Summary
Ici, nous présentons un protocole pour l’examen de l’infection orale à Candida chez les patients atteints du syndrome de Sjögren primitif, qui peut être utilisé pour un traitement rapide et, par la suite, pour éviter les complications associées.
Abstract
Le syndrome de Sjögren primaire (pSS) est une maladie auto-immune caractérisée par des symptômes tels que la bouche sèche, les yeux secs et d’autres symptômes systématiques. En raison de l’hyposalivation ressentie par les patients atteints de pSS, une dysbactériose buccale se produit souvent. Une complication fréquente du pSS est l’infection orale à Candida . Dans cet article, les auteurs décrivent des méthodes systématiques qui peuvent diagnostiquer efficacement l’infection orale à Candida et identifier les souches de Candida à l’aide de salive, d’écouvillons de la muqueuse buccale ou d’un rince-bouche de patients atteints de pSS. La gélose au dextrose de Sabouraud (SDA), le test de formation d’hyphes, le test de frottis à l’hydroxyde de potassium (KOH) et le test de coloration au blanc de calcofluor (CFW) sont utilisés pour le diagnostic de l’infection orale à Candida . Une gélose diagnostique de Candida est utilisée pour l’identification des souches de Candida . Enfin, les tests de sensibilité aux antifongiques sont utilisés pour déterminer le traitement médicamenteux antifongique approprié. Cette méthode standardisée peut améliorer le diagnostic, le traitement et la recherche future des infections orales à Candida liées au pSS. Un diagnostic précoce, à l’aide de cette méthode, peut également prévenir toute complication due à un retard dans l’obtention d’un traitement approprié.
Introduction
La candidose est causée par Candida spp., qui sont des agents pathogènes opportunistes. Les souches courantes comprennent Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis et Candida dubliniensis1. Les infections opportunistes causées par Candida spp. comprennent les infections superficielles à Candida et la candidose invasive. La candidose invasive survient principalement chez les personnes immunodéprimées ; par exemple, chez les patients atteints du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), la candidose invasive peut menacer considérablement la qualité de vie ou même la durée de vie2. L’infection superficielle à Candida , telle que la candidose cutanéo-muqueuse, est plus fréquente chez les patients3.
La candidose buccale, une infection superficielle à Candida , est l’infection fongique humaine la plus courante. Candida albicans est un commensal normal de la bouche ; le taux de portage de Candida spp. varie de 20 % à 75 % dans la population générale sans aucun symptôme4. La prolifération de Candida peut entraîner une gêne locale chez les patients, comme une altération du goût de la sensation, une sensation de brûlure dans la bouche, une dysphagie due à une mauvaise alimentation, une récupération retardée et un séjour prolongé à l’hôpital. La candidose buccale à long terme peut entraîner une candidose invasive sévère, entraînant une morbidité et une mortalité importantes5. La candidose buccale peut également augmenter le risque de cancer de la bouche5. L’altération de la fonction des glandes salivaires fait partie des facteurs de risque de candidose buccale6. L’initiation de l’infection est l’adhésion de Candida aux parois cellulaires épithéliales. S’ensuit la prolifération et la filamentation de Candida et la formation et la maturation du biofilm7. Les biofilms sont extrêmement difficiles à éradiquer et résistent aux traitements antifongiques conventionnels, ce qui rend le traitement clinique difficile pour l’infection orale à Candida associée au biofilm7.
Le syndrome de Sjögren primaire (pSS) est une maladie auto-immune caractérisée par une sécheresse de la bouche, des yeux secs et d’autres symptômes systématiques8. La sécheresse buccale est le symptôme le plus fréquent du pSS. La salive a d’importantes fonctions antifongiques physiologiques. D’une part, il peut diluer et récurer la bouche et ensuite éliminer les organismes de la muqueuse. D’autre part, la salive contient des protéines antimicrobiennes, telles que la lactoferrine, la sialoperoxydase, le lysozyme, des polypeptides riches en histidine et des anticorps anti-candidiques spécifiques, qui peuvent interagir avec la muqueuse buccale et empêcher la prolifération de Candida6. La réduction du flux salivaire peut prédisposer les patients atteints de pSS à la candidose buccale. Une étude transversale observationnelle menée auprès de 61 patients atteints de pSS a révélé que 13,1 % des patients atteints de pSS présentaient des signes buccaux de candidose et que la corrélation significative et négative entre l’unité formant une colonie (UFC)/mL de Candida albicans était significativement et négativement corrélée avec les niveaux de salive entière non stimulée (UWS) et de salive entière stimulée (SWS)9.
Les méthodes introduites dans ce manuscrit permettent d’identifier l’infection orale à Candida sur la base d’attributs morphologiques caractérisés (par exemple, les hyphes et les cellules de levure) lors d’un frottis direct ou après la culture10. L’identification de la souche de Candida à l’aide d’une gélose diagnostique Candida est basée sur la formation de colonies de différentes couleurs avec une morphologie variée, qui résultent du clivage des substrats chromogènes par des enzymes spécifiques à l’espèce11. Dans ce manuscrit, des méthodes systématiques de détection de l’infection orale à Candida sont présentées, y compris la culture orale traditionnelle de Candida et l’examen rapide par frottis à l’hydroxyde de potassium (KOH) et au test de coloration au blanc de calcofluor (CFW)10. De plus, le test de sensibilité aux antifongiques, qui peut guider le traitement clinique de l’infection orale à Candida , a été introduit. Dans des situations réelles, il n’est pas nécessaire d’effectuer toutes les méthodes introduites dans ce manuscrit ; la ou les méthodes de détection orale de Candida peuvent être sélectionnées en fonction de l’objectif. L’examen de l’infection orale à Candida et la détermination des souches de Candida chez les patients atteints de pSS sont non seulement bénéfiques pour le traitement de la maladie, mais aident également à évaluer la caractérisation de la candidose buccale et les profils d’espèces.
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Protocol
Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été approuvées par le comité d’éthique de l’hôpital Tiantan de Pékin, Université médicale de la capitale (NO. KY2023-177-01), et tous les patients impliqués dans cette étude ont fourni un consentement éclairé.
1. Critères d’inclusion et d’exclusion des patients
- Critères d’inclusion : Classer les patients comme patients atteints de pSS s’ils répondent aux critères12 de l’American College of Rheumatology (ACR) et de la Ligue européenne contre le rhumatisme (EULAR) de 2016. Plus précisément, baser les critères de classification finaux sur la somme pondérée de cinq éléments : positivité des anticorps anti-SSA/Ro et sialadénite lymphoïde focale avec un score de focalisation de ≥ 1 foyers/4 mm2, chacun obtenant un score de 3 ; un score de coloration oculaire anormal de ≥ 5 (ou score de van Bijsterveld de ≥ 4), un résultat de test de Schirmer de ≤ 5 mm/5 min et un débit salivaire non stimulé de ≤ 0,1 mL/min, chacun obtenant un score de 1. Les personnes présentant des signes et/ou des symptômes évocateurs de SS qui ont un score total de ≥ 4 pour les éléments ci-dessus répondent aux critères de PSS.
- Critères d’exclusion : Exclure les patients qui ne peuvent pas coopérer au prélèvement d’échantillons et les patients qui reçoivent un traitement pour une infection orale à Candida .
REMARQUE : Il est essentiel de noter que les méthodes décrites ci-dessous conviennent également à la caractérisation complète des infections orales à Candida chez les personnes atteintes de SS secondaire. - Pour prévenir les contaminations potentielles pendant la collecte, le transport et la culture des échantillons de Candida , prenez des précautions méticuleuses. Cela comprend une préparation expérimentale méticuleuse, l’utilisation de matériaux à usage unique et stériles, un étiquetage approprié, le scellement sécurisé des tubes d’échantillonnage et la réalisation de procédures expérimentales dans une enceinte de biosécurité professionnelle.
2. Prélèvement d’échantillons
- Prélèvement de salive : Demandez aux patients de tenir le tube avec un entonnoir et de laisser la salive s’écouler progressivement dans le tube le long de la lèvre inférieure. À la fin du prélèvement, demandez au patient de cracher toute la salive restante dans la bouche dans le tube. Recueillir la salive pendant 15 min.
- Rince-bouche et prélèvement d’un écouvillon : Si le patient n’a pas de débit de salive non stimulé ou qu’il est extrêmement faible (moins de 0,03 mL/min), frottez au moins 10 fois la région de la muqueuse buccale suspectée d’être infectée par Candida buccale, puis demandez au patient d’utiliser 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; voir le tableau des matières) pour se rincer la bouche pendant 1 min. Conservez le rince-bouche dans un tube stérile de 50 ml et placez l’écouvillon dans le tube du rince-bouche.
REMARQUE : Pour les patients atteints de pSS dont le débit salivaire non stimulé est supérieur à 0,03 mL/min, l’étape 2.2 peut toujours être utilisée pour prélever des échantillons pour la détection de l’infection orale à Candida .
3. Traitement des échantillons
- Ajouter 1 mL de PBS à la salive recueillie. N’ajoutez pas de PBS dans le rince-bouche avec du PBS. Faites vibrer le tube du bain de bouche à l’aide d’un vortex pendant 1 min.
4. La culture du candida
- Pour faire le milieu de la gélose de Sabourand (SDA), dissoudre 70 g de SDA (voir le tableau des matières) dans 1000 mL d’eau distillée doublement.
- Stérile avec un autoclave à 121 °C pendant 15 min, mettre 10 mL de ce milieu SDA dans une boîte de culture microbiologique de 10 cm (voir le tableau des matériaux) et laisser refroidir.
- Prendre 200 μL de l’échantillon préparé à l’étape 3 et l’étaler sur les boîtes de culture microbiologique de 10 cm préparées avec 10 mL de milieu SDA à l’étape 4.2.
- Incuber pendant 48 h à 37 °C, et la colonie de Candida arrivera à maturité. Conservez temporairement la parabole SDA avec des colonies de Candida à 4 °C. Les colonies de Candida cultivées sur la parabole SDA peuvent être conservées pendant 2 à 4 semaines.
5. Identification de la souche de Candida
- Pour fabriquer le milieu, prélevez 47,7 g de poudre de gélose diagnostique Candida (voir tableau des matériaux), mettez-la dans 1000 mL d’eau doublement distillée et chauffez-la à 100 °C.
- Lorsque le milieu est légèrement bouillant, déposer 10 mL dans un plat de culture microbiologique de 10 cm et laisser refroidir.
- Dissoudre les colonies de Candida dans 500 μL de milieu SDA (étape 4), suspendre et dissocier par pipetage.
- Déposer sur une plaque 50 μL de l’échantillon contenant des colonies de Candida (étape 5.3) sur le milieu préparé à l’étape 5.2. Incuber pendant 48 h à 37 °C jusqu’à ce que les colonies de Candida soient matures.
- Selon la couleur et les motifs des colonies de Candida , déterminez la ou les souches de Candida acquises chez les patients atteints de pSS. Utilisez les critères d’identification de la souche de Candida suivants : la colonie vert émeraude est Candida albicans, la colonie bleu-gris est Candida tropicalis, les colonies roses avec des bords flous et les microvillosités sont Candida krusei, la petite colonie rouge violacé est Candida glabrata, la colonie blanc laiteux contient plusieurs souches dont Candida parapsilosis.
6. Essai de formation du biofilm de Candida
- Pour que la base d’azote de levure (YNB)-50 glucose (G) soit moyenne, pesez 1,34 g de YNB (voir le tableau des matériaux) et 1,98 g de D (+)-glucose (voir le tableau des matériaux). Dissoudre-les dans 200 mL d’eau distillée doublement.
- Pour préparer le milieu YNB-100G, prélevez 1,34 g de YNB et 3,96 g de D(+)-glucose et dissolvez-les dans 200 ml d’eau distillée doublement.
- Filtrez les solutions à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm (voir tableau des matériaux). Le milieu filtré YNB-50G et YNB-100G peut être stocké à 4 °C pendant 3 mois.
- À l’étape 5, prélevez les 3 colonies (ou plus) de la même souche sur les plats et transférez-les dans 200 μL de milieu YNB-50G (étapes 6.1 et 6.3) dans une plaque à 96 puits (voir le tableau des matériaux). Faites-le pour les souches observées dans le plat. Culture pendant la nuit à 37 °C avec agitation à 200 tr/min.
- Aspirez la suspension de Candida , ajoutez 1 mL de PBS, centrifugez les cellules de levure à 1500 x g pendant 5 min à température ambiante et jetez le surnageant. Répétez cette étape 2 fois dans le même tube.
- Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu YNB-100G et préparer différentes dilutions (1:10, 1:100 et 1:1000) des cellules. Prenez 200 μL de suspension à cellules dégradées et plaquez-les sur le milieu SDA de 10 cm par la méthode de la plaque en spirale13. Le placage est effectué à l’aide d’une machine qui dépose un volume connu d’échantillon sur une plaque de gélose rotative en quantité toujours décroissante sous la forme d’une spirale d’Archimède. Culture pendant 24-48 h à 37 °C.
- Calculer la concentration des cellules dans différentes dilutions en fonction du nombre d’UFC dans la plaque SDA à l’aide d’une méthode standard13. Comptez brièvement les colonies bien séparées sur chaque assiette. Comptez les colonies en un seul octant du bord extérieur vers le centre jusqu’à ce qu’au moins 25 colonies soient observées. Comptez également le reste de cet arc où le 25e décompte a eu lieu. Calculez la concentration des cellules en divisant le nombre de colonies par le volume de liquide correspondant à la zone sur laquelle le nombre de colonies a été obtenu13. Ajuster la concentration des cellules à 1 x 107 cellules/mL.
- Mettre 100 μL de suspension cellulaire dans YNB-100G dans une plaque à 96 puits et incuber à 37 °C pendant 2 h en agitant à 200 tr/min.
- Retirez prudemment le surnageant, lavez-le 2 fois avec du PBS et éloignez les cellules de levure flottantes. Le biofilm de Candida se forme au fond de la plaque de 96 puits.
7. Essai de formation d’hyphes
REMARQUE : Seul le Candida qui peut former des hyphes (comme le Candida albicans) peut être induit pour la formation d’hyphes. Passez à l’étape 8 pour une caractérisation plus approfondie de Candida qui ne peut pas former d’hyphes (comme Candida glabrata).
- Remettre en suspension la suspension de cellules de levure à l’étape 6.6 et ajuster la concentration cellulaire à 1 x 106 cellules/mL avec le milieu YNB-100G.
- Pour préparer le milieu de croissance complet RPMI 1640, ajouter 50 mL de sérum de veau fœtal (voir le tableau des matières) dans 450 mL de milieu RPMI 1640 (voir le tableau des matériaux) et conserver à 4 °C pour une expérience plus approfondie.
- Transvaser 2 μL de suspension de cellules de Candida diluées dans 200 μL de milieu de croissance complet RPMI 1640 dans une plaque de 96 puits et cultiver pendant la nuit à 37 °C pour laisser les hyphes et les cellules de levure se former.
8. Test de frottis KOH et test de coloration CFW
- Prélever 1 μL d’échantillons de l’étape 3, de l’étape 6 ou de l’étape 7 à l’aide d’une boucle moulée avec précision (voir le tableau des matériaux) et étaler une zone de 1 cm x 1 cm sur les lames de verre. Attendez qu’il sèche à température ambiante.
- Pour préparer une solution de KOH à 10 %, pesez 10 g de poudre de KOH (voir le tableau des matériaux) et dissolvez-la dans 100 mL d’eau bidistillée.
- Chauffez légèrement la lame avec une lampe à alcool jusqu’à ce que l’échantillon se dissolve. Teindre les lames préparées à l’étape 8.1 avec 10 % de KOH (étape 8.2) et couvrir avec un feuillet de couverture. Appuyez légèrement sur la lamelle pour rendre l’échantillon transparent.
- Visualisez les hyphes et les cellules de levure au microscope.
- Étalez les lames de teinture préparées à l’étape 8.1 avec une goutte de CFW (voir la Table des matériaux), recouvrez avec une lamelle et attendez 1 min.
- Visualisez les hyphes à l’aide d’un microscope à fluorescence aux grossissements de 100x et 200x. CFW est excité à 355 nm et détecté à 300-440 nm. Photographiez les images sous le temps d’exposition. Répétez l’opération 3 fois pour éviter les faux positifs.
9. Test de sensibilité antifongique
REMARQUE : Cet essai est effectué conformément aux instructions du fabricant pour la trousse de sensibilité fongique de type levure (microdilution ; voir le tableau des matériaux).
- Préparez les colonies de Candida (étape 4) de moins de 4 jours avec l’ampoule de NaCl à 0,85% (voir tableau des matériaux) et acquérez la suspension ayant la turbidité équivalente à 2 McFarland. Déterminez la turbidité selon le kit d’étalons McFarland (voir le tableau des matériaux). Utilisez la suspension Candida préparée instantanément.
- Pipeter 135 μL de milieu ATB F2 dans le kit contenant 3 x 104 cellules de levure/mL dans chaque cupule de la bandelette de test et mettre le couvercle. Mettez la bandelette de test dans un récipient scellé. Culture pendant 24 h à 35 °C.
- Observez la croissance du Candida avec une interprétation visuelle (reportez-vous au manuel d’utilisation). Pour la valeur de référence (plage de référence), reportez-vous au manuel d’utilisation. Vérifiez si le trou de contrôle se développe correctement. Si la croissance du trou de contrôle est insuffisante ou ne se développe pas, les résultats ne peuvent pas être lus et nécessitent encore 24 heures de culture.
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Representative Results
Dans cette étude, 12 patients atteints de pSS ont été sélectionnés comme patients représentatifs et ont fait l’objet d’un dépistage de l’infection orale à Candida (tableau 1). Parmi ces patients, certains patients présentaient des lésions buccales typiques de l’infection à Candida , notamment une chéilite angulaire (caractérisée par des fissures aux coins de la bouche, une desquamation et une hyperémie, Figure 1A), un œdème rouge vif sur la muqueuse gingivale, une pseudo-membrane filandreuse blanc jaunâtre (Figure 1B), une atrophie des papilles linguales et une muqueuse dorsale rouge vif de la langue (Figure 1C).
Parmi ces 12 patients impliqués dans la présente étude, 8 d’entre eux présentaient une infection orale à Candida, ce qui a été confirmé par la croissance de colonies de Candida sur les boîtes SDA (Figure 2A-C et Figure supplémentaire 1). La gélose diagnostique a montré que des infections orales à Candida albicans, Candida krusei et Candida glabrata existent chez ces patients atteints de pSS (Figure 2D-F, Figure supplémentaire 2A,B). Dans certains cas, plus d’une espèce de Candida a été détectée, comme une infection combinée à Candida albicans et Candida krusei, ainsi qu’une infection combinée à Candida albicans et Candida glabrata (figure 2D, figure supplémentaire 2A,B).
Le test de frottis KOH et le test de coloration CFW qui s’ensuit, utilisant des échantillons de salive ou d’écouvillonnage de la muqueuse buccale du patient, peuvent rapidement déterminer si le patient souffre d’une infection orale à Candida. Dans cette étude, la présence d’hyphes a été observée dans les deux échantillons oraux de patients atteints de pSS (Figure 3A, B). Le résultat a été validé par le test de coloration CFW, qui a montré une coloration fluorescente positive des hyphes (figures 3C et D). De plus, les hyphes d’un patient atteint de pSS infecté par Candida albicans par voie orale ont été inductibles par le test de formation d’hyphes (Figure 4A), et les hyphes induits ont été observés au microscope à fluorescence dans le test de coloration CFW (Figure 4D). De plus, le frottis KOH et le test de coloration CFW ont indiqué des spores fongiques et des pseudohyphes positifs chez un patient pSS atteint d’une infection à Candida krusei (figures 4B, E), et des spores fongiques chez un patient pSS atteint d’une infection à Candida glabrata (figures 4C et F), après la formation du biofilm de Candida.
Les tests de sensibilité aux antifongiques sont cruciaux pour guider la prise en charge clinique des infections orales à Candida chez les patients atteints de pSS. Ici, trois patients représentatifs ont été testés pour leur sensibilité antifongique à cinq agents couramment prescrits : le fluconazole, l’itraconazole, l’amphotéricine B, le voriconazole et le 5-fluconazole. Les résultats ont été interprétés conformément aux directives du fabricant. Les patients pSS 1 et 3 présentaient des sensibilités à tous les agents antifongiques testés (tableau 1)14,15. Le patient pSS 2 a présenté une réponse intermédiaire dose-dépendante au fluconazole et au voriconazole, une sensibilité dose-dépendante, intermédiaire à résistante à l’itraconazole, une résistance au 5-fluconazole et une sensibilité au traitement par amphotéricine B (tableau 2)14,15.
Figure 1 : Manifestations buccales représentatives de l’infection orale à Candida. (A) Chéilite angulaire (rhagades aux coins de la bouche, desquamation et hyperémie). (B) Une lésion érythémateuse avec œdème sur la muqueuse gingivale alvéolaire, avec une pseudo-membrane filandreuse blanc jaunâtre. (C) Dorsum atrophique des papilles linguales avec lésion érythème atrophique atrophique dispersée et irrégulière, rougie et circonscrite. Des flèches noires pointent vers les lésions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Identification de la gélose au dextrose Sabouraud (SDA) et de la souche de Candida. (A-C) La culture SDA d’échantillons oraux (salive, bain de bouche PBS ou échange de muqueuse buccale) de 3 patients pSS représentatifs atteints d’une infection à Candida. Le test d’identification de la souche de Candida à l’aide d’une gélose diagnostique de Candida montre des patients atteints de (D) Candida albicans et d’infections à Candida Krusei par voie orale, (E) d’infection à Candida albicans et (F) d’infection à Candida glabrata. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Test de frottis instantané à l’hydroxyde de potassium (KOH) et test de coloration au blanc de calcofluor (CFW). Le test a été réalisé à l’aide d’échantillons oraux (salive, bain de bouche PBS ou échange de muqueuse buccale) de 2 patients pSS représentatifs. Test de frottis KOH à l’aide de l’échantillon oral provenant (A) du patient pSS 1 et (B) du patient pSS 2. Des flèches noires et creuses pointent vers les hyphes. Test de coloration CFW à l’aide de l’échantillon oral du patient (C) pSS 1 et (D) du patient pSS 2. Des flèches blanches creuses pointent vers les hyphes et les spores fongiques. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Test de frottis à l’hydroxyde de potassium (KOH), test de coloration au blanc de calcofluor (CFW) des échantillons après culture. Test de frottis KOH à l’aide de la salive d’un patient pSS atteint d’une infection à Candida albicans, (B) d’un patient pSS d’une infection à Candida krusei et (C) d’un patient pSS atteint d’une infection à Candida glabrata. Test de coloration CFW des hyphes induits d’un patient pSS avec (D) une infection à Candida albicans, des spores fongiques et des pseudo-hyphes d’un patient (E) pSS avec une infection à Candida krusei, et des spores fongiques d’un patient (F) pSS avec une infection à Candida glabrata. Des flèches blanches creuses pointent vers les hyphes ; Des flèches blanches et pleines pointent vers les pseudo-hyphes. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Culture représentative de gélose au dextrose de Sabouraud (SDA) à l’aide d’échantillons oraux de patients atteints de pSS (salive, bain de bouche PBS ou échange de muqueuse buccale). (A-C) Culture SDA de Candida à l’aide d’échantillons oraux provenant de 3 patients pSS représentatifs. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Identification de la souche de Candida . L’identification du Candida possiblement infecté chez les 12 patients atteints de pSS à l’aide d’une gélose diagnostique à Candida . (A) L’identification de la souche de Candida à l’aide d’échantillons oraux de patients pSS 1-6. Patient pSS 1 : Candida albicans, 2 : Candida albicans, 3 : Candida albicans et Candida krusei, 4 : Candida albicans, 5 : Candida albicans et Candida glabrata, 6 : pas d’infection orale à Candida . (B) L’identification de la souche de Candida à l’aide d’échantillons oraux de patients pSS 7-12. Patient pSS 7 : Candida albicans, 8 : Candida albicans et Candida glabrata, 9 : pas d’infection orale à Candida , 10 : Candida albicans, 11 : pas d’infection orale à Candida , 12 : pas d’infection orale à Candida . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau 1 : Informations sur les patients atteints du syndrome de Sjögren primaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Résultats des tests de sensibilité aux antifongiques des patients14,15. Abréviations : S = sensible, I = intermédiaire, R = résistant, SDD = sensible à la dose, C = concentration. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Dans le présent manuscrit, nous fournissons une série de méthodes systématiques, simples et réalisables pour détecter les infections orales à Candida , identifier les souches de Candida et tester la sensibilité antifongique des médicaments couramment utilisés chez les patients atteints de pSS.
Dans des contextes pratiques, toutes les méthodes introduites dans ce manuscrit ne sont pas nécessaires. La ou les méthodes de détection orale de Candida peuvent être choisies en fonction de l’objectif spécifique. Les tests de frottis KOH et les tests de coloration CFW, utilisant des échantillons sans culture, peuvent déterminer rapidement et provisoirement la présence d’une infection orale à Candida chez les patients atteints de pSS. Cependant, ces méthodes ont un taux de faux négatifs relativement élevé16. S’il est difficile de confirmer l’infection, la culture de Candida est indispensable. La résistance aux médicaments est un facteur qui doit être pris en compte pendant le traitement ; certaines souches de Candida sont naturellement résistantes à certains médicaments antifongiques, par exemple, Candida krusei est naturellement résistant au traitement par Fluconazole17. Par conséquent, parfois, la souche de Candida doit être identifiée. Dans ce cas, la souche de Candida peut être identifiée par une gélose de diagnostic de Candida . À l’heure actuelle, le Candida, résistant aux médicaments, fait l’objet d’une attention croissante18. Le test de sensibilité aux antifongiques peut guider le traitement et ainsi éviter autant que possible la résistance aux médicaments pendant le traitement. Le test de formation de biofilm de Candida et le test de formation d’hyphes conviennent à la recherche liée à l’infection orale à Candida .
L’infection orale à Candida est l’une des complications les plus fréquentes chez les patients atteints de pSS4, affectant considérablement leur qualité de vie en raison de l’éventail de symptômes qu’elle provoque. Notamment, les patients atteints de pSS sont très sensibles à cette infection, et un traitement efficace nécessite souvent un traitement systémique et la coopération du patient19. Par conséquent, les infections orales à Candida sont souvent récurrentes dans cette population. Il est crucial d’identifier la candidose buccale et d’effectuer des tests de sensibilité antifongique pour guider le traitement. Parmi les méthodes détaillées dans ce manuscrit, la collecte d’échantillons oraux pour la détection de Candida et la culture ultérieure sont les étapes les plus critiques.
De plus, le Candida qui a une formation d’hyphes (comme Candida albicans) peut être facilement détecté par le test rapide de frottis KOH et le test de coloration CFW à l’aide d’échantillons collectés sans culture. Bien que la plupart des infections orales à Candida puissent être détectées et que les souches de Candida puissent être identifiées à l’aide des méthodes présentées dans ce manuscrit, certaines souches de Candida ne peuvent pas être identifiées à partir d’autres spécifiquement uniquement par des méthodes telles que la culture SDA, la culture de gélose diagnostique Candida, l’essai de formation de biofilm Candida et l’essai de formation d’hyphes. De plus, certaines souches de Candida ne peuvent pas être induites à produire des hyphes, comme Candida glabrata. L’identification des espèces basée sur l’ADN 18s basée sur la RT-PCR peut identifier avec précision les espèces de Candida en fonction de leur similitude génétique 10,20,21. Si nécessaire, l’identification des espèces basée sur l’ADN 18s RT-PCR peut être utilisée, par exemple, dans la recherche sur l’infection orale à Candida chez les patients atteints de pSS.
Par voie intrabuccale, la manifestation de l’infection à Candida peut se manifester par des lésions érythémateuses de la muqueuse, une stomatite dentaire et une fissuration de la langue. Dans la zone péribuccale, la colonisation de Candida provoque un aspect sec, craquelé et érythémateux7. La prévalence rapportée de la candidose buccale clinique varie considérablement chez les patients SS, allant de 0 % à 80 %. Les raisons possibles de la grande variation de la candidose buccale comprennent l’absence de symptomatologie claire et, plus important encore, les différents critères utilisés pour le diagnostic de la candidose buccale dans la littérature 8,9,12. De plus, les patients atteints d’une infection à Candida présenteraient un risque plus élevé de SS, et l’infection à Candida peut agir comme un signe précoce d’un SS22 ultérieur. Le diagnostic précoce du pSS est crucial pour le traitement et l’étude pathologique. Par conséquent, il est impératif de fournir des méthodes universelles, pratiques et réalisables pour identifier l’infection orale à Candida chez les patients atteints de pSS.
Bien que la dysbiose du microbiome intestinal, buccal et vaginal soit fréquente chez les patientes atteintes de pSS, les échantillons oraux montrent la plus grande étendue de variation microbienne1. Dans des conditions normales, le débit quotidien moyen de salive entière est de 1 à 1,5 L2. Jusqu’à 99 % de la salive est composée d’eau, et le 1 % restant est composé de protéines et d’ions. La salive jouerait un rôle important dans la détermination de la composition et de l’activité du microbiote buccal pour de multiples raisons3. La salive nettoie non seulement en permanence les dents, remplissant des fonctions cruciales d’hygiène bucco-dentaire dans des conditions saines, mais elle forme également un film revitalisant sur les surfaces buccales. Ce film fournit des récepteurs pour la fixation des bactéries, aide à la croissance des bactéries en leur fournissant des nutriments à partir de glycoprotéines et maintient un pH approprié pour la croissance bactérienne. De plus, la salive contient des facteurs antimicrobiens et anti-candidaux qui régulent et façonnent le microbiote. De plus, la salive contient des facteurs antimicrobiens et anti-candidaux, tels que l’adrénomédulline, la statérine, les histatines, les α-défensines, le lysozyme, les histatines, la lactoferrine et la calprotectine, qui régulent et façonnent le microbiote4. Le pSS est caractérisé par une dérégulation auto-immune et une hypofonction glandulaire. L’hyposalivation, une réduction du flux salivaire, est l’un des symptômes les plus répandus du pSS. La diminution du pH salivaire et du débit sont des facteurs de risque importants pour les infections orales à Candida 5. De plus, les infections à Candida sont signalées comme la deuxième complication orofaciale la plus fréquente associée au SS6. Les auteurs suggèrent que l’augmentation des infections à Candida chez les patients atteints de SS pourrait être liée non seulement à une diminution de la production de salive, mais aussi à la dérégulation immunologique inhérente au SS.
En conclusion, les méthodes pratiques et reproductibles pour l’infection orale à Candida et les tests de sensibilité aux antifongiques présentés dans ce manuscrit sont prometteuses pour améliorer l’identification clinique et le traitement des infections à Candida . De plus, ces procédures standardisées peuvent minimiser les incohérences dans les études de recherche liées à la candidose buccale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82201084), la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2022M722232), la Fondation pour la recherche postdoctorale de Pékin (2023-ZZ-020), le projet Miaopu de l’hôpital Tiantan de Pékin, l’Université médicale de la capitale (2023MP10) et le Fonds général de recherche, Conseil des subventions de recherche de Hong Kong (27111820 et 17116521).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | MERCK | SLGV004SL | |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | axygen | MCT-150-C-S | |
| 10 cm Microbiological Culture Dishes | Jet Bio-Filtration Co. Ltd | TCD000100 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Jet Bio-Filtration Co., Ltd | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | |
| 96-well Microplates | Corning | 3599 | |
| API 0.85% NaCl ampule | BIOMERIEUX | 20070 | |
| Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| CHROMagar Candida | CHROMagar | P002860 | Candida diagnostic agar |
| D(+)-Glucose Monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010518 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26170035 | |
| McFarland Standards Kit | BIOMERIEUX | 70900 | |
| Nunc precision molded loops | ThermoFisher Scientific | 254399 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | C10010500BT | |
| Potassium Hydroxide | Aladdin | P112284-500g | |
| PowerSoil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875119 | |
| Sabourand's Agar Medium | Solarbio | S9710 | |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino acids | Solarbio | Y8040 | |
| Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution) | BIOMERIEUX | 14204 |
References
- Wang, X., et al. Microbiota dysbiosis in primary Sjögren's syndrome and the ameliorative effect of hydroxychloroquine. Cell Rep. 40 (11), 111352 (2022).
- Humphrey, S. P., Williamson, R. T. A review of saliva: normal composition, flow, and function. J Prosthet Dent. 85 (2), 162-169 (2001).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontol 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Vila, T., Rizk, A. M., Sultan, A. S., Jabra-Rizk, M. A. The power of saliva: Antimicrobial and beyond. PLoS Pathog. 15 (11), e1008058 (2019).
- Serrano, J., et al. Risk factors related to oral candidiasis in patients with primary Sjögren's syndrome. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 25 (5), e700-e705 (2020).
- Napeñas, J. J., Rouleau, T. S.
- Mathews, S. A., Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Leung, K. C. M., McMillan, A. S., Cheung, B. P. K., Leung, W. K. Sjögren's syndrome sufferers have increased oral yeast levels despite regular dental care. Oral Dis. 14 (2), 163-173 (2008).
- Lundstrom, I. M., Lindstrom, F. D. Subjective and clinical oral symptoms in patients with primary Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 13 (6), 725-731 (1995).
- Alam, M. Z., et al. Candida identification: a journey from conventional to molecular methods in medical mycology. World J Microbiol Biotechnol. 30 (5), 1437-1451 (2014).
- Bauters, T. G., Nelis, H. J. Comparison of chromogenic and fluorogenic membrane filtration methods for detection of four Candida species. J Clin Microbiol. 40 (5), 1838-1839 (2002).
- Soto-Rojas, A. E., Villa, A. R., Sifuentes-Osornio, J., Alarcón-Segovia, D., Kraus, A. Oral candidiasis and Sjögren's syndrome. J Rheumatol. 25 (5), 911-915 (1998).
- Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Appl Microbiol. 25 (2), 244-252 (1973).
- Biomerieux. ATB FUNGUS 3 Sensitivity test for yeast-like fungi. REF 14204. Biomerieux. , (2014).
- Zhang, L., et al. The widely used ATB FUNGUS 3 automated readings in China and its misleading high MICs of Candida spp. to Azoles: Challenges for developing countries' clinical microbiology labs. PLoS One. 9 (12), e114004 (2014).
- Hu, L., Zhou, P., Zhao, W., Hua, H., Yan, Z. Fluorescence staining vs. routine KOH smear for rapid diagnosis of oral candidiasis-A diagnostic test. Oral Dis. 26 (5), 941-947 (2020).
- Samaranayake, L. P. Candida krusei infections and fluconazole therapy. Hong Kong Med J. 3 (3), 312-314 (1997).
- Lee, Y., Puumala, E., Robbins, N., Cowen, L. E. Antifungal drug resistance: Molecular mechanisms in Candida albicans and beyond. Chem Rev. 121 (6), 3390-3411 (2021).
- Rihab, B., Lina, E. H., Noémie, S. T., Jean, S., Marjolaine, G. The experience of dry mouth and screening for Sjogren's syndrome by the dentist: patient-reported experiences. BMC Oral Health. 23 (1), 1010 (2023).
- Panpetch, W., et al. Oral Candida administration in a Clostridium difficile mouse model worsens disease severity but is attenuated by Bifidobacterium. PLoS One. 14 (1), e210798 (2019).
- Alwaily, E. R., Abood, M. S., Al Uobody, R. M. Diagnosis of oral candidiasis in patients under 12 years: 18S rRNA as a marker of molecular characterization of Candida tropicalis. Arch Razi Inst. 78 (1), 475-483 (2023).
- Chen, C. L., et al. Candida infection as an early sign of subsequent Sjögren's syndrome: A population-based matched cohort study. Front Med (Lausanne). 8, 796324 (2022).
