Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering af adeno-associerede virale vektorer gennem en enkelttrins og halvautomatisk heparinaffinitetskromatografiprotokol

Published: April 5, 2024 doi: 10.3791/66550
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,4, 1,2,5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,6, *1,2,4,5, *1,2,3,4
1CNC-UC - Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CIBB - Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3IIIUC - Institute for Interdisciplinary Research, University of Coimbra, 4ViraVector - Viral Vectors for Gene Transfer Core Facility, University of Coimbra, 5FFUC - Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 6MICC-CNC - Microscopy Imaging Center of Coimbra - CNC, University of Coimbra
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskript beskriver en detaljeret protokol til generering og oprensning af adeno-associerede virale vektorer ved hjælp af en optimeret heparinbaseret affinitetskromatografimetode. Det præsenterer en enkel, skalerbar og omkostningseffektiv tilgang, hvilket eliminerer behovet for ultracentrifugering. De resulterende vektorer udviser høj renhed og biologisk aktivitet, hvilket beviser deres værdi i prækliniske undersøgelser.

Abstract

Adeno-associeret virus (AAV) er blevet en stadig mere værdifuld vektor for in vivo genlevering og gennemgår i øjeblikket humane kliniske forsøg. Imidlertid gør de almindeligt anvendte metoder til rensning af AAV'er brug af cæsiumchlorid eller iodixanol densitetsgradient ultracentrifugering. På trods af deres fordele er disse metoder tidskrævende, har begrænset skalerbarhed og resulterer ofte i vektorer med lav renhed. For at overvinde disse begrænsninger vender forskere deres opmærksomhed mod kromatografiteknikker. Her præsenterer vi en optimeret heparinbaseret affinitetskromatografiprotokol, der fungerer som et universelt indfangningstrin til oprensning af AAV'er.

Denne metode er afhængig af den iboende affinitet af AAV serotype 2 (AAV2) for heparansulfatproteoglycaner. Specifikt indebærer protokollen co-transfektion af plasmider, der koder for de ønskede AAV-capsidproteiner med AAV2-proteiner, hvilket giver mosaik-AAV-vektorer, der kombinerer egenskaberne af begge forældreserotyper. Kort sagt, efter lysering af producentceller, renses en blanding indeholdende AAV-partikler direkte efter en optimeret enkelttrins heparinaffinitetskromatografiprotokol under anvendelse af et standard hurtigt proteinvæskekromatografisystem (FPLC). Oprensede AAV-partikler koncentreres efterfølgende og underkastes omfattende karakterisering med hensyn til renhed og biologisk aktivitet. Denne protokol tilbyder en forenklet og skalerbar tilgang, der kan udføres uden behov for ultracentrifugering og gradienter, hvilket giver rene og høje virale titere.

Introduction

Adeno-associeret virus (AAV) vektor erobrer sin vej som et af de mest lovende leveringssystemer i nuværende genterapistudier. AAV blev oprindeligt identificeret i 19651 og er en lille, ikke-indhyllet virus med et ikosaedrisk proteinkapsid på ca. 25 nm i diameter, der har et enkeltstrenget DNA-genom. AAV'er tilhører Parvoviridae-familien og Dependoparvovirus-slægten på grund af deres unikke afhængighed af co-infektion med en hjælpervirus, såsom herpes simplex-virus eller hyppigere adenovirus, for at fuldføre deres lytiske cyklus 2,3.

AAV'ernes 4,7 kilobase-genom består af to åbne læserammer (ORF'er) flankeret af to inverterede terminalgentagelser (ITR'er), der danner karakteristiske T-formede hårnåleender4. ITR'er er de eneste cis-virkende elementer, der er kritiske for AAV-pakning, replikering og integration, og er derfor de eneste AAV-sekvenser, der er bevaret i rekombinante AAV (rAAV) vektorer. I dette system leveres de gener, der er nødvendige for vektorproduktion, separat i trans, hvilket gør det muligt at pakke genet af interesse inde i det virale kapsid 5,6.

Hvert viralt gen kodificerer forskellige proteiner gennem alternativ splejsning og startkodoner. Inden for Rep ORF er fire ikke-strukturelle proteiner (Rep40, Rep52, Rep68 og Rep78) kodet, hvilket spiller afgørende roller i replikation, stedspecifik integration og indkapsling af viralt DNA 7,8. Cap ORF fungerer som en skabelon for ekspressionen af tre strukturelle proteiner, der adskiller sig fra hinanden ved deres N-endestation (VP1, VP2 og VP3), der samles til dannelse af et 60-mer viralt kapsid i forholdet 1:1:10 4,9. Derudover koder en alternativ ORF indlejret i Cap-genet med et ikke-konventionelt CUG-startcodon for et samlingsaktiverende protein (AAP). Dette nukleare protein har vist sig at interagere med de nyligt syntetiserede capsidproteiner VP1-3 og fremme capsidsamling10,11.

Forskelle i kapsidets aminosyresekvens tegner sig for de 11 naturligt forekommende AAV-serotyper og over 100 varianter isoleret fra mennesker og ikke-humant primatvæv 7,12,13. Variationer i konformationen af strukturelt variable regioner styrer de forskellige antigene egenskaber og receptorbindende specificiteter af kapsider fra forskellige stammer. Dette resulterer i forskellige vævstropismer og transduktionseffektivitet på tværs af forskellige pattedyrorganer14.

Tidlige produktionsmetoder for rAAV'er var afhængige af adenovirusinfektion til hjælperformål 15,16,17,18,19. På trods af at det er effektivt og normalt let at producere i stor skala, opstår der flere problemer som følge af denne infektion. Selv efter rensning og et varmedenatureringstrin til inaktivering kan adenovirale partikler stadig være til stede i AAV-præparater, hvilket udgør et uønsket sikkerhedsproblem20. Desuden er tilstedeværelsen af denaturerede adenovirale proteiner uacceptabel til klinisk brug. Andre produktionsstrategier drager fordel af rekombinante herpes simplex-virusstammer, der er konstrueret til at bringe Rep / Cap og transgen ind i målcellerne21 eller af baculovirus-insektcellesystemet22. Selvom disse systemer tilbyder fordele med hensyn til skalerbarhed og GMP-kompatibilitet, står de stadig over for lignende problemer.

Den tredobbelte transfektionsmetode til rAAV-produktion er almindeligt vedtaget for let at overvinde disse problemer. Kort fortalt er rAAV-samlingen afhængig af forbigående transfektion af celler med tre plasmider, der koder for: 1) transgenekspressionskassetten pakket mellem ITR'erne fra vildtype AAV2-genomet (pITR); 2) de Rep/Cap-sekvenser, der er nødvendige for replikering og virionsamling (pAAV-RC); og 3) de minimale adenovirale proteiner (E1A, E1B, E4 og E2A) sammen med de adenovirusvirusassocierede RNA'er, der kræves til hjælpereffekten (pHelper) 6,20,23. Mens plasmidtransfektionsmetoder giver enkelhed og fleksibilitet til rAAV-produktion i prækliniske undersøgelser, har disse procedurer begrænsninger med hensyn til skalerbarhed og reproducerbarhed, når de anvendes til storskalaproduktion. Som en alternativ tilgang kan rAAV-produktion opnås ved anvendelse af AAV-producentcellelinjer (med både vedhængende og suspensionsvækst), der stabilt udtrykker enten AAV Rep / Cap-gener eller Rep / Cap i kombination med vektorkonstruktioner. I disse systemer introduceres de adenovirale hjælpergener gennem plasmidtransfektion. Selvom denne strategi forbedrer skalerbarheden af cellekulturprocessen, er den teknisk kompleks og tidskrævende 21,24,25.

I begge tilfælde lyseres producentcellerne derefter og underkastes et eller flere rensningstrin. I øjeblikket omfatter de vigtigste metoder til rensning af rAAV'er anvendelse af cæsiumchlorid (CsCl) eller iodixanol centrifugering med ultrahøj densitetsgradient efterfulgt eller ej af kromatografiteknikker26. Det oprindelige rensningsskema for viral udfældning anvendte ammoniumsulfat efterfulgt af to eller tre runder ultracentrifugering gennem en CsCl-gradient. De vigtigste fordele ved denne proces omfatter muligheden for at rense alle serotyper og evnen til fysisk at adskille fulde partikler fra tomme kapsider baseret på deres forskellige tætheder. Denne metode er imidlertid omfattende, tidskrævende og har begrænset skalerbarhed, hvilket ofte resulterer i dårligt udbytte og lav prøvekvalitet 27,28,29,30. Desuden er dialyse mod en fysiologisk buffer ofte nødvendig før in vivo-undersøgelser på grund af de toksiske virkninger, som CsCl kan udøve på pattedyr.

Iodixanol er også blevet brugt som et alternativt iso-osmotisk gradientmedium til at rense rAAV-vektorer, med fordele i forhold til CsCl fra både sikkerheds- og vektorstyrkesynspunkt. Ligesom CsCl præsenterer iodixanolmetoden imidlertid nogle ulemper relateret til belastningskapaciteten af cellekulturlysat (og dermed skalerbarheden af rAAV-oprensning), og det forbliver en tidskrævende og dyr metode30,31.

For at overvinde disse begrænsninger vendte forskerne deres opmærksomhed mod kromatografiteknikker. I denne henseende blev der udviklet flere oprensningsmetoder, der enten inkorporerer affinitets-, hydrofobe eller ionbytterkromatografimetoder. Disse metoder er afhængige af de biokemiske egenskaber af en bestemt serotype, herunder deres naturlige receptorer, eller ladningsegenskaberne for den virale partikel32. For eksempel åbnede opdagelsen af, at AAV2, AAV3, AAV6 og AAV13 fortrinsvis binder til heparansulfatproteoglycaner (HSPG), muligheden for at anvende det nært beslægtede heparin i affinitetskromatografirensning. Imidlertid kan bindingsstederne til HSPG variere mellem serotyper, mediere AAV-binding og infektion af målceller på forskellige måder 2,33,34,35,36. På den anden side binder AAV1, AAV5 og AAV6 til N-bundet sialinsyre (SA), mens AAV4 bruger O-bundet SA 2,14,34. Efter samme rationale er der også udviklet en enkelttrins affinitetskromatografiprotokol til oprensning af rAAV5 baseret på brugen af mucin, et pattedyrprotein, der er højt beriget i SA37. Ligesom heparinbaserede teknikker er denne oprensning også afhængig af den specifikke serotype, der genereres. Bortset fra heparin og mucin er andre ligander blevet undersøgt for affinitetskromatografi, såsom A20 monoklonalt antistof og kamelid enkeltdomæneantistoffer (AVB Sepharose og POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. Andre innovative strategier til forbedring af de tidligere eksisterende rensningsmetoder involverer indførelse af små modifikationer i rAAV-kapsidet for at præsentere specifikke bindende epitoper. For eksempel kan hexa-histidin-mærkede eller biotinylerede rAAV'er renses ved hjælp af ligander, der er målrettet mod disse epitoper (henholdsvis nikkelnitrilotrieddikesyre og avidinharpikser)42,43,44.

I et forsøg på at udvide de ønskede egenskaber ved rAAV'er har efterforskere krydsklædt virionerne ved at blande deres kapsider. Dette opnås ved at tilføre capsidgenet fra to forskellige AAV-serotyper i ækvimolære eller forskellige forhold under produktionen, hvilket giver anledning til en capsidstruktur sammensat af en blanding af capsidunderenheder fra forskellige serotyper 34,45,46,47,48,49,50. Tidligere undersøgelser giver fysisk bevis for, at co-ekspression af capsidproteiner fra AAV2 med AAV1 (1: 1-forhold) og AAV2 med AAV9 (1: 1-forhold) resulterer i generering af mosaik rAAV1/2 og rAAV2/9-vektorer, henholdsvis 45,46,48. En stor fordel ved genereringen af mosaik rAAV'er er evnen til at integrere fordelagtige træk fra forskellige AAV-serotyper, hvilket resulterer i synergistiske forbedringer i transgenekspression og tropisme, samtidig med at andre egenskaber, der er nyttige under rAAV-produktion, opretholdes. Interessant nok udviser visse mosaikvarianter endda nye egenskaber, der adskiller sig fra begge forældrevirus 46,47,49. Ved at udnytte AAV2's heparinbindende evne kan mosaik rAAV-vektorer potentielt genereres og renses ved at blande AAV2 med andre naturlige eller nye AAV-kapsider genereret af rettet evolution og / eller rationelt design. Ikke desto mindre har tidligere undersøgelser fremhævet vigtigheden af capsid-underenhedskompatibilitet, når man forsøger at samle mosaikvektorer. For eksempel viste Rabinowitz og kolleger, at selvom transkapsidationen af AAV1, AAV2 og AAV3 førte til en effektiv samling af mosaikkapsider, forhindrede krydsdressing af disse serotyper med AAV4 dannelsen af stabile virioner 34,45,47. Derudover viste AAV1, AAV2 og AAV3 lav kompatibilitet med AAV5 i betragtning af de reducerede virale titere opnået ved blanding af disse kapsider i forskellige forhold. Interessant nok viste mosaik rAAV2/5 nedsatte heparinbindende egenskaber, samtidig med at mucinbindingsevnen blev opretholdt som forældrenes AAV5. Imidlertid bevarede rAAV3/5 i forholdet 3: 1 den dobbelte binding til heparin og mucin. Samlet set kan genereringen af nye mosaik-rAAV'er med forbedret transduktion, specifik tropisme eller lav immunogenicitet i høj grad drage fordel af vores forståelse af capsidsamling og receptorinteraktioner, hvor specifikke kombinationer stadig kræver grundig undersøgelse og optimering.

I dette arbejde beskriver vi en trin-for-trin protokol til produktion og oprensning af rAAV'er ved hjælp af en optimeret heparinaffinitetskromatografimetode. rAAV'er fremstilles ved forbigående transfektion og renses ved hjælp af et hurtigt proteinvæskekromatografisystem (FPLC). Efter koncentrationen af udvalgte oprensede fraktioner karakteriseres de resulterende virale bestande med hensyn til titer, renhed, iboende fysiske egenskaber og biologisk aktivitet in vitro og in vivo. Som et bevis på konceptet demonstrerer vi forbedringerne og anvendeligheden af denne protokol til generering af mosaik rAAV1/2 og rAAV2/9 vektorer. Valget af hver serotype var baseret på deres slående forskellige tropismer, hvilket potentielt også gav deres unikke egenskaber til mosaikversionerne. AAV serotype 1, med en generel moderat tropisme for centralnervesystemet (CNS), har evnen til at transducere neuroner og glia (i mindre grad) og gennemgår aksonal transport i anterograd og retrograd retninger in vivo 2,7,8. Derudover blev AAV serotype 9 valgt for sin naturlige evne til at krydse blod-hjerne-barrieren og målrette CNS i både nyfødte og voksne mus51,52. Endelig blev AAV serotype 2 valgt på grund af dets evne til at binde til heparin, hvilket tillader affinitetskromatografi33. De oprensede rAAV1/2- og rAAV2/9-partikler kombinerer egenskaberne af begge forældre-AAV-serotyper og udgør derfor egnede vektorer til transduktion af CNS 45,46,48,49.

Protocol

BEMÆRK: Se figur 1 for en illustration, der opsummerer protokollen. Se materialetabellen for detaljer om alle materialer, instrumenter og reagenser, der anvendes i denne protokol. Alt arbejde, der involverer celler og vira, bør udføres i særlige biosikkerhedsskabe og inkubatorer, der er adskilt fra dem, der regelmæssigt anvendes til vedligeholdelse af cellelinjer. Udstyr og reagenser, der kommer i kontakt med dyrkede celler og vira, skal være sterile. Det er vigtigt, at bortskaffelse af farlige reagenser og materialer, der er forurenet med virus, udføres i overensstemmelse med sikkerhedsdatabladene og i overensstemmelse med de nationale love og retningslinjer, der er fastsat af hver institutions kontor for miljø, sundhed og sikkerhed. Fra april 2019 kategoriserer NIH-retningslinjerne for forskning, der involverer rekombinante eller syntetiske nukleinsyremolekyler, som risikogruppe 1-midler (ikke forbundet med sygdom hos raske voksne mennesker) alle AAV-serotyper samt rekombinante eller syntetiske AAV-konstruktioner. Denne klassificering gælder, når transgenet ikke koder for et potentielt tumorigent genprodukt eller et toksin, og konstruktionerne produceres uden en hjælpervirus.

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med EU's fællesskabsdirektiv (2010/63/EU) om pasning og anvendelse af forsøgsdyr, der blev gennemført i portugisisk lov i 2013 (lovdekret 113/2013). Derudover blev dyreforsøg godkendt af den ansvarlige organisation for dyrevelfærd ved Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet og Center for Neurovidenskab og Cellebiologi ved University of Coimbra licenseret dyrefacilitet. Forskerne modtog tilstrækkelig uddannelse (FELASA-certificeret kursus) og certificering fra de portugisiske myndigheder (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lissabon, Portugal) til at udføre eksperimenterne.

1. Plasmid konstruktioner

  1. Følg producentens anvisninger for et maxiprep-endotoksinfrit sæt til isolering og rensning af betydelige DNA-mængder af følgende plasmider: i) pITR: overførselsvektoren af interesse; ii) pAAV-RC-plasmid: pRV1, der indeholder AAV2 Rep - og Cap-sekvenserne 36 iii) pAAV-RC-plasmid: pH21, der indeholder AAV1 Rep - og Cap-sekvenserne 36 iv) pAAV-RC-plasmid: pAAV2/9n, der indeholder sekvenserne AAV2 Rep og AAV9 Cap v) pHelper: pFdelta6, adenovirus-hjælper plasmid36.
  2. Screene integriteten af de genererede plasmider ved at udføre de anbefalede enzymatiske begrænsninger36. Overvåg integriteten af pITR-plasmider ved fordøjelse med SmaI, en restriktionsendonuklease, som skærer to gange inden for en ustabil del af ITR53,54.
    BEMÆRK: Da ITR'erne er meget ustabile og modtagelige for sletninger, anbefales det at bruge SURE 2 superkompetente celler for at minimere rekombination på disse steder.

2. Cellekultur

  1. Kultur human embryonal nyre 293, der stabilt udtrykker SV40 stort T-antigen (HEK293T) cellelinje i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) høje glukose, suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 37 °C under en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2 som udgangspunkt for efterfølgende trin.
  2. Subkultur cellerne ved hjælp af steril 1x fosfatbufret saltvand (PBS), pH 7,4, for at vaske cellerne, før der tilsættes 0,05% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA).
    BEMÆRK: Undgå at bruge celler, der har gennemgået et for stort antal passager (maksimalt 20). Test regelmæssigt cellekulturer for mycoplasmakontaminering.

3. rAAV-produktion ved transient transfektion

  1. Dag 1: Cellebelægning
    1. For hver viral produktion plades HEK293T celler i 10 behandlede kulturskåle (15 cm diameter) dagen før transfektion med en densitet på 10,5 × 106 celler pr. skål i 22 ml suppleret dyrkningsmedium og inkuberes i 24 timer, indtil cellerne er 70% -80% sammenflydende og klar til transfektion.
  2. Dag 2: Celletransfektion ved hjælp af polyethylenimin (PEI)
    1. For hver viral produktion (svarende til 10,5 skåle) opsættes følgende transfektionsblanding i et mikrocentrifugerør: 54,6 μg pITR; 45,675 μg pRV1; 45,675 μg pH21 eller pAAV2/9n; 109,2 μg pFdelta6. Bland ved at trykke.
    2. Tilsæt blandingen til 4.557 ml ikke-suppleret DMEM i et 50 ml centrifugerør. Bland ved at trykke.
    3. Tilsæt 1,365 ml steril PEI-opløsning ved 1 mg / ml (pH 7,4), dråbe for dråbe. Bland ved at trykke. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur for at tillade dannelse af DNA-PEI-komplekser.
    4. Tilsæt denne blanding til 231 ml forvarmet suppleret DMEM. Udskift hele kulturmediet i hver skål med 22 ml af denne transfektionsblanding. Inkuber cellerne i 48 timer.
      BEMÆRK: Dette trin skal udføres med omhu for at undgå celleløsning.
  3. Dag 4: Cellehøst
    1. Når pITR koder for en fluorescerende reporter, visualiseres de transfekterede celler under et fluorescensmikroskop.
    2. Saml substratet fra hver skål i 50 ml centrifugeglas og centrifuger dem ved 800 × g i 10 minutter. Supernatanten kasseres.
      BEMÆRK: Dette trin er valgfrit og sigter mod at gendanne transfekterede celler, der kan have løsnet sig på grund af en meget høj sammenløb.
    3. Der tilsættes 10 ml forvarmet PBS til hver plade. Cellerne fjernes forsigtigt med en celleskraber, og suspensionen opsamles i 50 ml centrifugeglassene fra trin 3.3.2.
    4. Der vaskes 5 skåle ad gangen med yderligere 10 ml PBS, og suspensionen overføres til 50 ml centrifugeglassene fra trin 3.3.3. Pellet cellerne ved 800 × g i 10 minutter og kassér supernatanten.
    5. Cellepillerne fryses ved -80 °C.
      BEMÆRK: Cellepiller kan opbevares i flere måneder (pausepunkt).

4. rAAV-ekstraktion og FPLC-rensning

  1. Dag 5: Cellelysat forberedelse
    1. Optø cellepillerne ved stuetemperatur. Resuspender cellerne opsamlet fra de 10 skåle i 100 ml af en steril buffer indeholdende 150 mM natriumchlorid (NaCl) og 20 mM Tris, pH 8,0, i ultrarent (type I) vand. Opslæmningen blandes med pipettering op og ned for at sikre en homogen suspension.
    2. Tilsæt 12,5 ml frisklavet steril opløsning af 10% natriumdeoxycholat i ultrarent vand for at inducere cellelyse. Bland ved pipettering op og ned.
      BEMÆRK: Bortskaf natriumdeoxycholat samt de materialer, der er i kontakt med det, i overensstemmelse med sikkerhedsdatabladet og retningslinjerne fra institutionens kontor for miljøsundhed og sikkerhed. Det anbefales også at bære en ansigtsmaske, mens du håndterer dette pulver. Efter blanding bliver opløsningen meget viskøs.
    3. Der tilsættes 27 μL benzonasenuklease til den foregående blanding. Bland grundigt ved pipettering op og ned, indtil prøven ikke længere er tyktflydende. Der inkuberes ved 37 °C i 1 time, og der udføres en hvirvel hvert 10. minut.
      BEMÆRK: Denne endonuklease er i stand til effektivt at nedbryde alle former for DNA og RNA uden at udvise nogen proteolytisk aktivitet.
    4. Celleaffald fjernes ved centrifugering ved 3.000 × g i 60 minutter ved 25 °C. Supernatanten filtreres med et 0,45 μm sterilt polyvinylidendifluorid (PVDF)-sprøjtefilter og overføres til en ny steril beholder.
      BEMÆRK: Dette vigtige trin sikrer, at det meste af det cellulære affald fjernes, hvilket forhindrer tilstopning af kromatografikolonner. Gem en lille prøve af denne blanding til analyse (valgfrit trin).
  2. Dag 5 (fortsat): Heparinsøjlerensning af rAAV'er
    BEMÆRK: Prøvepåføring kan udføres ved hjælp af en prøvepumpe eller en 50 ml eller 150 ml superloop som en del af systemet. Da mere luft opløses ved lavere temperaturer, er det vigtigt at give tilstrækkelig tid til, at buffere og opløsninger (normalt opbevaret ved 4 °C) kan akklimatisere sig til stuetemperatur, før de anvendes i FPLC-systemet.
    1. Valgfrit: Hvis systemet har været opbevaret i lange perioder, skal systemet og alle indtag fyldes med frisklavet opbevaringsopløsning (20 % ethanol) ved hjælp af manuelle instruktioner eller en foruddefineret systemrensningsmetode (system CIP).
    2. Vask væskestrømningsvejen fuldstændigt med sterilt ultrarent vand ved hjælp af manuelle instruktioner eller en foruddefineret system-CIP-metode.
    3. Tilslut en 1 ml færdigpakket heparinsøjle, indstil trykalarmen, og vask med fem kolonnevolumener (CV'er) ultrarent vand med en strømningshastighed på 1 ml / min.
    4. Opløsningerne i bufferbakken skiftes fra ultrarent vand til buffer A (steril opløsning af 100 mM NaCl og 20 mM Tris, pH 8, i ultrarent vand) til indløb A (systempumpe A) og buffer B (steril opløsning af 500 mM NaCl og 20 mM Tris, pH 8, i ultrarent vand) til indløb B (systempumpe B). Hvis systemet har en prøvepumpe, anbringes bufferindtaget til prøveindløbsventilen i buffer A.
    5. Vask systempumpen B med buffer B, og fyld resten af væskestrømningsvejen med buffer A.
      BEMÆRK: Afbryd om nødvendigt kolonnen fra flowstien, og tilslut den igen bagefter.
    6. Der anbringes et prøveindløbsrør fra prøveindløbsventilen, f.eks. S1, i beholderen med det virale præparat opnået i trin 4.1.4. (fra cellelysatpræparat). Prim strømningsvejen fra prøveindtag S1 til injektionsventilen med prøveopløsningen. Alternativt kan du fylde en 50 ml eller 150 ml superloop med prøven indeholdende rAAV'er ved hjælp af en 50 ml sprøjte.
    7. Kolonnen afbalanceres med et samlet volumen på fem CV'er ved hjælp af 12,5% buffer B med en hastighed på 1 ml / min.
    8. Påfør prøvens samlede volumen i kolonnen ved hjælp af prøvepumpen (vælg injicer hele prøven ved hjælp af luftsensor) eller superloopet ved 0,5 ml/min., og opsaml gennemstrømningen ved hjælp af udløbsporten i en ny steril beholder.
      BEMÆRK: Når flowkontrollen for at forhindre overtryk er aktiveret, falder flowet automatisk i tilfælde af tilstopning af kolonnen. Hvis strømningshastigheden falder betydeligt til under 0,5 ml/min, skal prøvepåføringen standses, vaskes med 2-5 CV buffer A og derefter prøvepåføringen genoptages.
    9. Vask kolonnen ved 1 ml/min med 20 CV buffer A, og opsaml gennemstrømningen ved hjælp af udløbsporten.
    10. Eluer prøven ved 1 ml/min med følgende skema: i) lineær gradient med et mål på 50% af buffer B for fem CV'er; ii) trin med et mål på 90 % af buffer B i løbet af fem CV'er iii) trin med et mål om 100% af buffer B under fem CV'er.
    11. Den eluerede prøve opsamles i 1 ml fraktioner ved hjælp af en fraktionsopsamler og mikrocentrifugeglas med lav retention (2 ml), og de opbevares ved -20 °C.
      BEMÆRK: rAAV-fraktionerne kan opbevares i flere uger (pausepunkt).
    12. Genbalancer kolonnen ved 1 ml/min med 12,5% buffer B for fem CV'er.
    13. Skift indtagene fra bufferopløsningerne til ultrarent vand, og vask søjlen ved 1 ml/min for fem CV'er.
    14. Skift indtagene fra ultrarent vand til 20% ethanol, og vask kolonnen ved 1 ml / min for fem CV'er. Afbryd kolonnen, og opbevar den ved 4 °C.
      BEMÆRK: Søjler kan genbruges flere gange uden andre større rengørings- og desinficeringsprocedurer, hvis den samme rAAV-serotype og transgen anvendes.
    15. Vask væskestrømningsvejen fuldstændigt med 20% ethanol ved hjælp af manuelle instruktioner eller en foruddefineret system-CIP-metode.

5. Koncentration af rensede rAAV'er

  1. Dag 6: Koncentrationstrin 1
    1. Koncentrer rAAV'er ved hjælp af en 15 ml centrifugalfilterenhed med en 100 kDa molekylvægtsafskæring. Fyld de ønskede fraktioner indeholdende rAAV'er (FPLC-fraktionerne 7 til 16) i 15 ml centrifugalfilterenheden, og centrifuger den ved 2.000 × g i 2 minutter ved stuetemperatur. Sørg for, at det koncentrerede volumen i filterenheden er ca. 500 μL. Hvis det koncentrerede volumen stort set overstiger 500 μL, gentages centrifugeringstrinnene med intervaller på 1 min., indtil det ønskede volumen nås.
  2. Dag 6 (fortsat): Bufferudveksling
    1. Der tilsættes 1 ml steril PBS til centrifugalfilterenheden, der indeholder rAAV'erne. Pipette forsigtigt op og ned for at vaske filteret. Der centrifugeres ved 2.000 × g med intervaller på 1 min., indtil det endelige volumen på 500 μL er nået.
  3. Dag 6 (fortsat): Koncentrationstrin 2
    1. De 500 μL koncentrerede rAAV'er, der blev opnået i det foregående trin, overføres til en 0,5 ml centrifugalfilterenhed med en 100 kDa molekylvægtsafskæring og centrifugeres ved 6.000 × g i 1 min. Gentag om nødvendigt centrifugeringstrinnet, indtil et endeligt volumen på mindre end 100 μL er nået.
  4. Dag 6 (fortsat): Restitution
    1. For at genvinde den koncentrerede rAAV skal filteranordningen placeres på hovedet i et nyt mikrocentrifugeopsamlingsrør. Anbring røret i en mikrocentrifuge med hætten mod midten og udfør en langvarig drejning inde i strømningskammeret for at overføre koncentrerede rAAV'er fra enheden til mikrocentrifugerøret. Alternativt centrifugeres ved 1.000 × g i 2 min.
    2. Suppler med steril Pluronic F-68 0,001% (valgfrit).
      BEMÆRK: Pluronic F-68 er et ikke-ionisk overfladeaktivt stof, der er godkendt til human brug af Food and Drug Administration, der er i stand til at afbøde tab af rAAV'er ved at forhindre deres interaktioner med overfladerne af materialer (plast), der anvendes under fortyndingsforberedelse, sprøjtepåfyldning og leveringsudstyr55,56.
    3. Alikvote rAAV'er i mikrocentrifugeglas med lav retention og opbevares ved -80 °C (pausepunkt).

6. Kvantificering af rensede rAAV'er

  1. Dag 6 (fortsat): Titeren af rAAV-præparater, udtrykt i virale genomer/μL (vg/μL), bestemmes ved kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (RT-qPCR) ved hjælp af et kommercielt sæt og efter producentens anvisninger.
    1. rAAV-partikelopløsningen inkuberes med DNase I ved 37 °C i 20 min.
      BEMÆRK: Denne procedure fremmer fordøjelsen af frit genomisk DNA og plasmid-DNA afledt af værtsceller og sikrer således, at kun nukleinsyresekvensen inde i intakte rAAV-partikler bevares.
    2. Varmeinaktiver DNase I ved 95 °C i 10 min.
    3. Tilsæt lysisbuffer og inkuber i 10 minutter ved 70 °C for at fremme varmedenaturering af proteinerne i rAAV-partikler.
    4. Den opnåede rAAV-genomopløsning fortyndes i fortyndingsbuffer, inden der fortsættes til RT-qPCR. Der fremstilles et sæt serielt fortyndede standarder for den positive kontrol (fra 2 × 107 vg/μL til 2 × 102 vg/μL), der følger med sættet.
    5. Der udføres en reaktionsblanding indeholdende 12,5 μL Taq II-blanding, 0,5 μL fortyndet primerblanding, 7 μL vand og 5 μL fortyndet rAAV-DNA (ukendt AAV-prøve og standarder fra trin 6.1.4.).
    6. Udfør RT-qPCR i et PCR-detektionssystem i realtid ved hjælp af følgende protokol: 1 cyklus ved 95 °C i 2 minutter (indledende denaturering) og 40 cyklusser ved 95 °C i 5 s (denaturering) og 60 °C i 30 s (udglødning, forlængelse og pladeaflæsning) efterfulgt af en smeltekurveanalyse.
    7. Den absolutte prøvekoncentration beregnes ud fra standardkurven (lineær regressionslinje) under hensyntagen til den fortyndingsfaktor, der fremkommer ved forberedelsen af rAAV-prøven.
      BEMÆRK: Kvantificeringen af antallet af virale genomer opnås gennem amplifikation af ITR-sekvensen af AAV2 (målsekvens af primerne tilvejebragt af sættet).

7. SDS-PAGE, Coomassie blå farvning og western blot

  1. 40 μL af hver prøve (hver FPLC-fraktion, gennemstrømningen, prækolonneprøverne og i alt 2,3 × 1010 vg af det koncentrerede slutprodukt) denatureres ved tilsætning af 6x prøvebuffer (0,5 M Tris-HCl/0,4 % natriumdodecylsulfat (SDS) pH 6,8, 30 % glycerol, 10 % SDS, 0,6 M dithiothreitol (DTT), 0,012 % bromphenolblåt) og inkubation af prøverne i 5 minutter ved 95 °C.
  2. Læg de denaturerede prøver (48 μL) i en SDS-polyacrylamidgel (4% stabling og 10% opløsningsgel) og udfør den elektroforetiske adskillelse ved 100 V i 70 minutter ved siden af en proteinstige.
  3. Proteinanalyse
    BEMÆRK: Enten Coomassie blå farvning eller western blotting kan udføres.
    1. Coomassie blå farvning
      1. For at visualisere proteinbånd skal du plette gelen i 10 minutter med en 0,25% Coomassie blå G250-opløsning opløst i 50% methanol og 10% eddikesyreis.
      2. Udfør gelfarvning ved at vaske det flere gange med en opløsning indeholdende 25% methanol og 5% eddikesyre istid, indtil klare bånd med lav baggrund bliver synlige.
      3. Tag billeder ved hjælp af et passende billedbehandlingssystem.
    2. Vestlig blottelse
      1. Overfør proteinerne til en PVDF-membran i henhold til standardprotokoller.
      2. Bloker membranen ved inkubation i 5% fedtfri mælk fortyndet i TBS-T (0,1% Tween 20 i Tris-bufret saltvand) i 1 time ved stuetemperatur.
      3. Der anvendes følgende primære antistoffer (fortyndet i blokerende opløsning) til inkubation natten over ved 4 °C: monoklonalt anti-AAV fra mus, VP1, VP2, VP3-antistof (B1, 1:1.000) eller monoklonalt anti-AAV-, VP1- og VP2-antistof fra mus (A69, 1:1.000).
      4. Membranerne vaskes i 3 x 15 min i TBS-T og inkuberes med et sekundært antistof mod mus (1:10.000) i 2 timer ved stuetemperatur.
      5. Vask membranerne i 3 x 15 min i TBS-T. Tilføj forbedret kemifluorescerende substrat (ECF) og visualiser proteinbånd ved kemifluorescensbilleddannelse.

8. Transmissionselektronmikroskopi (TEM)

  1. Placer et Formvar-kulstofbelagt 200 maskegitter på hovedet oven på en dråbe af en rAAV-prøve, og lad det bundfælde sig i 1 min.
  2. Vask gitterene i en dråbe vand og tør væskeoverskuddet med filterpapir.
  3. Plet gitterene negativt med 1% uranylacetatopløsning (pH 7) i 1 minut for at fiksere og kontrastere de virale partikler.
  4. Vask gitterene i en dråbe vand og tør væskeoverskuddet med filterpapir.
  5. Undersøg prøverne i et transmissionselektronmikroskop.
    BEMÆRK: Høje saltkoncentrationer kan direkte påvirke bindingen af rAAV'er til gitteret og føre til visualisering af krystallignende strukturer.

9. Fortløbende ultraviolet synlig lysabsorption, statisk lysspredning og dynamisk lysspredningsanalyse

  1. På en kvantificeringsplade med 96 brønde fyldes 2 μL af en rAAV-prøve og 2 μL PBS, der skal bruges som bufferblindprøve (dette udføres to gange).
  2. Brug programmet AAV Quant i klientanalysesoftwaren, placer navnene på prøverne på den korrekte placering af pladen, vælg AAV-serotypen, og klik på Næste.
  3. Læg 96-brønds kvantificeringspladen i det dedikerede udstyr, og fortsæt med pladeaflæsning til dataindsamling.

10. In vitro-transduktionsassays

  1. Forskellige cellelinjer kan bruges til hurtigt at analysere transduktionseffektiviteten af rAAV'er.
    1. Jævnt frø HEK293T celler i 24-brøndplader (ved en tæthed på 137.500 celler / brønd) og en mus neuroblastom-2A (Neuro2a) cellelinje i enten 24-brønd plader (50.000 celler / brønd) eller i en 8-brønd kammer dias (27.000 celler / brønd) ved hjælp af DMEM høj glukose, suppleret med 10% føtalt bovin serum og 1% penicillin-streptomycin, som beskrevet ovenfor. Lad cellerne klæbe natten over ved 37 °C i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2.
    2. Det konditionerede substrat opsamles fra hvert hul (250 μL fra plader med 24 huller og 50 μL fra objektglasset med 8 huller), og det opbevares ved 4 °C til senere brug.
    3. Følgende rAAV-præparater tilsættes til hvert hul, og cellerne inkuberes i 24 timer ved 37 °C i en 5 % CO2 atmosfære.
      1. Der tilsættes 50 μL af de FPLC-opsamlede fraktioner F2-F16 og gennemstrømning til HEK293T celler, der er belagt med plader med 24 brønde.
      2. Der tilsættes i alt 5,5 × 109 vg koncentrerede rAAV'er fortyndet i 50 μL PBS til Neuro2a-celler belagt i plader med 24 brønde (der tilsættes en negativ kontrolbrønd ved tilsætning af 50 μL PBS til cellerne).
      3. Der tilsættes i alt 2,75 × 109 vg koncentrerede rAAV'er fortyndet i 25 μL PBS til Neuro2a-celler belagt i et 8-brønds kammerglas (inkluder den negative kontroltilstand ved tilsætning af 50 μL PBS til cellerne).
    4. Det tidligere opbevarede konditionerede substrat (trin 10.1.2) tilsættes til hvert hul og inkuberes i 24 timer.
    5. Kassér mediet og vask cellerne 2x med PBS.
    6. Der tilsættes en 4 % paraformaldehydopløsning (PFA), suppleret med 4 % saccharose i PBS, forvarmet til 37 °C, til hvert hul og inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter.
    7. Der vaskes 2x med PBS og opbevares ved 4 °C, indtil billeddannelsen er udført (pausepunkt).
    8. Få billeder på et inverteret fluorescensmikroskop udstyret med et 10x/0,30 mål eller et inverteret konfokalmikroskop udstyret med et 40x/1,4 Oil DIC-mål.
  2. For at få en mere relevant og reflekterende model af in vivo-miljøet skal du bruge primære neuronale kulturer som følger:
    1. Forbered primære kulturer af kortikale neuroner som tidligere beskrevet af Santos et al.57. Kort sagt, frø 200.000 celler / ml i 12-brøndplader og hold dem i kultur indtil dag in vitro 16.
    2. Det konditionerede substrat opsamles fra hvert hul (100 μL) og opbevares ved 4 °C til senere brug.
    3. De rAAV'er, der skal testes, tilsættes til hvert hul: i alt 2,75 × 109 vg koncentreret rAAV fortyndet i 25 μl PBS (minus kontrol: 25 μL PBS). Der inkuberes i 24 timer ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
    4. Det konditionerede medium, der tidligere er opbevaret, tilsættes og inkuberes i 24 timer.
    5. Kassér mediet i hvert hul og vask 2x med PBS.
    6. Cellerne fikseres med 4 % PFA/4 % saccharose i PBS som beskrevet i trin 10.1.6. Vask 2x med PBS.
    7. Hvert hul inkuberes med 5 μg/ml hvedekimagglutinin (WGA) konjugeret med Alexa Fluor 633 i 10 minutter ved stuetemperatur (valgfrit trin: udfør immuncytokemi i stedet). Vask 2x med PBS.
    8. Inkuber i 0,25% Triton X-100 i PBS i 5 min ved stuetemperatur. Vask med PBS.
    9. Der inkuberes med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask 2x med PBS.
    10. Få billeder på et inverteret fluorescensmikroskop udstyret med et 40x/0,95 mål eller et inverteret konfokalmikroskop udstyret med et 40x/1,4 Oil DIC-mål.

11. In vivo-forsøg

BEMÆRK: Dyrene blev anbragt i et temperaturkontrolleret rum, der blev opretholdt i en 12 timers lys/mørk cyklus. Mad og vand blev leveret ad libitum. Alle bestræbelser blev gjort for at minimere dyrenes lidelser.

  1. Stereotaxic injektion i cerebellum
    1. Bedøv 9 uger gamle C57BL/6 dyr ved indånding af 2% isofluran i nærvær af ilt (0,8 l/min) i et kammer forbundet med en fordamper.
    2. Det bedøvede dyr anbringes i stereotaksapparatet (på en 35 °C opvarmet pude), og isofluranmasken anbringes i dyrets næse. Skru isofluranniveauet ned til 1,3-1,7%.
      BEMÆRK: Sørg for, at dyret er korrekt bedøvet, før du fortsætter (tab af refleksen til bøjning i begge bagben).
    3. Påfør smøremiddel øjensalve for at undgå tørring af hornhinderne og injicer dyret med et godkendt smertestillende middel.
      BEMÆRK: Alle efterfølgende trin skal udføres under sterile forhold.
    4. Efter barbering af pelsen på dyrets hoved og desinfektion af det kirurgiske område udsættes kraniet og placeres spidsen af en 30 G stump injektionsnål, der er forbundet med en 10 μL Hamilton-sprøjte, direkte over bregma (brug bregma som nul til beregning af stereotaksiske koordinater).
    5. Flyt nålen til den tilsigtede koordinat, og bor et hul gennem kraniet, hvor nålen kommer ind.
      BEMÆRK: Inden for rammerne af denne undersøgelse blev en enkelt injektion udført centralt i lillehjernen.
    6. 4 μL af en opløsning af rAAV'er indeholdende i alt 8 × 109 vg, fortyndet i PBS, injiceres med en infusionshastighed på 0,5 μl/min ved hjælp af en automatisk injektor. Brug følgende koordinater, beregnet ud fra bregma, til at udføre en enkelt injektion centralt i lillehjernen hos en voksen C57BL/6-mus: antero-posterior: -6,5 mm; lateral: 0 mm; ventral: -2,9 mm.
      BEMÆRK: Disse koordinater kan variere afhængigt af musestammen, køn og alder på de anvendte dyr.
    7. For at minimere tilbagestrømning og tillade viral vektordiffusion, når infusionen er afsluttet, skal du lade sprøjtenålen stå ved disse koordinater i 3 minutter, derefter langsomt trække den tilbage med 0,3 mm og lade den forblive på plads i yderligere 2 minutter, før den fjernes fuldstændigt fra musehjernen.
    8. Luk snittet og rengør det med et desinfektionsmiddel (f.eks. 10% povidon-jod).
    9. Lad dyrene komme sig efter anæstesi, før de returneres til deres hjemmebure.
  2. Opsamling og forberedelse af væv
    BEMÆRK: I dette eksperiment blev transduktionsniveauerne observeret 12 uger efter injektion, men den samme procedure kunne evalueres så hurtigt som 4 uger efter injektionen.
    1. Dyrene bedøves terminalt ved intraperitoneal administration af en overdosis xylazin/ketamin (8/160 mg/kg legemsvægt).
    2. Transkardielt perfusere dyrene med iskold PBS i 6 minutter med en hastighed på 2,5 ml/min, efterfulgt af perfusion med en frisklavet iskold 4% PFA-opløsning i 10 minutter med samme hastighed.
    3. Postfix de udskårne hjerner i 4% PFA natten over ved stuetemperatur og overfør dem derefter til en 25% saccharose/PBS opløsning til kryobeskyttelse. Når hjernen synker (ca. 48 timer senere), opbevares den ved -80 °C.
    4. Skær serielle sagittale sektioner med en tykkelse på 30 μm ved hjælp af en kryostat ved -21 °C. For hvert dyr samles 96 sagittale sektioner af en hjernehalvkugle i anatomiske serier som fritsvævende sektioner i PBS suppleret med 0,05% natriumazid. Opbevares ved 4 °C indtil videre forarbejdning.
  3. Standard fluorescens immunhistokemi
    1. Vælg otte sagittale sektioner pr. Dyr i en afstand af 240 μm fra hinanden.
    2. De fritflydende sektioner inkuberes i blokerende/permeabiliseringsopløsning (0,1% Triton X-100 indeholdende 10% normalt gedeserum (NGS) i PBS) i 1 time ved stuetemperatur.
    3. Sektionerne inkuberes natten over ved 4 °C med kyllingens polyklonale anti-GFP primære antistof (1:1.000).
    4. Vask i 3 x 15 min i PBS og inkuber sektionerne i 2 timer ved stuetemperatur med det sekundære antistof ged polyklonalt anti-kylling antistof konjugeret til Alexa Fluor 488 fluorofor (1:200).
    5. Vask i 3 x 15 min i PBS. Inkuber med DAPI i 5 min ved stuetemperatur.
    6. Vask i 3 x 15 min i PBS. Anbring sektionerne i gelatinebelagte dias og dæksel med fluorescensmonteringsmedium.
    7. Få billeder på et diasscannerfluorescensmikroskop udstyret med et 20x/0,8 mål.

Representative Results

I dette arbejde præsenterer vi en detaljeret protokol til produktion, oprensning og karakterisering af mosaik-rAAV'er (opsummeret i figur 1), som har potentialet til at målrette og transducere CNS (f.eks. AAV1 og AAV9), samtidig egnet til heparinaffinitetskromatografirensning (AAV2). For at opnå dette blev kapsider fra naturlige AAV-serotyper 1, 2 og 9 brugt til at udvikle mosaik rAAV1/2 og rAAV2/9 vektorer.

Før start blev plasmidpræparater screenet for strukturel integritet. Ud over de fordøjelser, der er nødvendige for at validere den korrekte indsættelse af kloningsfragmenter, er det vigtigt konsekvent at screene pITR-plasmider for at detektere potentielle ITR-sletninger/indsættelser. Som et eksempel blev integriteten af ITR'er i forskellige kloner af et pITR-plasmid overvåget efter plasmidfordøjelsen med restriktionsenzymet SmaI (supplerende figur S1).

Begge typer mosaikvektorer blev genereret ved co-transfektion af de respektive AAV-capsidplasmider i et forhold på 1: 1 ifølge standardtransfektionsmetoder6. Kort fortalt blev HEK293T celler transfekteret med i) et plasmid indeholdende transgenet af interesse pakket mellem ITR (pITR) sekvenserne, ii) et plasmid indeholdende vildtype AAV genomet Rep og Cap ORF'er af AAV2 og AAV1 eller AAV9 (pAAV-RC plasmider) og iii) et plasmid, der kodificerer de adenovirale proteiner (E1A, E1B, E4 og E2A) samt adenovirusvirusassocierede RNA'er, der er afgørende for hjælperfunktioner (pHelper). Otteogfyrre timer senere blev cellerne høstet 6,36, og rAAV'er blev renset fra cellehomogenatet ved affinitetskromatografi ved anvendelse af et FPLC-system. Som vist i figur 2A blev cellelysatet indeholdende rAAV'erne efter kolonneligevægt (ligevægtstrin) påført kolonnen (prøveindlæsning). På grund af rAAV2's naturlige affinitet for heparin33 blev rAAV'er bundet til søjlens harpiks, mens andre komponenter blev udført i løbebufferen og detekteret af UV-monitoren (gennemstrømning), hvilket resulterede i en stigning i absorbansen. Søjlen blev efterfølgende vasket (vasketrin), og rAAV'er blev endelig elueret ved en stigning i NaCl-koncentrationen (elueringstrin). De eluerede vira blev detekteret af UV-monitoren og opsamlet i 1 ml fraktioner.

En repræsentativ elueringstopprofil for rAAV1/2 og rAAV2/9 er vist i henholdsvis figur 2B og supplerende figur S2A, hvor forskellige virale batcher konsekvent præsenterer en enkelt top startende ved fraktion F7 op til F16. Tophøjden varierer blandt rAAV-produktioner, hvor højere toppe normalt fører til højere rAAV-udbytter. Hver fraktion af den producerede rAAV1/2 og rAAV2/9 blev efterfølgende karakteriseret ved RT-qPCR til vurdering af virale titere (figur 2C og supplerende figur S2B).

For at karakterisere renheden af det eluerede materiale blev 40 μL af hver fraktion og af det respektive gennemstrømning undersøgt ved 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (figur 2D for rAAV1/2 og supplerende figur S2C for rAAV2/9). Coomassie-blå farvning afslørede tre hovedbånd i fraktioner F7-F16 med molekylvægte svarende til VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) og VP3 (62 kDa) capsidproteiner af AAV'er i de passende forhold 1: 1: 10, som tidligere beskrevet af Van Vliet og kolleger14. I begge tilfælde og baseret på UV-absorbans, RT-qPCR og gelbåndintensitet er det klart, at størstedelen af mosaik-rAAV'er er til stede i fraktionerne F7 og F8 og gradvist begynder at falde i fraktionerne F9-F16. Ud over de tre virale kapsidproteiner blev der påvist et andet protein (eller proteiner) på ca. 17 kDa i fraktionerne F8-F16.

For at eliminere dette eller disse co-rensende proteiner blev fraktionerne F7-16 efterfølgende filtreret og koncentreret ved hjælp af 100 KDa centrifugalfilterenheder, og den endelige rAAV-titer blev bestemt ved RT-qPCR (som vist i figur 3A,B for rAAV1/2). Det endelige udbytte af en rAAV-produktion afhænger af længden og kompleksiteten af pITR, integriteten af ITR-sekvenser, cellekulturbetingelser (f.eks. Antal cellepassager) og transfektionseffektivitet 24,58,59,60,61. Ikke desto mindre kan den endelige titer justeres ved at udføre flere centrifugeringer af rAAV-præparatet ved hjælp af 0,5 ml centrifugalfilterenheder (koncentrationstrin 2). I henhold til denne protokol består koncentrationerne normalt mellem 2 × 109 og 5 ×10 10 vg/μL for et slutvolumen i området fra 50 til 100 μL (kvantificering udført ved hjælp af det refererede titreringssæt).

Renheden af de endelige rAAV-præparater blev derefter evalueret på en 10% SDS-polyacrylamidgel. Som vist i figur 3C blev der kun observeret tre bånd, der repræsenterer rAAVs capsidproteiner, for rAAV1/2-præparatet, og der blev ikke identificeret påviselige co-rensende proteiner. Disse resultater var i overensstemmelse med dem, der blev opnået for rAAV2/9 (supplerende figur S2C). For at bekræfte identiteten og yderligere karakterisere renheden af rAAV1/2- og rAAV2/9-vektorer blev virale fraktioner og koncentrerede stammer analyseret af western blot, med de specifikke antistoffer B1 (supplerende figur S3A og supplerende figur S4A) og A69 (supplerende figur S3B og supplerende figur S4B). Mens antistoffet B1 genkender en C-terminal epitop, der er fælles for alle VP-proteiner af de fleste AAV-serotyper62, genkender klonen A69 kun epitoper af VP1 og VP263. Ikke desto mindre kan nogle svage bånd med molekylvægte lavere end VP3 (<62 kDa) også detekteres ved B1- og A69-mærkning.

For at karakterisere den strukturelle morfologi og yderligere evaluere renheden af rAAV'er blev de virale partikler direkte visualiseret af TEM. Denne teknik har været standardproceduren til vurdering af prøveintegritet og renhed i virale prøver, da den tillader kvantificering af tomme og fulde rAAV-partikler samt vurdering af kontaminering i en prøve 29,64,65,66,67. Som vist i figur 3D kunne store mængder rAAV-partikler, ~ 25 nm i diameter, observeres på en ren baggrund. Tomme partikler (sort pil) med et elektrontæt center samt fulde vektorer (hvid pil) kunne også observeres i hele prøvefeltet.

Vi udførte også kvalitetskontrol af de oprensede rAAV'er ved hjælp af Stunner, en platform, der kombinerer ultraviolet synlig (UV-Vis) spektroskopi, statisk lysspredning (SLS) og dynamisk lysspredning (DLS)68. For hver prøve blev den totale mængde protein, ssDNA, samt absorberende urenheder og baggrundsturbiditet målt ved UV-Vis-spektroskopi (figur 3E og supplerende figur S5A). SLS og DLS blev derefter anvendt til at vurdere lysspredningsadfærden for rAAV-kapsider. Da AAV'er har en gennemsnitlig diameter på 25 nm, betragtes partikler inden for et diameterområde på 15-45 nm som intakte. Større partikler repræsenterer typisk virale aggregater, og alt mindre består sandsynligvis af små partikler, herunder usamlede capsidproteiner68. For rAAV1/2 blev der observeret en enkelt top svarende til intakte kapsidpartikler ved 30 nm (figur 3F) med 0% af aggregatintensiteten og 0% af den lille partikelintensitet. For rAAV2/9-præparatet blev der også påvist en top ved 30 nm, der repræsenterede en 78% kapsidintensitet (supplerende figur S5B). Selvom den lille partikelintensitet var 0%, blev der for denne prøve målt en samlet intensitet på 22% (afbildet med gråt), med det største bidrag (19,9%) fra store aggregater med en gennemsnitlig diameter på 620 nm (supplerende figur S5B). Gennem kombinationen af UV-Vis-spektroskopi med SLS- og DLS-information afslørede Stunner den samlede samlede capsidtiter, fuld capsidtiter, frit og aggregeret protein samt frit og aggregeret ssDNA for de to virale præparater, vist i figur 3G og supplerende figur S5C (specifikke værdier angivet i hver figurforklaring).

Parallelt blev HEK293T celler inficeret med 50 μL af hver FPLC-opnået fraktion (F2-F16) af enten rAAV1/2- eller rAAV2/9-præparatet for at evaluere den biologiske aktivitet af de udviklede mosaik-AAV-vektorer. Da rAAV1/2-vektoren koder for et enkeltstrenget grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af en CMV-promotor (pAAV-CMV-ssGFP), og rAAV2/9-vektoren koder for en selvkomplementær GFP under kontrol af CMV-promotor (pAAV-CMV-scGFP53), blev direkte GFP-fluorescens undersøgt i disse celler 48 timer efter infektion (supplerende figur S6 og supplerende figur S7). I overensstemmelse med de tidligere observationer for RT-qPCR, Coomassie blue og western blot, blev det højeste infektivitetsniveau opnået for virale fraktioner F7 og F8, gradvist faldende i fraktionerne F9 til F16.

For at bekræfte, om den biologiske aktivitet af rAAV'er blev opretholdt efter ultrafiltrerings- og koncentrationstrin, blev Neuro2A-celler, belagt i både 24-brøndplader og et 8-brønds kammerglas, inficeret med den koncentrerede rAAV1/2-vektor, der koder for scGFP under kontrol af CMV-promotor (pAAV-CMV-scGFP53). Brightfield- og fluorescensbilleder blev erhvervet 48 timer efter infektion (figur 4A, B for billeder med højere opløsning).

Med det formål at undersøge den infektiøse kapacitet af de producerede rAAV'er i en mere relevant og reflekterende cellemodel blev halvtætte primære neuronale kulturer fra cortex podet på en 12-brøndplade og inficeret med den tidligere anvendte rAAV1/2 - CMV-scGFP. Otteogfyrre timer efter infektion blev celler fastgjort og mærket med DAPI og WGA konjugeret med Alexa Fluor 633, Et meget anvendt lektin til mærkning af faste celler. Billederne vist i figur 4C,D er taget med en Zeiss Axio Observer Z1 og på en Zeiss konfokal LSM 710. Som afbildet i disse figurer ved direkte GFP-fluorescens bevarer koncentrerede mosaikvira deres genoverførselsegenskaber for neuronale celler.

Efter at have karakteriseret mosaik rAAV'er med hensyn til renhed, fysiske egenskaber og funktionalitet in vitro, vurderede vi derefter muligheden for at anvende de rensede rAAV1/2 mosaikvektorer til at transducere lillehjernen hos C57BL/6 mus. Til det blev en stereotaksisk injektion udført i 9 uger gamle mus, og GFP-ekspressionen blev evalueret 12 uger senere. Som forventet udviste dyr injiceret med PBS ingen fluorescens ved GFP-immunmærkning. Epifluorescensbilleder fra mus injiceret med rAAV1/2-vektorer, der koder for GFP under kontrol af synapsin 1-promotor (rAAV1/2 - Syn-ssGFP) afslørede, at rAAV1/2-vektorer med succes transducerede flere regioner i lillehjernen, nemlig de dybe cerebellære kerner (DCN) -regionen såvel som de forskellige lobuler i cerebellum (figur 5). Disse resultater viser den langvarige ekspression af transgenet i pattedyrhjernen (12 uger).

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af produktions- og rensningsprotokollen for rAAV. rAAV'er fremstilles ved forbigående transfektion af HEK293T celler ved anvendelse af polyethylenimin (PEI). Derefter høstes og lyseres celler, og rAAV'er renses fra cellehomogenatet via affinitetskromatografi. De indsamlede fraktioner indeholdende rAAV'er koncentreres derefter, og de endelige virale bestande karakteriseres med hensyn til titer, renhed, morfologiske træk og biologisk aktivitet. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; PEI = polyethylenamin; RT-qPCR = kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: FPLC-rensningsprotokol og repræsentativ elueringsprofil for rAAV1/2. A) Skematisk gengivelse af en komplet kromatogramprofil, der viser de forskellige stadier i rAAV-rensningsprocessen. Efter et kolonneligevægtstrin påføres prøven. Søjlen vaskes derefter, og elueringen udføres med stigende koncentrationer af NaCl. Det ubundne materiale (gennemstrømning) og 1 ml fraktioner af de eluerede vira opsamles til analyse. Absorbansen ved 280 nm udtrykkes i mAU, og x-aksen angiver rumfanget i ml. B) Forstørret partielt kromatogram med rAAV1/2-elueringstop (sort) med de tilsvarende brøktal (F2-F16) og affald (angivet med rødt). Den udstedte koncentration af buffer B og ledningsevne (udtrykt i mS/cm) er også vist i henholdsvis grønt og lilla. C) RT-qPCR for hver fraktion, der indsamles under affinitetsrensning (F2-F16) og gennemstrømning. Titeren i vg/μL er repræsenteret på en logaritmisk skala. D) SDS-PAGE-analyse af de indsamlede virale fraktioner. Lige store volumener (40 μL) af hver fraktion fra elueringstrinnet (F2-F16) og respektive gennemstrømning blev fyldt og opløst på en 10% SDS-polyacrylamidgel. Proteinbånd blev visualiseret af Coomassie blå farvning. Bånd svarende til AAV capsidproteiner VP1, VP2 og VP3 er angivet. Standard proteinstørrelsesstige betegnes som (L), og de tilsvarende molekylvægte er også angivet. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; RT-qPCR = kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering af de koncentrerede rAAV1/2-vektorer. A) Amplifikationskurver for en koncentreret rAAV1/2-prøve (i blåt), serielt fortyndede standarder fra 2 × 107 vg/μL til 2 × 102 vg/μL (sort) og en kontrol uden skabelon (i grønt) opnået under RT-qPCR. B) Standardkurve (lineær regression) til bestemmelse af titeren af en rAAV-prøve i vg/μL. (C) SDS-PAGE-analyse af de koncentrerede virale partikler. I alt 2,3 × 1010 vg af det koncentrerede lager blev samlet på gelen. (D) Transmissionselektronmikroskopibillede af rAAV1/2-partikler med ~25-30 nm i diameter. Tomme partikler med et elektrontæt center (fremgår af sorte pile) kan skelnes fra fulde kapsider (fremgår af hvide pile). Skala bar = 100 nm. E) Absorbansspektrum for et rAAV1/2-præparat målt ved bedøvelse (sort). Bidraget fra proteiner (i blåt), ssDNA (i grønt), andre UV-absorberende forbindelser eller urenheder (i lilla) og baggrundsturbiditet (i grå) vises også. F) DLS-intensitetsfordeling af rAAV1/2 med en enkelt top ved 30 nm, målt ved Stunner. En kapsidspredningsintensitet på 100% blev bestemt ved at måle arealet under kurven fra 15 til 45 nm (skraveret grønt). (G) Stunner analyse af et rAAV1/2 vektorpræparat, der udviser en total capsidtiter på 1,19 × 1014 cp/ml (mørkeblå) og en fuld capsidtiter på 1,73 × 1013 vg/ml (mørkegrøn). Et frit og aggregeret protein på 7,16 × 1012 cp/ml ækvivalenter (lyseblå) samt et frit og aggregeret ssDNA på 1,04 × 1012 vg/ml ækvivalenter (lysegrøn) blev også målt. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; RT-qPCR = kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese; ssDNA = enkeltstrenget DNA; DLS = dynamisk lysspredning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: In vitro infektivitetsvurdering af en koncentreret rAAV1/2 prøve. (A) Neuro2A-celler blev inficeret med rAAV1/2 - CMV-scGFP eller inkuberet med et tilsvarende volumen PBS som en negativ kontrol. Brightfield og fluorescens billeder af celler afbildet 48 timer efter infektion. Billeder blev erhvervet i en Zeiss Axio Observer Z1 (10x mål). Skalastænger = 100 μm. (B) Detaljerede billeder af Neuro2A-celler 48 timer efter infektion med rAAV1/2 - CMV-scGFP. Billeder blev erhvervet i en Zeiss LSM 710 (40x mål). Skalastænger = 20 μm. (C) Halvtætte primære neuronale kulturer inficeret med rAAV1/2 - CMV-scGFP eller inkuberet med et ækvivalent volumen PBS, der tjener som en negativ kontrol. Celler blev mærket med en nuklear plet (DAPI i blåt) og en membranplet (WGA i hvidt). Billeder blev erhvervet i en Zeiss Axio Observer Z1 (40x mål). Skalastænger = 20 μm. (D) Detaljerede billeder af halvtætte primære neuronale kulturer 48 timer efter infektion med rAAV1/2 - CMV-scGFP. Billeder blev erhvervet i en Zeiss LSM 710 (40x objektiv). Skalastænger = 20 μm. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; CMV = cytomegalovirus; scGFP = selvkomplementært grønt fluorescerende protein; PBS = fosfatbufret saltvand DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; WGA = hvedekimagglutinin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: In vivo transduktionseffektivitet af rAAV1/2 efter en intraparenkymal injektion. Repræsentative immunfluorescensbilleder, der viser den udbredte GFP-ekspression (i grønt) i hele lillehjernen ved en central injektion af rAAV1/2 - Syn-ssGFP i lillehjernen. Kerner blev farvet med DAPI (i blåt). Skalastænger = 500 μm. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; Syn = Synapsin 1; ssGFP = enkeltstrenget grønt fluorescerende protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; PBS = fosfatbufret saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Agarosegelanalyse af et rAAV-vektorplasmid fordøjet med SmaI. Seks kloner (C1-C6) af en pITR blev fordøjet med SmaI-restriktionsenzym (bane 2, 4, 6, 8, 10 og 12), som skærer to gange inden for hver inverteret terminalgentagelse. I dette tilfælde forventes en fuldstændig fordøjelse af denne pITR at generere to bånd (3,796 bp og 3,013 bp). I vellykkede præparater (C1, C3, C4 og C5) er et bånd på 6809 bp, der skyldes delvis fordøjelse, stadig synligt (~ 5% af det samlede antal). I præparater med ITR-rekombination vendes proportionerne (C2), eller fordøjelsen forekom ikke (C6). De respektive ikke-fordøjede kloner præsenteres også (bane 3, 5, 7, 9, 11, 13). Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; ITR = omvendt terminalgentagelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: rAAV2/9-oprensning ved heparinbaseret affinitetskromatografi. (A) Elueringsprofil for rAAV2/9 med en enkelt top (i sort) efter en stigning i koncentrationen af NaCl. De indsamlede fraktioner er angivet med tal (2-16) med rødt nederst på grafen, absorbansen ved 280 nm udtrykkes i mAU, ledningsevnen udtrykkes i mS/cm, og x-aksen angiver volumenet i ml. B) rAAV-titere kvantificeret ved RT-qPCR for hver poolet fraktion (F2-F16) og gennemstrømning. Værdier er repræsenteret på en logaritmisk skala. (C) Renhedsanalyse ved SDS-PAGE og Coomassie blå farvning. Lige store volumener (40 μL) af hver fraktion (F2-F16) og det respektive gennemløb blev indlæst og opløst på en 10% SDS-SIDE. Det koncentrerede lager blev kvantificeret ved hjælp af RT-qPCR, og 2,3 × 1010 vg blev fortyndet i 40 μL PBS og samlet på gelen. Proteinbånd blev visualiseret af Coomassie blå farvning. AAV-capsidproteinerne (VP1, VP2 og VP3) er angivet. Standard proteinstørrelsesstige er betegnet med (L), og de tilsvarende molekylvægte er også angivet. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; RT-qPCR = kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Western blot-analyse af rAAV1/2-vektorer oprenset med FPLC. (A) De indsamlede fraktioner og koncentrerede rAAV1/2-vektorer blev opløst på en SDS-PAGE-gel og undersøgt med musemonoklonalt anti-AAV-antistof (B1), der genkender VP1-, VP2- og VP3-capsidproteiner. (B) De indsamlede fraktioner og koncentrerede rAAV1/2-vektorer blev opløst på en SDS-PAGE-gel og undersøgt med musemonoklonalt anti-AAV-antistof (A69), der genkender VP1- og VP2-capsidproteiner. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; FPLC = hurtig proteinvæskekromatografi; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese; L = standard proteinstørrelse stige. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: Western blot-analyse af rAAV2/9-vektorer renset med FPLC. (A) De indsamlede fraktioner og koncentrerede rAAV2/9-vektorer blev opløst på en SDS-PAGE-gel og undersøgt med musemonoklonalt anti-AAV-antistof (B1), der genkender VP1-, VP2- og VP3-capsidproteiner. (B) De indsamlede fraktioner og koncentrerede rAAV2/9-vektorer blev opløst på en SDS-PAGE-gel og undersøgt med musemonoklonalt anti-AAV-antistof (A69), der genkender VP1- og VP2-capsidproteiner. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; FPLC = hurtig proteinvæskekromatografi; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese; L = standard proteinstørrelse stige. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S5: rAAV2/9 vektorkvantificering og karakterisering via Stunner. (A) Absorbansspektrum (sort) for en rAAV2/9-vektor målt ved Stunner. Bidraget fra proteiner (blå), ssDNA (grøn), andre UV-absorberende forbindelser eller urenheder (lilla) og baggrundsturbiditet (grå) er også afbildet. B) DLS-intensitetsfordeling af rAAV2/9 med en tung top ved 30 nm svarende til en capsidspredningsintensitet på 78 %, bestemt ved måling af arealet under kurven fra 15 til 45 nm (grønskraveret). En samlet aggregatintensitet på 22% (gråskraveret) blev også målt med et hovedbidrag fra store aggregater (19,9%) med en gennemsnitlig diameter på 620 nm. (C) Stunner analyse af et rAAV2/9 vektorpræparat, der udviser en total capsidtiter på 2,18 × 1014 cp/ml (mørkeblå) og en fuld capsidtiter på 2,35 × 1013 vg/ml (mørkegrøn). Et frit og aggregeret protein på 2,92 × 1013 cp/ml ækvivalenter (lyseblå) samt et frit og aggregeret ssDNA på 3,14 × 1012 vg/ml ækvivalenter (lysegrøn) blev også målt i dette præparat. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; ssDNA = enkeltstrenget DNA; DLS = dynamisk lysspredning. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S6: In vitro-transduktionseffektivitet og levedygtighed af de rensede fraktioner af rAAV1/2. HEK293T celler, der udtrykker GFP (direkte fluorescens) 48 timer efter transduktion med 50 μL FPLC-fraktioner af en rAAV1/2-vektorkodning ssGFP (rAAV1/2 - CMV-ssGFP). Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; FPLC = hurtig proteinvæskekromatografi; ssGFP = enkeltstrenget grønt fluorescerende protein. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S7: In vitro transduktionseffektivitet og levedygtighed af de oprensede fraktioner af rAAV2/9. HEK293T celler blev inficeret med 50 μL af hver FPLC-fraktion (F2-F16) eller gennemstrømning af en rAAV2/9-vektorkodning scGFP under kontrol af CMV-promotoren. De GFP-ekspressive celler blev visualiseret 48 timer efter infektion. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: rAAV = rekombinant adeno-associeret virus; FPLC = hurtig proteinvæskekromatografi; scGFP = selvkomplementært grønt fluorescerende protein; CMV = cytomegalovirus. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Det hurtigt voksende AAV-vektorværktøjssæt er blevet et af de mest lovende genleveringssystemer til en lang række celletyper gennem forskellige administrationsveje. I dette arbejde havde vi til formål at udvikle en forbedret protokol til produktion, oprensning og karakterisering af mosaik rAAV-vektorer, der kunne bevise deres værd i prækliniske undersøgelser. Til dette formål beskrives genereringen af rAAV1/2 og rAAV2/9 mosaikvektorer her, men proceduren kan også anvendes til at rense standard rAAV2-vektorer (data ikke vist).

Mosaic rAAV'er blev produceret efter en optimeret transfektionsmetode ved anvendelse af PEI som transfektionsreagens. En forbigående transfektionsmetode blev valgt på grund af dens større fleksibilitet og hastighed, betydelige fordele i tidlige prækliniske undersøgelser. Når et bestemt transgen og en bestemt serotype er blevet valideret, kan produktionssystemet finjusteres for at opnå bedre skalerbarhed og omkostningseffektivitet ved at etablere en stabil transfekteret cellelinje, der udtrykker en delmængde af de specifikke Rep/Cap-gener , med yderligere gener tilvejebragt af en infektionsproces24. Sammenlignet med calciumphosphattransfektion giver PEI flere fordele. Det er et stabilt og omkostningseffektivt transfektionsreagens, der fungerer effektivt inden for et bredere pH-område. Derudover eliminerer det kravet om at ændre cellemediet efter transfektion, hvilket resulterer i en betydelig reduktion i både omkostninger og arbejdsbyrde69.

I et forsøg på at omgå nogle af de begrænsninger, der blev pålagt af CsCl- eller iodixanolgradienter, blev de producerede rAAV'er høstet og renset ved affinitetskromatografi. Denne strategi tilbyder en forenklet og skalerbar tilgang, der kan udføres uden behov for ultracentrifugering og gradienter, hvilket giver rene og høje virale titere. Faktisk kan kromatografiteknikker ved hjælp af et FPLC-system automatiseres og skaleres op ved at pakke mere harpiksvolumen i en søjle med en højere sengehøjde. Protokollen beskrevet heri kan let tilpasses til at inkorporere 5 ml HiTrap Heparin HP-søjler (data ikke vist). Derudover kan heparinkolonner genbruges flere gange, hvilket bidrager til omkostningseffektiviteten af denne metode.

De oprensede rAAV'er blev derefter karakteriseret med hensyn til titer, renhed, morfologiske træk og biologisk aktivitet. Interessant nok blev der i Coomassie-blå farvning påvist et bånd med ca. 17 kDa i fraktioner F8-F16 ud over de tre typiske virale capsidproteiner. Dette bånd er imidlertid ikke længere til stede efter koncentrationstrinnet af rAAV'er. Desuden kan nogle svage bånd med molekylvægte lavere end VP3 (<62 kDa) også detekteres ved B1- og A69-mærkning, hvilket tyder på, at disse kan være fragmenter af VP1-, VP2- og VP3-capsidproteinerne70. En anden mulighed er, at disse faktisk er andre co-rensende proteiner såsom ferritin eller andre cellulære proteiner med polypeptider, der deler lignende proteinfingeraftryk med AAV-capsidproteinerne og kunne være involveret i AAV-biologien, som tidligere foreslået 26,71,72.

TEM og bedøvelsesanalyse afslørede også tilstedeværelsen af tomme partikler på variable niveauer på tværs af forskellige produktioner. Tilsvarende rapporterede andre undersøgelser tidligere generering af variable og høje niveauer (>65%) af tomme kapsider til rAAV'er fremstillet ved transfektions- eller infektionsmetoder24,73. Mekanismen bag rAAV-generering starter med den hurtige dannelse af tomme kapsider fra nyligt syntetiserede VP-proteiner efterfulgt af et langsomt hastighedsbegrænsende trin af genompakning i de præformerede kapsider medieret af Rep-proteiner74,75. Derfor genereres tomme kapsider i rAAV-produktioner, selvom andelen af tomme og fulde kapsider kan variere afhængigt af størrelsen og sekvensen af transgenet af interesse og cellekulturbetingelser58,73. Tomme kapsider giver anledning til nogle bekymringer, da de ved at mangle genomet af interesse ikke er i stand til at give en terapeutisk effekt og også potentielt kan øge et medfødt eller adaptivt immunrespons. Nogle rapporter har imidlertid også vist, at tomme AAV-kapsider ved at justere deres forhold kan tjene som yderst effektive lokkefugle til AAV-specifikke neutraliserende antistoffer og derfor øge transduktionseffektiviteten 60,76,77. Hvis tilstedeværelsen af tomme kapsider er kritisk skadelig og i betragtning af den lidt mindre anioniske karakter af tomme partikler sammenlignet med fulde vektorer, kan en potentiel løsning omfatte udførelse af et andet poleringsrensningstrin ved hjælp af anionudvekslingskromatografiteknikker64.

Denne undersøgelse giver også overbevisende bevis for, at de genererede mosaik rAAV'er er i stand til effektivt at transducere ikke kun in vitro neuronale kulturer, men også CNS ved intrakraniel injektion af rAAV1/2. Samlet set tyder disse resultater på, at den beskrevne produktions- og oprensningsprotokol gør meget rene og biologisk aktive rAAV'er klar til brug på 6 dage og præsenterer sig selv som en alsidig og omkostningseffektiv metode til generering af rAAV'er i prækliniske studier.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for samarbejdet, indsigten og den tekniske assistance fra Dr. Mónica Zuzarte ved Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) og Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB) vedrørende TEM-analysen af rAAV'er. Vi udvider vores påskønnelse til Dr. Dominique Fernandes ved Center for Neurovidenskab og Cellebiologi ved University of Coimbra (CNC-UC) og Institut for tværfaglig forskning ved University of Coimbra (IIIUC) for hendes uvurderlige tekniske assistance og indsigt i de primære neuronale kultureksperimenter. PRV1-, pH21- og pFdelta6-plasmider, der er afgørende for denne undersøgelse, blev generøst leveret af Dr. Christina McClure ved School of Medical Sciences, College of Life Sciences and Medicine, University of Aberdeen, som vi er taknemmelige for. Dette arbejde blev finansieret af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU) gennem det regionale operationelle program Centro 2020. gennem det operationelle program for konkurrenceevne og internationalisering COMPETE 2020 og portugisiske nationale midler via FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia under projekterne: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), ReSet - IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), Bekæmpelse af Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); af American Portuguese Biomedical Research Fund (APBRF) og Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund, ARDAT under IMI2 JU-tilskudsaftale nr. 945473 støttet af EU og EFPIA GeneT-Teaming Project 101059981 støttet af EU's Horizon Europe-program. M.M.L. blev støttet af 2021.05776.BD; C.H. blev støttet af 2021.06939.BD; A.C.S. blev støttet af 2020.07721.BD; og D.D.L. blev støttet af 2020.09668.BD. Figur 1 blev oprettet ved hjælp af BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% povidone-iodine Medline MDS093943
12-well plates Thermo Scientific 11889684
24-well plates VWR 734-2325
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D1306
96-well Stunner plate Unchained Labs 701-2025 96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2 Takara 6233 For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water
Acetic acid glacial Fisher Chemical A/0360/PB17
ÄKTA pure 25 Cytiva 29018224 FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3 
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse Invitrogen 31328
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit Merck Millipore UFC5100
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit Merck Millipore UFC9100
Benzonase Nuclease Merck Millipore E1014
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
CFX96 Real-Time PCR detection system Biorad 184-5096
ChemiDoc Touch Imaging System Bio-Rad Laboratories 1708370
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody Abcam ab13970
Coomassie Blue G250 Fisher Chemical C/P541/46
Dithiothreitol (DTT) Fisher Bioreagents BP17225
DMEM Sigma-Aldrich D5796
ECF Substrate for Western Blotting Cytiva RPN5785
FastDigest SmaI Thermo Scientific FD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin FEI Biotwin Transmission electron microscope
Fetal bovine serum Biowest S1810
Fluorescence mounting medium Dako S3023
Formvar-carbon coated 200 mesh grid  TAAB Laboratories Equipment F077/025
Gas evacuation apparatus RWD R546W
Glycerol Fisher BioReagents 10021083
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11039
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3 Hamilton 7803-07
Hamilton syringe (10 µL) Hamilton 7653-01
HEK293T American Type Culture Collection CRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL Cytiva 17040701 Pre-packed heparin column
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL Cytiva 17040601 Pre-packed heparin column
Immobilon-P PVDF Membrane Merck Millipore IPVH00010
Isoflurane Braun 469860
Ketamine  Dechra Pharmaceuticals N/A Nimatek
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL) Fisher Scientific 11906965
Lunatic & Stunner Client software Unchained Labs N/A Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Methanol Fisher Chemical M/4000/FP21
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69) American Research Products 03-61057
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1) American Research Products 03-61058
Neuro2a American Type Culture Collection CCL-131
Normal goat serum Gibco 16210064
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel 12738422
NZYColour Protein Marker II NZYtech MB09002
pAAV-CMV-scGFP Addgene 32396 Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFP Addgene 105530 Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530
pAAV2/9n Addgene 112865 Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865
Paraformaldehyde Acros Organics 10342243
PBS Fisher BioReagents BP2438
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x) Gibco 24040032
Polyethylenimine MAX, MW 40,000 Polysciences Europe 24765
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine - Isoflurane RWD N/A
Sample Inlet Valve V9-IS Cytiva 29027746
Sample pump P9-S Cytiva 29027745
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride Fisher Scientific 10428420
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Bioreagents BP166
Sterile PVDF syringe filter Fisher Scientific 15191499
Stunner Platform Unchained Labs 700-2002 Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Superloop 150 mL Cytiva 18-1023-85
Superloop 50 mL Cytiva 18-1113-82
SURE 2 supercompetent cells Stratagene, Agilent Technologies HPA200152
Treated culture dishes Corning 734-1711
Tris base Fisher BioReagents BP152
Tris hydrochloride Fisher BioReagents BP153
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633 Invitrogen W21404
Xylazine Dechra Pharmaceuticals N/A Sedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1 Carl Zeiss Microscopy GmbH N/A Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective
Zeiss Axio Scan.Z1 Carl Zeiss Microscopy GmbH N/A Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective
Zeiss LSM 710 Carl Zeiss Microscopy GmbH N/A Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective
µ-Slide 8 well Ibidi Ibidi 80826 8-well chamber slide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  2. Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Front Mol Neurosci. 7, 1-9 (2014).
  3. Muzyczka, N. Use of Adeno-Associated Virus as a General Transduction Vector for Mammalian Cells. Viral Expression Vectors. 158, 97-129 (1992).
  4. Goncalves, M. A. F. V Adeno-associated virus: from defective virus to effective vector. Virol J. 2, 43 (2005).
  5. Flotte, T. R. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther. 11 (10), 805-810 (2004).
  6. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  7. Ojala, D. S., Amara, D. P., Schaffer, D. V Adeno-Associated Virus Vectors and Neurological Gene Therapy. Neuroscientist. 21 (1), 84-98 (2014).
  8. Saraiva, J., Nobre, R. J., Pereira de Almeida, L. Gene therapy for the CNS using AAVs: The impact of systemic delivery by AAV9. Journal of Controlled Release. 241, 94-109 (2016).
  9. Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods Mol Biol. 807, 47-92 (2011).
  10. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  11. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  12. Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J Virol. 78 (12), 6381-6388 (2004).
  13. Gao, G., Vandenberghe, L. H., Wilson, J. M. New recombinant serotypes of AAV vectors. Curr Gene Ther. 5 (3), 285-297 (2005).
  14. Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The role of the adeno-associated virus capsid in gene transfer. Methods Mol Biol. 437, 51-91 (2008).
  15. Clark, K. R., Voulgaropoulou, F., Fraley, D. M., Johnson, P. R. Cell lines for the production of recombinant adeno-associated virus. Hum Gene Ther. 6 (10), 1329-1341 (1995).
  16. Inoue, N., Russell, D. W. Packaging cells based on inducible gene amplification for the production of adeno-associated virus vectors. J Virol. 72 (9), 7024-7031 (1998).
  17. Liu, X., Voulgaropoulou, F., Chen, R., Johnson, P. R., Clark, K. R. Selective Rep-Cap gene amplification as a mechanism for high-titer recombinant AAV production from stable cell lines. Mol Ther. 2 (4), 394-403 (2000).
  18. Mathews, L. C., Gray, J. T., Gallagher, M. R., Snyder, R. O. [23] Recombinant adeno-associated viral vector production using stable packaging and producer cell lines. Methods Enzymol. 346, 393-413 (2002).
  19. Gao, G., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus vectors by column chromatography and its performance in vivo. Hum Gene Ther. 11 (15), 2079-2091 (2000).
  20. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  21. Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (3), 1045-1054 (2018).
  22. Smith, R. H., Levy, J. R., Kotin, R. M. A simplified baculovirus-AAV expression vector system coupled with one-step affinity purification yields high-titer rAAV stocks from insect cells. Mol Ther. 17 (11), 1888-1896 (2009).
  23. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  24. Wright, J. F. Transient transfection methods for clinical adeno-associated viral vector production. Hum Gene Ther. 20 (7), 698-706 (2009).
  25. Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Hum Gene Ther. 22 (5), 613-624 (2011).
  26. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum Gene Ther Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  27. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  28. Anderson, R., Macdonald, I., Corbett, T., Whiteway, A., Prentice, H. G. A method for the preparation of highly purified adeno-associated virus using affinity column chromatography, protease digestion and solvent extraction. J Virol Methods. 85 (1-2), 23-34 (2000).
  29. Okada, T., et al. Scalable purification of adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) and AAV8 vectors, using dual ion-exchange adsorptive membranes. Hum Gene Ther. 20 (9), 1013-1021 (2009).
  30. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  31. Lock, M., et al. Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum Gene Ther. 21 (10), 1259-1271 (2010).
  32. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufai, M., Francois, A. Production and Purification of Recombinant Adeno-Associated Vectors. Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols. 807, 361-404 (2011).
  33. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  34. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated Virus Serotypes: Vector Toolkit for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  35. Mietzsch, M., Broecker, F., Reinhardt, A., Seeberger, P. H., Heilbronn, R. Differential adeno-associated virus serotype-specific interaction patterns with synthetic heparins and other glycans. J Virol. 88 (5), 2991-3003 (2014).
  36. McClure, C., Cole, K. L. H., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. JoVE. (57), e3348 (2011).
  37. Auricchio, A., O’Connor, E., Hildinger, M., Wilson, J. M. A single-step affinity column for purification of serotype-5 based adeno-associated viral vectors. Mol Ther. 4 (4), 372-374 (2001).
  38. Wang, Q., et al. Identification of an adeno-associated virus binding epitope for AVB sepharose affinity resin. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15040 (2015).
  39. Mietzsch, M., et al. OneBac: platform for scalable and high-titer production of adeno-associated virus serotype 1–12 vectors for gene therapy. Hum Gene Ther. 25 (3), 212-222 (2014).
  40. Mietzsch, M., et al. Characterization of AAV-specific affinity ligands: consequences for vector purification and development strategies. Mol Ther Methods Clin Dev. 19, 362-373 (2020).
  41. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2023).
  42. Koerber, J. T., Jang, J. -H., Yu, J. H., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Engineering adeno-associated virus for one-Step purification via immobilized metal affinity chromatography. Hum Gene Ther. 18 (4), 367-378 (2007).
  43. Zhang, H. -G., et al. Addition of six-His-tagged peptide to the C terminus of adeno-associated virus VP3 does not affect viral tropism or production. J Virol. 76 (23), 12023-12031 (2002).
  44. Arnold, G. S., Sasser, A. K., Stachler, M. D., Bartlett, J. S. Metabolic biotinylation provides a unique platform for the purification and targeting of multiple AAV vector serotypes. Mol Ther. 14 (1), 97-106 (2006).
  45. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. J Virol. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  46. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Mol Ther. 7 (3), 419-425 (2003).
  47. Choi, V., McCarty, D., Samulski, R. AAV hybrid serotypes: improved vectors for gene delivery. Curr Gene Ther. 5 (3), 299-310 (2005).
  48. Nonnenmacher, M., van Bakel, H., Hajjar, R. J., Weber, T. High capsid–genome correlation facilitates creation of AAV libraries for directed evolution. Mol Ther. 23 (4), 675-682 (2015).
  49. Kimura, K., et al. A mosaic adeno-associated virus vector as a versatile tool that exhibits high levels of transgene expression and neuron specificity in primate brain. Nat Commun. 14 (1), 4762 (2023).
  50. Issa, S. S., Shaimardanova, A. A., Solovyeva, V. V., Rizvanov, A. A. Various AAV serotypes and their applications in gene therapy: an overview. Cells. 12 (5), 785 (2023).
  51. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  52. Lopes, M. M., et al. A new protocol for whole-brain biodistribution analysis of AAVs by tissue clearing, light-sheet microscopy and semi-automated spatial quantification. Gene Ther. 29 (12), 665-679 (2022).
  53. Gray, J. T., Zolotukhin, S. Design and construction of functional AAV vectors. Methods Mol Biol. 807, 25-46 (2011).
  54. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. , Chapter 12, Unit 12.9-12.9.21 (2007).
  55. Bennicelli, J., et al. Reversal of blindness in animal models of leber congenital amaurosis using optimized AAV2-mediated gene transfer. Mol Ther. 16 (3), 458-465 (2008).
  56. Fischer, M. D., Hickey, D. G., Singh, M. S., MacLaren, R. E. Evaluation of an optimized injection system for retinal gene therapy in human patients. Hum Gene Ther Methods. 27 (4), 150-158 (2016).
  57. Santos, S. D., et al. Contactin-associated protein 1 (Caspr1) regulates the traffic and synaptic content of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA)-type glutamate receptors. J Biol Chem. 287 (9), 6868-6877 (2012).
  58. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  59. Dong, B., Nakai, H., Xiao, W. Characterization of genome integrity for oversized recombinant AAV vector. Mol Ther. 18 (1), 87-92 (2010).
  60. Wright, J. F. AAV empty capsids: For better or for worse. Mol Ther. 22 (1), 1-2 (2014).
  61. Asaad, W., et al. AAV genome modification for efficient AAV production. Heliyon. 9 (4), e15071 (2023).
  62. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  63. Wistuba, A., Kern, A., Weger, S., Grimm, D., Kleinschmidt, J. A. Subcellular compartmentalization of adeno-associated virus type 2 assembly. J Virol. 71 (2), 1341-1352 (1997).
  64. Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. J Virol Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
  65. Brument, N., et al. A versatile and scalable two-step ion-exchange chromatography process for the purification of recombinant adeno-associated virus serotypes-2 and -5. Mol Ther. 6 (5), 678-686 (2002).
  66. Potter, M., et al. A simplified purification protocol for recombinant adeno-associated virus vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14034 (2014).
  67. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Front Microbiol. 10, 1570 (2019).
  68. Yang, Q. -E., et al. Rapid quality control assessment of adeno-associated virus vectors via Stunner. GEN Biotechnology. 1 (3), 300-310 (2022).
  69. Huang, X., et al. AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications. J Virol Methods. 193 (2), 270-277 (2013).
  70. Salganik, M., et al. Evidence for pH-dependent protease activity in the adeno-associated virus capsid. J Virol. 86 (21), 11877-11885 (2012).
  71. Dong, B., et al. Proteomics analysis of co-purifying cellular proteins associated with rAAV vectors. PLoS One. 9 (2), e86453 (2014).
  72. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  73. Wright, J. Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: characterization and risk assessment. Biomedicines. 2 (1), 80-97 (2014).
  74. Bennett, A., Mietzsch, M., Agbandje-McKenna, M. Understanding capsid assembly and genome packaging for adeno-associated viruses. Future Virol. 12 (6), 283-297 (2017).
  75. Myers, M. W., Carter, B. J. Assembly of adeno-associated virus. Virology. 102 (1), 71-82 (1980).
  76. Mingozzi, F., et al. Overcoming preexisting humoral immunity to AAV using capsid decoys. Sci Transl Med. 5 (194), (2013).
  77. Hoffman, B. E., Herzog, R. W. Covert warfare against the immune system: decoy capsids, stealth genomes, and suppressors. Mol Ther. 21 (9), 1648-1650 (2013).

Tags

Bioengineering nr. 206
Isolering af adeno-associerede virale vektorer gennem en enkelttrins og halvautomatisk heparinaffinitetskromatografiprotokol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lopes, M. M., Lopes, S. M., Baganha, … More

Lopes, M. M., Lopes, S. M., Baganha, R., Henriques, C., Silva, A. C., Lobo, D. D., Cortes, L., de Almeida, L. P., Nobre, R. J. Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol. J. Vis. Exp. (206), e66550, doi:10.3791/66550 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter