، خلايا الخيوط والخميرة) في اللطاخة المباشرة أو بعد زراعة10. يعتمد تحديد سلالة المبيضات باستخدام أجار تشخيص المبيضات على تكوين مستعمرات ملونة مختلفة ذات مورفولوجيا متنوعة ، والتي تنتج عن انقسام ركائز كروموجينية بواسطة إنزيمات خاصة بالأنواع11. في هذه المخطوطة ، يتم تقديم طرق منهجية للكشف عن عدوى المبيضات الفموية ، بما في ذلك زراعة المبيضات الفموية التقليدية والفحص السريع عن طريق اختبار مسحة هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) ومقايسة تلطيخ الكالكوفلور الأبيض (CFW)10. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقديم اختبار الحساسية للفطريات ، والذي يمكن أن يوجه علاج عدوى المبيضات عن طريق الفم السريري. في الحالات الفعلية ، ليس من الضروري تنفيذ جميع الأساليب المقدمة في هذه المخطوطة. يمكن اختيار طريقة (طرق) الكشف عن المبيضات عن طريق الفم وفقا للغرض. إن فحص عدوى المبيضات الفموية وتحديد سلالات المبيضات في مرضى pSS لا يفيد علاج المرض فحسب ، بل يساعد أيضا في تقييم توصيف داء المبيضات الفموي وملامح الأنواع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة أدناه من قبل اللجنة الأخلاقية لمستشفى بكين تيانتان ، جامعة العاصمة الطبية (رقم KY2023-177-01) ، وقدم جميع المرضى المشاركين في هذه الدراسة موافقة مستنيرة.
1. معايير إدراج المريض واستبعاده
- معايير التضمين: صنف المرضى كمرضى pSS إذا استوفوا معايير الكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم (ACR) / الرابطة الأوروبية لمكافحة الروماتيزم (EULAR)لعام 2016 12. على وجه التحديد ، قم بتأسيس معايير التصنيف النهائية على المجموع المرجح لخمسة عناصر: إيجابية الأجسام المضادة ل SSA / Ro والتهاب الغدد الليمفاوية البؤري مع درجة تركيز تبلغ ≥ 1 بؤرة / 4 مم2 ، كل منها يسجل 3 ؛ درجة تلطيخ العين غير الطبيعية ≥ 5 (أو درجة فان بيجسترفيلد ≥ 4) ، نتيجة اختبار شيرمر ≤ 5 مم / 5 دقائق ومعدل تدفق لعابي غير محفز ≤ 0.1 مل / دقيقة ، كل منها يسجل 1. الأفراد الذين يعانون من علامات و / أو أعراض توحي ب SS والذين لديهم درجة إجمالية قدرها ≥ 4 للعناصر المذكورة أعلاه يستوفون معايير pSS.
- معايير الاستبعاد: استبعاد المرضى الذين لا يستطيعون التعاون مع جمع العينات والمرضى الذين يتلقون العلاج من عدوى المبيضات عن طريق الفم.
ملاحظة: من الضروري ملاحظة أن الطرق الموضحة أدناه مناسبة أيضا للتوصيف الشامل لعدوى المبيضات الفموية لدى الأفراد المصابين ب SS الثانوي. - لمنع الملوثات المحتملة أثناء جمع عينات المبيضات ونقلها وزراعتها ، اتخذ احتياطات دقيقة. ويشمل ذلك التحضير التجريبي الدقيق ، واستخدام المواد ذات الاستخدام الواحد والمعقمة ، ووضع العلامات المناسبة ، والختم الآمن لأنابيب أخذ العينات ، وإجراء الإجراءات التجريبية في خزانة مهنية للسلامة الأحيائية.
2. جمع العينات
- جمع اللعاب: اطلب من المرضى حمل الأنبوب بقمع والسماح لتدفق اللعاب تدريجيا إلى الأنبوب على طول الشفة السفلى. في نهاية المجموعة ، اطلب من المريض أن يبصق كل اللعاب المتبقي في الفم في الأنبوب. جمع اللعاب لمدة 15 دقيقة.
- جمع غسول الفم والمسحات: إذا لم يكن لدى المريض تدفق لعاب غير محفز أو منخفض للغاية (أقل من 0.03 مل / دقيقة) ، فقم بمسح منطقة الغشاء المخاطي للفم مع عدوى المبيضات الفموية المشتبه بها 10x على الأقل ، ثم اطلب من المريض استخدام 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ انظر جدول المواد) لشطف الفم لمدة 1 دقيقة. قم بتخزين غسول الفم في أنبوب معقم سعة 50 مل وضع المسحة في أنبوب غسول الفم.
ملاحظة: بالنسبة لمرضى pSS الذين يعانون من تدفق اللعاب غير المحفز لأكثر من 0.03 مل / دقيقة ، لا يزال من الممكن استخدام الخطوة 2.2 لجمع عينات للكشف عن عدوى المبيضات عن طريق الفم.
3. معالجة العينات
- أضف 1 مل من PBS إلى اللعاب الذي تم جمعه. لا تضيف برنامج تلفزيوني إلى غسول الفم باستخدام برنامج تلفزيوني. يهتز أنبوب غسول الفم باستخدام دوامة لمدة 1 دقيقة.
4. ثقافة المبيضات
- لجعل وسط أجار سابوراند (SDA) ، قم بإذابة 70 جم SDA (انظر جدول المواد) في 1000 مل من الماء المقطر المزدوج.
- معقم باستخدام الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، طبق 10 مل من وسط SDA هذا في طبق استزراع ميكروبيولوجي 10 سم (انظر جدول المواد) ويبرد.
- خذ 200 ميكرولتر من العينة المحضرة في الخطوة 3 وقم بوضعها على أطباق الاستزراع الميكروبيولوجي 10 سم المحضرة ب 10 مل من وسط SDA في الخطوة 4.2.
- احتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، وسوف تنضج مستعمرة المبيضات . قم بتخزين طبق SDA مؤقتا مع مستعمرات المبيضات عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين مستعمرات المبيضات المستزرعة على طبق SDA لمدة 2-4 أسابيع.
5. تحديد سلالة المبيضات
- لصنع الوسط ، أخرج 47.7 جم من مسحوق أجار المبيضات التشخيصي (انظر جدول المواد) ، وضعه في 1000 مل من الماء المقطر المزدوج ، وقم بتسخينه إلى 100 درجة مئوية.
- عندما يغلي الوسط قليلا ، ضع 10 مل في طبق استزراع ميكروبيولوجي 10 سم واتركه ليبرد.
- حل مستعمرات المبيضات في 500 ميكرولتر من وسط SDA (الخطوة 4) ، وتعليق وفصل عن طريق الماصة.
- لوحة 50 ميكرولتر من العينة مع مستعمرات المبيضات (الخطوة 5.3) على الوسط المعد في الخطوة 5.2. احتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية حتى تنضج مستعمرات المبيضات .
- وفقا للون وأنماط مستعمرات المبيضات ، حدد سلالة (سلالات) المبيضات المكتسبة من مرضى pSS. استخدم معايير تحديد سلالة المبيضات التالية: مستعمرة الزمرد الأخضر هي المبيضات البيض ، والمستعمرة الزرقاء الرمادية هي المبيضات الاستوائية ، والمستعمرات الوردية ذات الحواف الغامضة ، والميكروفيلي هي المبيضات كروسي ، والمستعمرة الصغيرة الحمراء الأرجوانية هي المبيضات جلابراتا ، والمستعمرة البيضاء اللبنية تحتوي على عدة سلالات بما في ذلك المبيضات parapsilosis.
6. مقايسة تشكيل المبيضات بيوفيلم
- لجعل قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB) -50 جلوكوز (جم) متوسطة ، تزن 1.34 جم YNB (انظر جدول المواد) و 1.98 جم D (+) - جلوكوز (انظر جدول المواد). تذوب في 200 مل من الماء المقطر المزدوج.
- لجعل YNB-100G متوسطا ، أخرج 1.34 جم YNB و 3.96 جم D (+) - جلوكوز وقم بإذابتهما في 200 مل من الماء المقطر المزدوج.
- قم بتصفية المحاليل باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد). يمكن تخزين وسيط YNB-50G و YNB-100G المصفى عند 4 درجات مئوية لمدة 3 أشهر.
- اختر 3 مستعمرات (أو أكثر) من نفس السلالة على الأطباق في الخطوة 5 وانقلها إلى 200 ميكرولتر من وسط YNB-50G (الخطوتان 6.1 و 6.3) في طبق من 96 بئرا (انظر جدول المواد). افعل ذلك للسلالات التي لوحظت في الطبق. استزرع بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
- نضح تعليق المبيضات ، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني ، والطرد المركزي لخلايا الخميرة في 1500 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة 2x في نفس الأنبوب.
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط YNB-100G وقم بإعداد تخفيفات مختلفة (1:10 و 1: 100 و 1: 1000) من الخلايا. خذ 200 ميكرولتر من تعليق الخلية المتدرجة وقم بوضعه على وسط SDA مقاس 10 سم بطريقة اللوحة الحلزونية13. يتم الطلاء باستخدام آلة تودع حجما معروفا من العينة على صفيحة أجار دوارة بكمية متناقصة باستمرار على شكل حلزوني أرخميدس. ثقافة لمدة 24-48 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- احسب تركيز الخلايا في التخفيفات المختلفة وفقا لعدد وحدات CFU في لوحة SDA بناء على الطريقة القياسية13. عد لفترة وجيزة المستعمرات المنفصلة جيدا على كل لوحة. عد المستعمرات في أوكتان واحد من الحافة الخارجية باتجاه المركز حتى يتم ملاحظة 25 مستعمرة على الأقل. أيضا ، احسب ما تبقى من هذا القوس حيثحدث العد 25. احسب تركيز الخلايا بقسمة عدد المستعمرات على حجم السائل المقابل للمنطقة التي تم الحصول على عدد المستعمراتعليها 13. اضبط تركيز الخلايا على 1 × 107 خلايا / مل.
- ضع 100 ميكرولتر من معلق الخلية في YNB-100G في لوحة 96 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أثناء الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
- أخرج بحذر المادة الطافية ، واغسل 2x باستخدام برنامج تلفزيوني ، وابتعد عن خلايا الخميرة العائمة. يتشكل الغشاء الحيوي المبيضات في الجزء السفلي من لوحة 96 بئرا.
7. مقايسة تشكيل Hyphal
ملاحظة: فقط المبيضات التي يمكن أن تشكل خيوط (مثل المبيضات البيض) يمكن أن تحفز لتشكيل hyphal. انتقل إلى الخطوة 8 لمزيد من توصيف المبيضات التي لا يمكن أن تشكل خيوط (مثل المبيضات glabrata).
- أعد تعليق تعليق خلية الخميرة في الخطوة 6.6 واضبط تركيز الخلية على 1 × 106 خلايا / مل باستخدام وسيط YNB-100G.
- لتحضير وسط النمو الكامل RPMI 1640 ، أضف 50 مل من مصل الجنين البقري (انظر جدول المواد) إلى 450 مل من وسط RPMI 1640 (انظر جدول المواد) واحفظه عند 4 درجات مئوية لمزيد من التجارب.
- نقل 2 ميكرولتر من معلق خلية المبيضات المخفف في 200 ميكرولتر من وسط النمو الكامل RPMI 1640 إلى صفيحة 96 بئرا ومزرعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية للسماح للخيوط الفطرية وخلايا الخميرة بالتكون.
8. اختبار مسحة KOH ومقايسة تلطيخ CFW
- أخرج 1 ميكرولتر من العينات من الخطوة 3 أو الخطوة 6 أو الخطوة 7 باستخدام حلقة مصبوبة بدقة (انظر جدول المواد) وقم بتلطيخ مساحة 1 سم × 1 سم على الشرائح الزجاجية. انتظر حتى يجف في درجة حرارة الغرفة.
- لصنع محلول KOH بنسبة 10٪ ، قم بوزن 10 جم من مسحوق KOH (انظر جدول المواد) وقم بإذابته في 100 مل من الماء المقطر المزدوج.
- سخني الشريحة قليلا باستخدام مصباح كحول حتى تذوب العينة. قم بتلطيخ الشرائح المعدة في الخطوة 8.1 بنسبة 10٪ KOH (الخطوة 8.2) ، وقم بتغطيتها بقسيمة غطاء. اضغط قليلا على انزلاق الغطاء لجعل العينة شفافة.
- تصور خلايا الخيوط والخميرة تحت المجهر.
- قم بتلطيخ الشرائح المحضرة في الخطوة 8.1 مع قطرة من CFW (انظر جدول المواد) ، وقم بتغطيتها بغطاء ، وانتظر لمدة دقيقة واحدة.
- تصور الخيوط باستخدام مجهر مضان عند تكبير 100x و 200x. CFW متحمس عند 355 نانومتر ويتم اكتشافه عند 300-440 نانومتر. صور الصور تحت وقت التعرض. كرر 3x لتجنب النتائج الإيجابية الخاطئة.
9. اختبار الحساسية للفطريات
ملاحظة: يتم إجراء هذا الاختبار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمجموعة الحساسية الفطرية الشبيهة بالخميرة (التخفيف الدقيق ؛ انظر جدول المواد).
- قم بإعداد مستعمرات المبيضات (الخطوة 4) التي يقل عمرها عن 4 أيام باستخدام أمبولة كلوريد الصوديوم 0.85٪ (انظر جدول المواد) والحصول على التعليق الذي له تعكر يعادل 2 McFarland. حدد التعكر وفقا لمجموعة معايير McFarland (انظر جدول المواد). استخدم تعليق المبيضات المحضر على الفور.
- ماصة 135 ميكرولتر من وسط ATB F2 في المجموعة التي تحتوي على 3 × 104 خلايا خميرة / مل في كل قبة في شريط الاختبار ووضع الغطاء. ضع شريط الاختبار في حاوية مغلقة. ثقافة لمدة 24 ساعة عند 35 درجة مئوية.
- مراقبة نمو المبيضات مع التفسير البصري (الرجوع إلى دليل المستخدم). للحصول على القيمة المرجعية (النطاق المرجعي)، راجع دليل المستخدم. تحقق مما إذا كانت فتحة التحكم تنمو بشكل كاف. إذا كان نمو فتحة التحكم غير كاف أو لا ينمو ، فلا يمكن قراءة النتائج وتحتاج إلى 24 ساعة أخرى من الزراعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة ، تم اختيار 12 مريضا يعانون من pSS كمرضى تمثيليين وتم فحصهم بحثا عن عدوى المبيضات الفموية (الجدول 1). من بين هؤلاء المرضى ، أظهر بعض المرضى آفات فموية نموذجية لعدوى المبيضات ، بما في ذلك التهاب الشفة الزاوي (الذي يتميز بتشققات في زوايا الفم ، والتقشر ، واحتقان الدم ، الشكل 1 أ) ، وذمة حمراء زاهية على الغشاء المخاطي اللثوي ، غشاء زائف خيطي أبيض مصفر (الشكل 1 ب) ، ضمور الحليمات اللسانية والغشاء المخاطي الظهري الأحمر الفاتح للسان (الشكل 1 ج).
من بين هؤلاء المرضى ال 12 المشاركين في الدراسة الحالية ، كان 8 منهم مصابين بعدوى المبيضات عن طريق الفم ، وهو ما أكده نمو مستعمرات المبيضات على أطباق SDA (الشكل 2A-C والشكل التكميلي 1). أظهر أجار التشخيص أن عدوى المبيضات الفموية للمبيضات البيض ، المبيضات krusei ، والمبيضات glabrata موجودة بين مرضى pSS (الشكل 2D-F ، الشكل التكميلي 2A ، B). في بعض الحالات ، تم اكتشاف أكثر من نوع واحد من المبيضات ، مثل العدوى المركبة مع المبيضات البيض والمبيضات krusei ، بالإضافة إلى عدوى مركبة مع المبيضات البيض والمبيضات glabrata (الشكل 2D ، الشكل التكميلي 2A ، B).
يمكن لاختبار مسحة KOH ومقايسة تلطيخ CFW اللاحقة ، باستخدام لعاب المريض أو عينات مسحة الغشاء المخاطي للفم ، تحديد ما إذا كان المريض مصابا بعدوى المبيضات الفموية بسرعة. في هذه الدراسة ، لوحظ وجود خيوط في كلتا العينتين الفمويتين من مرضى pSS (الشكل 3 أ ، ب). تم التحقق من صحة النتيجة بشكل أكبر من خلال مقايسة تلطيخ CFW ، والتي أظهرت تلطيخا إيجابيا للفلورسنت للخيوط (الشكل 3C ، D). بالإضافة إلى ذلك ، كانت خيوط مريض pSS المصابة بالمبيضات البيض عن طريق الفم قابلة للتحريض من خلال مقايسة تكوين hyphal (الشكل 4A) ، ولوحظت الخيوط المستحثة تحت المجهر الفلوري في مقايسة تلطيخ CFW (الشكل 4D). علاوة على ذلك ، أشار اختبار لطاخة KOH ومقايسة تلطيخ CFW إلى جراثيم فطرية إيجابية و pseudohypha من مريض pSS مصاب بعدوى المبيضات krusei (الشكل 4B ، E) ، وجراثيم فطرية من مريض pSS مصاب بعدوى المبيضات glabrata (الشكل 4C ، F) ، بعد تكوين غشاء المبيضات الحيوي.
يعد اختبار الحساسية للفطريات أمرا بالغ الأهمية في توجيه الإدارة السريرية لعدوى المبيضات الفموية في المرضى الذين يعانون من pSS. هنا ، تم اختبار ثلاثة مرضى تمثيليين للحساسية المضادة للفطريات لخمسة عوامل موصوفة بشكل شائع: فلوكونازول ، إيتراكونازول ، أمفوتريسين ب ، فوريكونازول ، و 5-فلوكونازول. تم تفسير النتائج وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. أظهر مرضى pSS 1 و 3 حساسيات لجميع العوامل المضادة للفطريات التي تم اختبارها (الجدول 1)14,15. أظهر المريض 2 استجابة متوسطة تعتمد على الجرعة للفلوكونازول وفوريكونازول ، وهي حساسية تعتمد على الجرعة ومتوسطة إلى مقاومة تجاه إيتراكونازول ، ومقاومة 5-فلوكونازول ، وحساسية لعلاج الأمفوتريسين ب (الجدول 2) 14،15.
الشكل 1: المظاهر الفموية التمثيلية لعدوى المبيضات الفموية. (أ) التهاب الشفة الزاوي (rhagades في زوايا الفم، والتقشر، واحتقان الدم). ب: آفة حمامية مع وذمة على الغشاء المخاطي اللثوي السنخي ، مع غشاء زائف خيطي أبيض مصفر. (ج) الظهر الضموري للحليمات اللسانية مع آفة حمامية ضامرة مشتتة وغير منتظمة ومحمرة ومقيدة. تشير الأسهم السوداء إلى الآفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد سلالة سكر العنب Sabouraud (SDA) والمبيضات. (أ-ج) ثقافة SDA للعينات الفموية (اللعاب ، غسول الفم PBS ، أو مبادلة الغشاء المخاطي للفم) من 3 مرضى pSS ممثلين مصابين بعدوى المبيضات. يظهر اختبار تحديد سلالة المبيضات باستخدام أجار تشخيص المبيضات مرضى pSS الذين يعانون من التهاب المبيضات البيض عن طريق الفم (D) بالإضافة إلى عدوى المبيضات كروسي ، (ه) عدوى المبيضات البيض ، و (F) عدوى المبيضات غلابراتا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اختبار مسحة هيدروكسيد البوتاسيوم الفوري (KOH) ومقايسة تلطيخ الكالكوفلور الأبيض (CFW). تم إجراء الفحص باستخدام عينات عن طريق الفم (اللعاب ، غسول الفم PBS ، أو مبادلة الغشاء المخاطي للفم) من 2 من مرضى pSS التمثيليين. اختبار مسحة KOH باستخدام عينة عن طريق الفم من (A) pSS المريض 1 و (B) pSS المريض 2. تشير الأسهم السوداء المجوفة إلى الخيوط. مقايسة تلطيخ CFW باستخدام عينة عن طريق الفم من (C) pSS المريض 1 و (D) pSS المريض 2. تشير الأسهم المجوفة البيضاء إلى الخيوط الفطرية والجراثيم الفطرية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: اختبار لطاخة هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) ، مقايسة تلطيخ الكالكوفلور الأبيض (CFW) للعينات بعد الثقافة. اختبار لطاخة KOH باستخدام اللعاب من مريض pSS المصاب بعدوى المبيضات البيض ، (ب) مريض pSS المصاب بعدوى المبيضات krusei ، و (C) مريض pSS المصاب بعدوى المبيضات glabrata. مقايسة تلطيخ CFW للخيوط المستحثة من مريض pSS المصاب بعدوى المبيضات البيض (D) ، والجراثيم الفطرية ، والخيوط الزائفة من مريض (E) pSS المصاب بعدوى المبيضات krusei ، والجراثيم الفطرية من (F) مريض pSS المصاب بعدوى المبيضات glabrata. تشير الأسهم المجوفة البيضاء إلى الخيوط. تشير الأسهم الصلبة البيضاء إلى الخيوط الزائفة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1: ثقافة أجار سكر العنب (SDA) التمثيلية Sabouraud باستخدام عينات فموية لمريض pSS (اللعاب ، غسول الفم PBS ، أو مبادلة الغشاء المخاطي للفم). (أ-ج) ثقافة SDA من المبيضات باستخدام عينات عن طريق الفم من 3 مرضى pSS تمثيلية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: تحديد سلالة المبيضات . تحديد المبيضات المصابة المحتملة من 12 مريضا pSS باستخدام أجار تشخيص المبيضات . (أ) تحديد سلالة المبيضات باستخدام عينات عن طريق الفم من مرضى pSS 1-6. pSS المريض 1: المبيضات البيض ، 2: المبيضات البيض ، 3: المبيضات البيض والمبيضات krusei ، 4: المبيضات البيض ، 5: المبيضات البيض والمبيضات glabrata ، 6: لا عدوى المبيضات عن طريق الفم. (ب) تحديد سلالة المبيضات باستخدام عينات فموية من مرضى pSS 7-12. pSS المريض 7: المبيضات البيض ، 8: المبيضات البيض والمبيضات glabrata ، 9: لا عدوى المبيضات عن طريق الفم ، 10: المبيضات البيض ، 11: لا عدوى المبيضات عن طريق الفم ، 12: لا عدوى المبيضات عن طريق الفم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول 1: معلومات عن مرضى متلازمة سجوجرن الأولية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: نتائج اختبار الحساسية للفطريات للمرضى14،15. الاختصارات: S = حساس ، I = متوسط ، R = مقاوم ، SDD = حساس يعتمد على الجرعة ، C = تركيز. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في المخطوطة الحالية ، نقدم سلسلة من الطرق المنهجية والبسيطة والممكنة للكشف عن عدوى المبيضات الفموية ، وتحديد سلالات المبيضات ، واختبار الحساسية المضادة للفطريات للأدوية شائعة الاستخدام في المرضى الذين يعانون من pSS.
في الإعدادات العملية ، ليست كل الطرق المقدمة في هذه المخطوطة ضرورية. يمكن اختيار طريقة (طرق) الكشف عن المبيضات عن طريق الفم بناء على الغرض المحدد. يمكن لاختبارات اللطاخة KOH ومقايسات تلطيخ CFW ، باستخدام عينات بدون زراعة ، أن تحدد بسرعة وبشكل مبدئي وجود عدوى المبيضات الفموية في مرضى pSS. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها معدل سلبي كاذب مرتفع نسبيا16. إذا كان من الصعب تأكيد العدوى ، فإن زراعة المبيضات ضرورية. مقاومة الأدوية هي عامل يجب مراعاته أثناء العلاج. بعض سلالات المبيضات مقاومة بشكل طبيعي لبعض الأدوية المضادة للفطريات ، على سبيل المثال ، المبيضات krusei مقاومة بشكل طبيعي للعلاج بالفلوكونازول17. لذلك ، في بعض الأحيان ، يجب تحديد سلالة المبيضات . في هذه الحالة ، يمكن التعرف على سلالة المبيضات بواسطة أجار تشخيص المبيضات . حاليا ، المبيضات المقاومة للأدوية تحظى باهتمام متزايد18. يمكن أن يوجه اختبار الحساسية للفطريات العلاج وبالتالي تجنب مقاومة الأدوية قدر الإمكان أثناء العلاج. مقايسة تكوين المبيضات بيوفيلم ومقايسة تشكيل hyphal مناسبة للبحث المتعلق بعدوى المبيضات عن طريق الفم.
تعد عدوى المبيضات الفموية واحدة من أكثر المضاعفات شيوعا لدى مرضى pSS4 ، مما يؤثر بشكل كبير على نوعية حياتهم بسبب مجموعة الأعراض التي تسببها. والجدير بالذكر أن مرضى pSS معرضون بشدة لهذه العدوى ، وغالبا ما يتطلب العلاج الفعال علاجا جهازيا وتعاون المريض19. وبالتالي ، غالبا ما تتكرر عدوى المبيضات الفموية في هذه الفئة من السكان. من الأهمية بمكان تحديد داء المبيضات الفموي وإجراء اختبارات الحساسية المضادة للفطريات لتوجيه العلاج. من بين الطرق المفصلة في هذه المخطوطة ، يعد جمع العينات الفموية للكشف عن المبيضات والزراعة اللاحقة من أهم الخطوات.
علاوة على ذلك ، يمكن اكتشاف المبيضات التي تحتوي على تكوين غشاء (مثل المبيضات البيض) بسهولة عن طريق اختبار مسحة KOH السريع ومقايسة تلطيخ CFW باستخدام العينات التي تم جمعها دون زراعة. على الرغم من أنه يمكن الكشف عن معظم عدوى المبيضات الفموية ويمكن التعرف على سلالات المبيضات من خلال الطرق المقدمة في هذه المخطوطة ، إلا أنه لا يمكن التعرف على بعض سلالات المبيضات من سلالات أخرى على وجه التحديد فقط بطرق مثل ثقافة SDA ، وثقافة أجار المبيضات التشخيصية ، ومقايسة تكوين المبيضات الحيوية ، ومقايسة تكوين المبيضات الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن حث بعض سلالات المبيضات لإنتاج خيوط ، مثل المبيضات glabrata. يمكن لتحديد الأنواع المستندة إلى 18s rDNA RT-PCR تحديد أنواع المبيضات بدقة بناء على تشابهها الجيني10،20،21. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام تحديد الأنواع القائمة على 18s rDNA RT-PCR ، على سبيل المثال ، في البحث عن عدوى المبيضات الفموية في مرضى pSS.
داخل الفم ، قد تظهر مظاهر عدوى المبيضات كآفات مخاطية حمامية ، التهاب الفم الأسنان ، وتشقق اللسان. في المنطقة المحيطة بالفم ، يتسبب استعمار المبيضات في ظهور جاف ومتصدع وحمامي7. يختلف الانتشار المبلغ عنه لداء المبيضات الفموي السريري على نطاق واسع في مرضى SS ، حيث يتراوح من 0٪ إلى 80٪. تشمل الأسباب المحتملة للتباين الكبير في داء المبيضات الفموي عدم وجود أعراض واضحة ، والأهم من ذلك ، المعايير المختلفة المستخدمة لتشخيص داء المبيضات الفموي في الأدبيات8،9،12. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن أن المرضى الذين يعانون من عدوى المبيضات لديهم خطر أكبر للإصابة ب SS ، ويمكن أن تكون عدوى المبيضات بمثابة علامة مبكرة على SS22 اللاحق. التشخيص المبكر ل pSS أمر بالغ الأهمية للعلاج والدراسة المرضية. لذلك ، من الضروري توفير طرق عالمية ومريحة ومجدية لتحديد عدوى المبيضات عن طريق الفم في مرضى pSS.
على الرغم من أن dysbiosis في الأمعاء والميكروبيوم الفموي والمهبلي متكرر في مرضى pSS ، إلا أن العينات الفموية تظهر أكبر مدى من الاختلاف الميكروبي1. في ظل الظروف العادية ، يتراوح متوسط التدفق اليومي للعاب الكامل من 1 إلى 1.5 لتر2. يتكون ما يصل إلى 99 ٪ من اللعاب من الماء ، ويتكون 1 ٪ المتبقية من البروتينات والأيونات. يقال إن اللعاب يلعب دورا مهما في تحديد تكوين ونشاط الجراثيم الفموية لأسباب متعددة3. لا يقوم اللعاب بتنظيف الأسنان باستمرار فحسب ، بل يؤدي وظائف نظافة الفم الحاسمة في ظروف صحية ، ولكنه يشكل أيضا طبقة تكييف على أسطح الفم. يوفر هذا الفيلم مستقبلات لتعلق البكتيريا ، ويساعد في نمو البكتيريا من خلال تزويدها بالمغذيات من البروتينات السكرية ويحافظ على درجة حموضة مناسبة لنمو البكتيريا. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي اللعاب على عوامل مضادة للميكروبات ومضادة للصراحة تنظم وتشكل الميكروبات. علاوة على ذلك ، يحتوي اللعاب على عوامل مضادة للميكروبات ومضادة للصراحة ، مثل الأدرينوميدولين ، والستاثرين ، والهيستاتين ، و α-defensins ، والليزوزيم ، والهيستاتين ، واللاكتوفيرين ، والكالبروتيكتين ، التي تنظم وتشكل الجراثيم4. يتميز pSS بإلغاء تنظيم المناعة الذاتية وقصور وظائف الغدة. نقص اللعاب ، وهو انخفاض في تدفق اللعاب ، هو واحد من أكثر أعراض pSS انتشارا. انخفاض مستويات الأس الهيدروجيني اللعابي والتدفق هي عوامل خطر كبيرة لعدوى المبيضات عن طريق الفم5. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن عدوى المبيضات باعتبارها ثاني أكثر المضاعفات الفموية الوجهية شيوعا المرتبطة ب SS6. يقترح المؤلفون أن زيادة عدوى المبيضات في مرضى pSS قد تكون مرتبطة ليس فقط بانخفاض إنتاج اللعاب ولكن أيضا بإلغاء التنظيم المناعي المتأصل في SS.
في الختام ، فإن الطرق العملية والقابلة للتكرار لعدوى المبيضات عن طريق الفم واختبارات الحساسية للفطريات التي تم تقديمها في هذه المخطوطة تبشر بتعزيز التحديد السريري وعلاج عدوى المبيضات . علاوة على ذلك ، يمكن لهذه الإجراءات الموحدة تقليل التناقضات في الدراسات البحثية المتعلقة بداء المبيضات الفموي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82201084) ، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2022M722232) ، ومؤسسة بكين لأبحاث ما بعد الدكتوراه (2023-ZZ-020) ، ومشروع مياوبو لمستشفى بكين تيانتان ، وجامعة العاصمة الطبية (2023MP10) وصندوق البحوث العامة ، مجلس هونغ كونغ لمنح البحوث (27111820 و 17116521).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | MERCK | SLGV004SL | |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | axygen | MCT-150-C-S | |
| 10 cm Microbiological Culture Dishes | Jet Bio-Filtration Co. Ltd | TCD000100 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Jet Bio-Filtration Co., Ltd | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | |
| 96-well Microplates | Corning | 3599 | |
| API 0.85% NaCl ampule | BIOMERIEUX | 20070 | |
| Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| CHROMagar Candida | CHROMagar | P002860 | Candida diagnostic agar |
| D(+)-Glucose Monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010518 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26170035 | |
| McFarland Standards Kit | BIOMERIEUX | 70900 | |
| Nunc precision molded loops | ThermoFisher Scientific | 254399 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | C10010500BT | |
| Potassium Hydroxide | Aladdin | P112284-500g | |
| PowerSoil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875119 | |
| Sabourand's Agar Medium | Solarbio | S9710 | |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino acids | Solarbio | Y8040 | |
| Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution) | BIOMERIEUX | 14204 |
References
- Wang, X., et al. Microbiota dysbiosis in primary Sjögren's syndrome and the ameliorative effect of hydroxychloroquine. Cell Rep. 40 (11), 111352 (2022).
- Humphrey, S. P., Williamson, R. T. A review of saliva: normal composition, flow, and function. J Prosthet Dent. 85 (2), 162-169 (2001).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontol 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Vila, T., Rizk, A. M., Sultan, A. S., Jabra-Rizk, M. A. The power of saliva: Antimicrobial and beyond. PLoS Pathog. 15 (11), e1008058 (2019).
- Serrano, J., et al. Risk factors related to oral candidiasis in patients with primary Sjögren's syndrome. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 25 (5), e700-e705 (2020).
- Napeñas, J. J., Rouleau, T. S.
- Mathews, S. A., Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Leung, K. C. M., McMillan, A. S., Cheung, B. P. K., Leung, W. K. Sjögren's syndrome sufferers have increased oral yeast levels despite regular dental care. Oral Dis. 14 (2), 163-173 (2008).
- Lundstrom, I. M., Lindstrom, F. D. Subjective and clinical oral symptoms in patients with primary Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 13 (6), 725-731 (1995).
- Alam, M. Z., et al. Candida identification: a journey from conventional to molecular methods in medical mycology. World J Microbiol Biotechnol. 30 (5), 1437-1451 (2014).
- Bauters, T. G., Nelis, H. J. Comparison of chromogenic and fluorogenic membrane filtration methods for detection of four Candida species. J Clin Microbiol. 40 (5), 1838-1839 (2002).
- Soto-Rojas, A. E., Villa, A. R., Sifuentes-Osornio, J., Alarcón-Segovia, D., Kraus, A. Oral candidiasis and Sjögren's syndrome. J Rheumatol. 25 (5), 911-915 (1998).
- Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Appl Microbiol. 25 (2), 244-252 (1973).
- Biomerieux. ATB FUNGUS 3 Sensitivity test for yeast-like fungi. REF 14204. Biomerieux. , (2014).
- Zhang, L., et al. The widely used ATB FUNGUS 3 automated readings in China and its misleading high MICs of Candida spp. to Azoles: Challenges for developing countries' clinical microbiology labs. PLoS One. 9 (12), e114004 (2014).
- Hu, L., Zhou, P., Zhao, W., Hua, H., Yan, Z. Fluorescence staining vs. routine KOH smear for rapid diagnosis of oral candidiasis-A diagnostic test. Oral Dis. 26 (5), 941-947 (2020).
- Samaranayake, L. P. Candida krusei infections and fluconazole therapy. Hong Kong Med J. 3 (3), 312-314 (1997).
- Lee, Y., Puumala, E., Robbins, N., Cowen, L. E. Antifungal drug resistance: Molecular mechanisms in Candida albicans and beyond. Chem Rev. 121 (6), 3390-3411 (2021).
- Rihab, B., Lina, E. H., Noémie, S. T., Jean, S., Marjolaine, G. The experience of dry mouth and screening for Sjogren's syndrome by the dentist: patient-reported experiences. BMC Oral Health. 23 (1), 1010 (2023).
- Panpetch, W., et al. Oral Candida administration in a Clostridium difficile mouse model worsens disease severity but is attenuated by Bifidobacterium. PLoS One. 14 (1), e210798 (2019).
- Alwaily, E. R., Abood, M. S., Al Uobody, R. M. Diagnosis of oral candidiasis in patients under 12 years: 18S rRNA as a marker of molecular characterization of Candida tropicalis. Arch Razi Inst. 78 (1), 475-483 (2023).
- Chen, C. L., et al. Candida infection as an early sign of subsequent Sjögren's syndrome: A population-based matched cohort study. Front Med (Lausanne). 8, 796324 (2022).
