Summary
Bu makale, yarı katı bir bazal membran matrisi içinde dalak hücrelerini toplamak ve kapsüllemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bazal membran matris yapıları, organoid gelişimini incelemek için veya in vivo transplantasyon ve doku rejenerasyon çalışmaları için üç boyutlu kültürde kullanılabilir.
Abstract
Dalak, kan yoluyla bulaşan bağışıklık tepkilerinde önemli bir rol oynayan bir bağışıklık organıdır. Bu dokunun anatomik veya fonksiyonel kaybı, ciddi kan enfeksiyonlarına ve sepsise yatkınlığı artırır. Dalak dilimlerinin ototransplantasyonu, kaybedilen dokuyu değiştirmek ve bağışıklık fonksiyonunu eski haline getirmek için klinik olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, sağlam ve immünolojik olarak fonksiyonel dalak dokusu rejenerasyonunu yönlendiren mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır. Burada, dalak dokusu oluşumu için hücresel gereksinimleri araştırmak amacıyla dalak hücrelerini yarı katı bir matriks içinde toplamak ve kapsüllemek için bir yöntem geliştirmeyi amaçlıyoruz. Bazal membran matris kapsüllenmiş hücre yapıları, hem üç boyutlu organoidlerin in vitro doku kültürüne hem de doğrudan in vivo doku oluşumunu değerlendirmek için böbrek kapsülü altına transplantasyona uygundur. Agregasyon ve kapsülleme için giriş hücrelerini manipüle ederek, hayvan nakli modelleri altında dalak dokusu rejenerasyonu için greft kaynaklı PDGFRβ+MAdCAM-1- neonatal stromal hücrelerin gerekli olduğunu gösterdik.
Introduction
Dalağın travmatik rüptürü ve vücutta çok sayıda dalak nodülünün ortaya çıkması, dalak dokusunun rejeneratif kapasite barındırdığının ilk göstergelerinden biriydi 1,2. Dalak ototransplantasyonları daha sonra acil splenektomi gerektiren hastalarda dalak dokusunu korumak için kliniğe tanıtıldı3. Yine de, onlarca yıldır klinik uygulamanın bir parçası olmasına rağmen, dalağın nasıl yenilendiği hakkında çok az şey bilinmektedir. Hayvan nakli modelleri, dalak rejenerasyonu ve bağışıklık fonksiyonunun çoklu parametreleri hakkında fikir vermiştir 4,5. Özellikle, greft hazırlama yönteminde yapılan deneysel modifikasyonlar, doku rejenerasyonunun hücresel ve moleküler düzeyde daha ayrıntılı olarak incelenmesine izin vermiştir.
Tüm dalak dilimlerini içeren transplantasyonlar, yeni bir dalak yapısı yeniden inşa edilmeden önce bir kitle nekrozu evresine girer6. Greft nekrozunun ilk aşaması, nakledilen dokunun büyük kısmının büyük ölçüde kırmızı ve beyaz kan hücrelerinden oluştuğunu ve dalak rejenerasyonu için gereksiz olduğunu düşündürmektedir. Bu, fare böbrek kapsülü altına nakledilmeden önce hematopoietik hücrelerin dalak greftlerinden çıkarılmasıyla deneysel olarak araştırıldı. Burada, stromal ve endotel hücrelerini içeren dalağın lökosit olmayan/eritrosit olmayan fraksiyonunun, de novo doku oluşumunu indüklemek için yeterli olduğu gösterilmiştir7. Dalak stromal dokusu, hücresel greft bileşimini manipüle etmek için hücre sıralama teknolojilerinin kullanılmasını sağlayan tek hücreli bir süspansiyona daha fazla işlenebilir. Aday hücre tiplerini seçici olarak çıkararak, greft gelişimi için vazgeçilmez olan iki CD45-TER-119-stromal hücre popülasyonu tanımlandı: endotel benzeri bir CD31 + CD105 + MAdCAM-1 + hücre popülasyonu ve daha geniş bir şekilde tanımlanmış bir PDGFRβ + mezenkimal hücre popülasyonu8.
Dalak hücrelerinden greft yapımı, destek materyalleri ve hücre yükleme işlemleri açısından farklılık gösterir. Doku mühendisliği ile tasarlanmış dalaklar daha önce bir poliglikolik asit/poli-L laktik asit polimer iskelesi 5,9 üzerine dalak üniteleri yüklenerek hazırlanmıştı. İlginç bir şekilde, bir kollajen süngeri içine emilen dalak stromal hücreleri aşılamayı başaramazken, bir kollajen tabakası üzerine toplanan ve yüklenen stromal hücreler dalak rejenerasyonunu kolaylaştırdı8. Bir Matrigel matrisi içindeki dalak stromal hücrelerinin yeniden süspansiyonunun, üç boyutlu kültür koşulları altında hücre agregasyonunu indüklediğide gösterilmiştir 10. Bununla birlikte, bu yöntem transplantasyon modellerinde kullanım için test edilmemiştir. Mevcut protokolün genel amacı, dalak stromal hücrelerini doğrudan bazal membran matrisi içinde zorla toplamak ve kapsüllemektir, bu daha sonra üç boyutlu bir in vitro doku kültürü sistemine aktarılabilir veya hayvan modeli transplantasyonları için bir araç olarak kullanılabilir (Ek Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Queensland Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi (UQBR/079/19) tarafından onaylanan deneysel protokollere göre yürütülmüştür.
1. Doku toplama ve stromal hücre hazırlama
- 0.5-1.5 günlük erkek ve/veya dişi BALB/c yenidoğan donör fareleri, hayvanları kağıt mendilin içine sararak ve >10 dakika boyunca kırılmış buzun altına yerleştirerek hipotermi indüksiyonu ile ötenazi yapın.
NOT: Bu protokol farklı fare türlerine, yaşlarına ve hayvan sayısına uyarlanabilir. - Steril cerrahi aletler hazırlayın.
- Fareyi sağ yanal konuma getirin. Cildi %80 etanol ile sürüntü ve periton duvarını ortaya çıkarmak için Iris cerrahi makasıyla 1 cm'lik bir kesi yapın.
- Dalağın üzerinde 0,5 cm'lik ikinci bir kesi yapın ve dokuyu nazikçe yukarı kaldırmak için bir çift ince forseps kullanın. Kan damarlarını kesmek ve dokuyu çıkarmak için bir çift cerrahi makas kullanın. Dokuyu buz gibi soğuk Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içeren bir Petri kabına aktarın. Dalağa bağlı kalan bağ dokusunu çıkarın.
NOT: Bir stereomikroskop, cerrahi aletleri manipüle etmek için gereken ince motor hareketlerine yardımcı olabilir. - Tüm dokuları ayırmak için, yenidoğan dalaklarını (10 veya daha az havuzlar) ters çevrilmiş 14 mL konik tüp kapağının iç kenarına aktarın. 1 mL'lik bir şırınga pistonunun plastik arka ucunu kullanarak bir baskı hareketiyle dokuları mekanik olarak bozun.
- Kapağı 10 mL soğuk PBS içeren 14 mL'lik konik bir tüpün üzerine sıkıca yerleştirin ve sabitleyin. Kapaktan tüpe bozulan tüm dokuları yıkamak için tüpü 5x ters çevirin.
- Kalan doku için adım 1.6'yı tekrarlayın.
- Dokunun tüpün dibine çökmesini sağlamak için tüpü 1 dakika buz üzerinde bırakın.
- Çözeltiyi geri dönüşümlü 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek süpernatanı (hematopoietik hücreler içeren) dikkatlice atın.
- 1 mg / mL Kollajenaz IV, 40 μg / mL DNaz I ve% 2 Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren taze hazırlanmış 2 mL takviyeli Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (sDMEM) kullanarak süzgeci ters çevirerek ve stromal dokuyu 14 mL konik tüpe geri yıkayarak çözünmeyen stromal fraksiyonu geri kazanın.
DİKKAT: Kollajenaz IV ve Kollajenaz D tehlikeli maddelerdir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla bir biyogüvenlik kabini içinde taşınmalıdır. - Tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için, havuzlanmış dokuyu (20'ye kadar) sabit rotasyonla 37 ° C'de 10 dakika boyunca enzimatik olarak sindirin.
- 1 mg/mL Kollajenaz D, 40 μg/mL DNaz I ve %2 FBS içeren 4 mL taze hazırlanmış sDMEM'i doğrudan stromal doku içeren tüpe ekleyin. Sabit dönüşle 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin.
- 8 mL buz gibi PBS ekleyerek sindirimi durdurun. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyerek hücreleri toplayın.
- Süpernatanı atın ve 1 mL soğuk PBS'de yeniden süspanse ederek ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyerek hücreleri iki kez yıkayın. Hücreleri buz üzerinde tutun.
NOT: Hücreler sayılabilir ve istenen konsantrasyona ayarlanabilir. Bu, farklı hücre popülasyonları için optimizasyon gerektirebilir. Bu protokolü kullanarak, donör farelerin yaşına bağlı olarak tipik olarak 0.5 x 106-1 x 106 stromal hücreler / dalak geri kazanılır. Hücreler isteğe bağlı olarak boyanabilir ve hücre kompozisyonunu tanımlamak için bu aşamada FACS sıralanabilir.
2. Hücre agregalarının matris kapsüllenmesi
- Steril P200 pipet uçlarını -20 °C'lik bir dondurucuda önceden soğutun.
- Esnek laboratuvar filmini (örneğin Parafilm) 1 cm x 2 cm'lik parçalar halinde kesin ve 10 dakika boyunca %80 etanole, ardından 10 dakika PBS'ye batırarak sterilize edin. Laboratuvar filmi önceden hazırlanabilir ve steril olarak saklanabilir.
- 0.5 x 10 6-2.5 x 106 hücrelerini 200 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyerek hazırlayın. Kalan PBS hacminin yaklaşık 20 μL'sini bırakarak süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini buz üzerinde tutun.
NOT: Kalan PBS, hacmi doğrulamak için hücre peletini bozmadan nazikçe aspire edilebilir. - Bir P20 pipetleyici kullanarak 2 μL buz gibi soğuk bazal membran matrisini önceden soğutulmuş bir P200 pipet ucuna aspire edin.
NOT: Yüksek konsantrasyonlu bir bazal membran matrisi (örneğin, Corning Matrigel Matrisi Yüksek Konsantrasyon), güçlü bir katılaşmış tıkaç oluşturmaya yardımcı olur. - Pipet ucunu çıkarmak için hafifçe çevirin. Laboratuvar filminin önceden sterilize edilmiş bir şeridini gerin ve filmi delmemeye dikkat ederek pipet ucunun ucuna yerleştirin. Pipet ucunu kapatmak için ucu filme sarmaya devam edin. Filmi yırtmamaya dikkat ederek kapalı ucu dikkatlice doğrudan buzun üzerine yerleştirin.
- Kalan PBS'de hücre peletini yeniden süspanse edin ve çözeltiyi bazal membran matrisinin üzerine nazikçe katmanlayın. Yapıyı buz üzerinde tutun.
- 1.2 mL'lik bir konik tüpün içine 14 mL'lik bir küme tüpü yerleştirerek bir santrifüj tüpü hazırlayın.
- Pipet ucunu iç içe geçmiş tüp konfigürasyonunun içine yerleştirin ve 400 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- 14 mL konik tüpü dikey yönde konumlandırın ve bazal membran matrisinin pipet ucunun içinde katılaşmasını sağlamak için 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
NOT: 14 mL konik boru, aşağı akış uygulaması için gerekli olana kadar buz üzerine yerleştirilebilir.
3. Üç boyutlu organoid kültür
- Laboratuvar filmini pipet ucundan dikkatlice çıkarın.
- Pipet ucunun daha büyük açıklığından ince bir paslanmaz çelik tel piston sokun.
- Matris tapasını uçtan serbest bırakılana kadar, %10 FBS, 1x Glutamax, 1x Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA), 10 μM Kaya İnhibitörü, 10 U/mL Penisilin / Streptomisin ve 50 μM β-merkaptoetanol ile desteklenmiş 2 mL sDMEM içeren işlem görmemiş 6 oyuklu bir doku kültürü plakasının bir oyuğuna boşaltın.
NOT: Doku kültürü kabı ve ilgili ortam hacmi gerektiği gibi ayarlanabilir.
DİKKAT: NEAA, Penisilin/Streptomisin ve β-merkaptoetanol tehlikeli maddelerdir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla bir biyogüvenlik kabini içinde taşınmalıdır. - 4-12 hafta boyunca 37 °C, %5CO2 ve %95 nemde kültür organoidleri.
- Ortamın yarısını her 5 günde bir değiştirin.
NOT: Organoidler doku kültürü plakasına bağlanmaya başlarsa, taze bir kuyucuğa aktarın.
4. Böbrek kapsülü nakli
- Steril cerrahi aletler hazırlayın.
- Bazal membran matris tıkacının subkapsüler böbrek naklini gerçekleştirin:
- Kurumsal Hayvan Etiği Yönergelerine uygun olarak 8 haftalık BALB/c dişi alıcı fareyi izofluran ile uyuşturun.
DİKKAT: İzofluran tehlikeli bir maddedir. Çalışma ortamı içerisine girilmesi engellenen atık gazların temizlenmesi gerekmektedir. - Fareyi sağ yanal konuma getirin.
- Ameliyat bölgesindeki saçları tıraş edin ve Kurumsal Yönergelere uyarak cildi dezenfekte edin.
NOT: Cerrahi bölgenin alternatif iyot bazlı veya klorheksidin bazlı ve alkol bazlı fırçalama ile dairesel hareketlerle üç kez dezenfekte edilmesi önerilir. - Periton duvarını ortaya çıkarmak için omurgaya dik deride 2 cm'lik bir kesi yapın.
NOT: Cilt kesisi için ince cerrahi makas veya neşter bıçağı kullanılabilir. Kullanıcılar, Kurumsal Hayvan Etiği Yönergelerine veya Standart Çalışma Prosedürlerine uymalıdır. - Böbreğin üzerindeki periton duvarında 0,5 cm'lik daha küçük bir kesi yapın.
NOT: Nakil sırasında böbreğin dışarıda kalmasını sağlamak için kesi böbrek genişliğine yaklaşmalıdır. - Başparmak ve işaret parmağını kullanarak aşağı doğru basınç uygulayarak böbreği periton açıklığından dışarı çıkarın. Dışsallaştırmaya yardımcı olmak için bir çift halka cımbız kullanılabilir. Pamuklu çubuk kullanarak düzenli olarak steril PBS uygulayarak böbreğin işlem boyunca nemli olduğundan emin olun.
- Bir stereomikroskop altında, böbrek kapsülünün perirenal yağını böbreğin bir kutbunda bir çift bükülmüş ultra ince forseps ile sıkıştırın. Böbrek kapsülü zarını ters yönde yukarı doğru nazikçe yırtmak ve küçük bir açıklık oluşturmak için ikinci bir çift bükülmüş ultra ince forseps kullanın.
- Bir forsepsin ucunu kapsül zarının altına dikkatlice yerleştirin. Kapsül zarını böbrek parankiminden ayırmak için yavaş bir süpürme hareketi kullanın.
- Laboratuvar filmini pipet ucundan çıkararak bazal membran matris tapasını nakil için hazırlayın.
- Forsepsin bir ucunu kullanarak böbrek kapsülünü kaldırın ve pipet ucunu böbreğin karşı kutbuna doğru iterek açıklıktan geçirin.
- Pipet ucuna bir tel piston yerleştirin ve aynı anda pipet ucunu böbrekten çekerken matris tapasını çıkarın.
- Böbreği PBS ile nemlendirin ve yeniden içselleştirin.
- Periton duvarını bir adet 5-0 Vicryl sütür ile kapatın ve cildi iki otoklips ile kapatın.
- Analjezik uygulayın (0.05-0.1 mg / kg'da Buprenorfin, deri altından veya Kurumsal Hayvan Etik Kurallarına uyarak).
DİKKAT: Buprenorfin tehlikeli bir maddedir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla kullanılmalıdır.
- Kurumsal Hayvan Etiği Yönergelerine uygun olarak 8 haftalık BALB/c dişi alıcı fareyi izofluran ile uyuşturun.
- İzofluran akışını kapatın, ancak farenin bilinç kazanmaya başlayana kadar saf oksijen solumasına izin vermek için oksijen akışını açık tutun.
- Fareyi kafesine geri koyun. Kafesi kısmen bir ısıtma yastığının üstüne veya bir ısı lambasının altına yerleştirerek iyileşme sırasında hayvanı sıcak tutun ve fare anesteziden tamamen kurtulana kadar izleyin.
- Ameliyat sonrası iyileşmeyi ilk iki hafta boyunca veya Kurumsal Yönergelerin gerektirdiği şekilde izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre agregasyonu, hücreden hücreye teması ve sinyalleşmeyi teşvik etmek için önemlidir. Bazal membran matrisi içindeki hücre agregatlarının kaplanması, in vitro doku organoid oluşumu için hem 3 boyutlu kültürleri destekledi hem de greft nakli için hücrelerin böbrek kapsülüne mekanik olarak verilmesini kolaylaştırdı. Bu yapıları oluşturmak için, bazal membran matrisi ilk önce buz gibi soğuk koşullar altında akışkan bir durumda tutuldu. Hücre agregasyonu daha sonra, konsantre bir hücre süspansiyonunun üzerine katmanlanması ve hücreleri yüksek yoğunluklu matris boyunca itmek için merkezkaç kuvveti kullanılmasıyla elde edildi. Santrifüj hızının (200-2000 x g) optimizasyonu, hücre sayısına da bağlı olan bir orta katman hücre konumlandırması elde etmek için gerekliydi (Şekil 1A). Daha yüksek santrifüj kuvvetleri (>500 x g) hücreleri pipetin en ucuna itti (Şekil 1B) ve esnek laboratuvar filmi kaplamasının çıkarılması sırasında kaybolabilecek daha küçük hücre sayıları (yani <5 x 105) için dikkatli olunması gerekir. Tersine, G kuvvetleri çok düşükse (≤200 x g) hücreler bazal membran matrisinden yeterince geçemeyebilir (Şekil 1C). <1 x 105 veya >2,5 x 106 hücre numaraları için santrifüj hızı daha fazla optimizasyona ihtiyaç duyabilir. Santrifüjlemeyi takiben, hücreler bazal membran matrisinin içine yerleştirildi ve yapı 37 °C'de 15 dakika ısıtıldı. Bu katılaştırma işlemi, matris "tapasının" ince bir tel piston kullanılarak tamamen çıkarılmasını sağladı (Şekil 1D).
İn vitro dalak organoid oluşumu
Uygun bir doku kültürü kabına püskürtülen bazal membran matriks tıkaçları, standart doku kültürü teknikleri ve koşulları (37 °C, %5 CO2, %95 nem) izlenerek korunabilen, tekrarlanabilir şekilde 3 boyutlu organoid benzeri yapılar oluşturmuştur11. Kültürde, destekleyici bazal membran matris substratı 0 ve 14. günler arasında kademeli olarak dağıldı (Şekil 2A, i-iii) ve 21. günde artık gözlemlenemedi ve yaklaşık 545 μm (s.d. = 120 μm, n = 6)11 çapında bozulmamış bir organoid benzeri küresel hücre kütlesi (Şekil 2A, vi) bıraktı. Bu organoid yapılar kültürde 30 günden fazla desteklendi, ancak zamanla boyut olarak artmadı (Şekil 2B). Dalak organoidleri CD45-TER-119-stromal, CD45-TER-119+ eritrosit ve CD45+TER-119- lenfoid hücrelerden oluşuyordu (Şekil 2C), ancak her popülasyonun sıklığı bireysel organoidler arasında değişkendi (n = 4; Tablo 1). Dalak organoidlerinin genel yapısını değerlendirmek için 50 μm kalınlığında doku kriyokesitleri hazırlandı ve görüntülendi. Organoidler, dokunun tüm çapı boyunca mevcut hücrelerle içi boş olmayan bir yapıdan oluşuyordu (Şekil 2D). 7 μm tek hücre tabakası kalınlığındaki organoid kesitlerin değerlendirilmesi, hücrelerin net bir uzamsal yönelim olmaksızın kordon benzeri yapılarda düzenlendiğini ortaya çıkardı (Şekil 2D), hücre dizileri arasında çekirdekten yoksun alanlarla. CD45 antikor boyama, organoidin periferik bölgelerini yoğun bir şekilde çevreleyen çekirdekli hematopoietik hücrelerin varlığını doğruladı (Şekil 2E). Ek olarak, daha merkezi organoid bölgelerde farklı, iğ şeklinde morfolojiye sahip CD45+ hücreleri gözlendi. CD90.2 (T hücresi) ve CD19 (B hücresi) antikorunun genel olarak yokluğu, ancak pozitif CD11b boyaması, miyeloid hücrelerin spesifik varlığını gösterdi (Şekil 2F). Hematopoetik olmayan CD105+ ve CD31+ endotel hücreleri de çoklu organoidlerdetespit edildi 11.
İn vivo dalak greft nakli
Agrega dalak stromal hücrelerinin yarı katı bir matriks içinde kapsüllenmesi, hayvan nakli çalışmalarını kolaylaştırır. Bu teknik, fraksiyone edilmemiş veya CD45-TER-119-FACS ile sıralanmış yenidoğan dalak stromal hücre preparatlarını bir bazal membran matris tıkacı içine gömmek için kullanıldı ve fare böbrek kapsülünün altına transplantasyon için bir araç görevi gördü. Benzer hücre agregasyon protokolleri8 ile uyumlu olarak, bazal membran matris kapsüllenmiş hücre yapıları (MECC'ler), 4/5 bağımsız hayvan transplantasyonunda dalak dokusunu başarılı bir şekilde rejenere eder ve böylece bu greft yapım tekniğinin uygulanabilirliğini doğrular. Dalak rejenerasyonu için gerekli hücre tiplerini tanımlamada MECC'lerin faydasını test etmek için, MECC greftleri, PDGFRβ+MAdCAM-1+ veya PDGFRβ+MAdCAM-1-stromal (CD45-) hücrelerden spesifik olarak tükenmiş yenidoğan dalak hücrelerinden yapılmıştır11. PDGFRβ+MAdCAM-1+ hücrelerinden yoksun greftler, brüt doku rejenerasyonu kapasitesini korudu (4/4 greft; Şekil 3A) 11. Dört rejenere dokudan üçü, merkezi arteriyoller, beyaz pulpa folikülleri, ayrılmış T ve B hücre bölmeleri, foliküler dendritik hücreler, marjinal zon retiküler hücreleri ve marjinal metalofilik makrofajlar, kırmızı pulpa sinüzoidleri, miyeloid hücreler ve makrofajlar sergileyen normal dalak hücre bileşimi ve yapısı sergiledi (Şekil 3B)11. Buna karşılık, PDGFRβ + MAdCAM-1- hücrelerinden yoksun greftler, dalak dokusunu (1/4 greft) yenilemede büyük ölçüde başarısız oldu11. Bu veriler, dalak dokusu rejenerasyonunda greft kaynaklı PDGFRβ+ hücrelerininönemini desteklemektedir 8 ve PDGFRβ+MAdCAM-1- stromal hücreler için spesifik bir gereksinimi belirlemektedir.
Şekil 1. Agrege dalak stromal hücrelerinin bazal membran matris kapsüllenmesi. 200 μL'lik bir pipet ucu, bir bazal membran matrisi içinde hücre toplanmasını kolaylaştırmak için kullanılır. Akışkan bir matris tabakası ilk olarak 2 μL buz gibi soğuk bazal membran matrisinin önceden soğutulmuş bir pipet ucuna aspire edilmesiyle oluşturulur. Matris tabakasının üzerinde bir hücre süspansiyonu biriktirilir ve bazal membran matrisi içindeki hücreleri harekete geçirmek ve toplamak için merkezkaç kuvveti uygulanır. (A) Santrifüj hızı ayarları, hücre agregalarını matris katmanının ortasına yerleştirmek için optimize edilmiştir. (B) Aşırı santrifüj hızı, pipetin sonunda toplanan hücrelere neden olur. (C) Yetersiz hız, matris boyunca hücre hareketini engeller. (D) 37 °C'de 15 dakika inkübasyonun ardından pipet ucundan yarı katı matrisli bir tapa çıkarılır. Ok uçları, hücre kümelerinin matris içindeki yerleşimini gösterir. Ölçek Çubuğu, 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Bazal membran matris enkapsüllü dalak agregatlarının in vitro kültürü ve 3 boyutlu organoid yapıların oluşumu. (A) 35 günlük bir süre boyunca dalak organoid gelişimi. Paneller (i-vi) kültürde 0, 7, 14, 21, 28 ve 35. günlere karşılık gelir. Görüntüler Nikon TS2 Ters Faz Kontrast Mikroskobu ile çekildi. Ölçek çubuğu, 500 μm. (B) Uzun kültür periyotları boyunca dalak organoid çapı. Her çizgi tek bir organoidi temsil eder. (C) Kültürde 53 gün sonra stromal (CD45-TER-119-), lenfoid (CD45+TER-119-) ve eritroid (CD45-TER-119+) hücre popülasyonlarının akış sitometrisi karakterizasyonu. Üst panel: Yenidoğan dalak stromasından hazırlanan kontrol dokusu. Alt panel: Dalak organoidi, Gün 52. (D) Kültürde 22 gün sonra 50 μm (üst paneller) ve 7 μm (alt paneller) kesit kalınlıklarında organoid doku brüt morfolojisi. (E) Kültürde 34 gün sonra CD45+ hematopoietik hücrelerin lokalizasyonu ve morfolojisi. Büyütülmüş bölge sağ panellerde gösterilir. Kesitler 7 μm'dir. (F) Kültürde 34 gün sonra miyeloid (CD11b), T (CD90.2) ve B (CD19) hücrelerinin değerlendirilmesi. Büyütülmüş bölge iç kısımda gösterilir. Kesitler 7 μm'dir. Görüntüler Nikon Eclipse Ti2-E Canlı Hücre Mikroskobu kullanılarak çekildi. Ölçek çubukları (D, E, F), 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Bazal membran matriks greft doku analizi. Greftler, PDGFRβ+MAdCAM-1+ hücrelerinden (n =4) yoksun neonatal dalak stromasından yapıldı. Çevrimiçi olarak sunulan ek veriler11. (A) Böbrek kapsülü altında transplantasyondan 4 hafta sonra rejenere bir dalak greftinin makroskopik görünümü. Kutulu sarı alan, rejenere dalak dokusunu gösterir. Görüntü, Snap zoom adaptörü ve Apple iPhone 6S ile donatılmış bir Leica M60 Stereomikroskop kullanılarak çekildi. Ölçek çubuğu, 1000 μm. (B) Koronal düzlemde kriyoseksiyona tabi tutulan 30 μm kalınlığındaki greft dokularının kompozit çok renkli immünofloresan görüntüleri. Dalak dokusu mikro mimarisini görselleştirmek için belirtilen belirteçlerle antikor boyaması yapıldı. Görüntüler Nikon Eclipse Ti2-E Canlı Hücre Mikroskobu kullanılarak çekildi. Kutulu alanlar daha yüksek büyütme oranlarına sahip bölgeleri gösterir. Ölçek çubuğu, 1000 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Organoid Hayır. | Stromal hücreler | Eritrositler | Lenfosit |
| 1 | 62 | 7.7 | 31 |
| 2 | 22 | 24 | 55 |
| 3 | 3.6 | 0.1 | 96 |
| 4 | 10 | 76 | 12 |
Tablo 1. Bireysel dalak organoidleri arasında stromal, eritroid ve lenfoid hücre popülasyonlarının yüzdesi.
Ek şekil 1. İn vitro ve in vivo çalışmalar için matris gömülü hücre yapılarının oluşturulmasındaki ana adımları vurgulayan protokolün şematik genel bakışı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yenidoğan dalak hücrelerinin yarı katı bir ortam içinde toplanması, dalak yapıları oluşturmak için uygun bir yöntemi temsil eder. Üç boyutlu dalak kültürlerini başlatmak için benzer bazal membran matris tabanlı protokoller kullanılmıştır10. Burada, dalak yapılarının in vitro organoid kültür sistemlerine ve in vivo transplantasyon modellerine eşit derecede uygun olduğunu gösteriyoruz. Dikkat çekici bir şekilde, in vitro kültürlenmiş dalak organoidlerinin transplantasyonu henüz test edilmemiştir, ancak tam veya kısmi dalak dokusu rejenerasyonu için kapasitenin belirlenmesi ilgi çekici olacaktır. Bu protokol aynı zamanda önceki dalak nakli çalışmalarında açıklanan hücre agregasyon tekniklerini de mirasalır 8. Bu çalışmalar, hücre agregatlarının bir kollajen tabakası üzerine yüklenmesini ve ardından böbrek kapsülünün altına nakledilmesini içeriyordu. Hücre agregalarının bazal membran matrisi içinde kaplanması, kollajen tabaka tarafı aşağı ve hücre agrega tarafı aşağı transplantasyon ile ilişkili varyasyonun ortadan kaldırıldığı greft oryantasyonu açısından belirgin bir avantaj sunar.
Bazal membran matris yapılarını hazırlama metodolojisi nispeten basittir. Yüksek konsantrasyonlu bazal membran matrisinin kullanılması, matris birkaç gün içinde dağılmadan önce hücrelerin başlangıçta toplu bir durumda desteklenmesini sağlar. Deneyimlerimize göre, bir PBS süspansiyonlu hücre çözeltisinin dikkatli bir şekilde katmanlanmasını (Adım 2.6) ve santrifüjlenmesini (Adım 2.8) takiben bazal membran matrisinin minimum düzeyde karıştırılması ve seyreltilmesi söz konusudur. Çoğu optimizasyon, hücre peletini matris tapası içinde konumlandırmaya odaklanır (Şekil 1). Bu, santrifüjleme hızı, süresi, bazal membran matris hacmi bileşimi, PBS askılı hücre çözeltisi hacmi ve pipet ucu boyutu gibi çeşitli değişkenler test edilerek ele alınabilir. Hücre sayısı ve özellikleri (boyut, yoğunluk) da ayarları etkileyebilir ve her hücre hazırlığı ayrı ayrı optimize edilmelidir.
Vurgulanması gereken birkaç sınırlama vardır. Bazal membran matrisi sıcaklığa duyarlı bir ürün olabilir ve reaktifleri soğuk tutmak için hızlı çalışmaya özen gösterilmelidir. Bu, erken matris katılaşmasını önler ve hücrelerin uygun şekilde kapsüllenmesini sağlar. İlgili tüm malzemeler soğuk bir ortamda saklanırken, hazırlanırken veya muhafaza edilirken, manuel kullanım adımları (örneğin, pipet ucunun çıkarılması, esnek laboratuvar filmiyle kapatılması [Adım 2.5]) kullanıcıdan değişken bir şekilde harici ısı verebilir, matris viskozitesini değiştirebilir ve santrifüjleme sırasında hücre göç özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, deneyler içinde ve arasında tekrarlanabilirliğin tutarlı bir şekilde elde edilmesi zor olabilir.
İkinci sınırlama, kullanıcı deneyimi ve yeterliliği gerekliliğidir. Bazı manuel tekniklerin verimli ve başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi için uzun süreli eğitim gerekebilir. Örneğin, pipet ucunun laboratuvar filmi ile kapatılması (Adım 2.5) başlangıçta düşük başarı oranlarına neden olabilir, ancak bu kaçınılmaz olarak pratikle düzelecektir. Hayvan mikro cerrahi teknikleri ile yeterlilik de tekrarlama yoluyla elde edilir. Transplantasyonlar için, özellikle pipet ucunu böbrek kapsülünün altına sokarken (Adım 4.2.10), tıpayı çıkarmak için tel pistonu yerleştirirken (Adım 4.2.11) ve ucu böbrekten çekerken dikkatli olunmalıdır. Pipet ucu aynı anda geri çekilirken fişin nazikçe ve sabit bir şekilde çıkarılması önemlidir. Aşırı hareket, böbrek kapsülünün delinmesine veya parankimin hasar görmesine neden olarak aşırı kanamaya neden olabilir.
Özetle, dalak dokusu oluşumunu anlamaya odaklanarak yarı katı bir matris içindeki hücreleri kapsüllemek için bir süreç burada açıklanmıştır. Bu sistem, çoklu in vitro veya in vivo aşağı akış uygulamaları potansiyeli olan çok çeşitli hücre tiplerine eşit olarak uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (#GNT1078247) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
| B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
| Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
| Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
| Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
| Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
| Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
| Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
| Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
| Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
| Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
| Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
| Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |
References
- Jarcho, S., Andersen, D.
- Storsteen, K. A., ReMine, W. Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis. Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).
- Mizrahi, S.
- Miko, I., et al. Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary. Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).
- Grikscheit, T. C., et al. Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model. Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).
- Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants. International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells. The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).
- Tan, J. K. H., Watanabe, T. Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration. Scientific Reports. 7 (1), 40401 (2017).
- Gee, K., et al. Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model. Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).
- Ueno, Y., et al. Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen. Scientific Reports. 9 (1), 20408 (2019).
- Tourle, K., Rucinski, A., Grainger, A., Limnios, I. J., Gonzalez Ruiz, M., Tan, J. K. H. Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation. , https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023).
