Kældermembranmatrixindkapslet celleaggregering til undersøgelse af dannelse af murinmiltvæv

Summary

Denne artikel beskriver en protokol til aggregering og indkapsling af miltceller i en halvfast kældermembranmatrix. Kældermembranmatrixkonstruktioner kan anvendes i tredimensionel kultur til undersøgelse af organoidudvikling eller til in vivo-transplantation og vævsregenereringsundersøgelser.

Abstract

Milten er et immunorgan, der spiller en central rolle i blodbårne immunresponser. Det anatomiske eller funktionelle tab af dette væv øger modtageligheden for alvorlige blodinfektioner og sepsis. Autotransplantation af miltskiver er blevet brugt klinisk til at erstatte tabt væv og genoprette immunfunktionen. Imidlertid er mekanismen, der driver robust og immunologisk funktionel miltvævsregenerering, ikke blevet fuldt belyst. Her sigter vi mod at udvikle en metode til aggregering og indkapsling af miltceller i en halvfast matrix for at undersøge de cellulære behov for miltvævsdannelse. Kældermembranmatrixindkapslede cellekonstruktioner er modtagelige for både in vitro-vævskultur af tredimensionelle organoider såvel som transplantation under nyrekapslen for direkte at vurdere in vivo-vævsdannelse. Ved at manipulere inputcellerne til aggregering og indkapsling demonstrerer vi, at transplantatafledte PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- neonatale stromale celler er nødvendige for miltvævsregenerering under dyretransplantationsmodeller.

Introduction

Traumatisk brud på milten og udseendet af flere miltknuder i kroppen var en af de første indikationer på, at miltvæv havde regenerativ kapacitet ^1,2. Miltautotransplantationer blev senere introduceret i klinikken for at bevare miltvæv hos patienter, der kræver akut splenektomi³. På trods af at det har været en del af klinisk praksis i årtier, er der meget lidt kendt om, hvordan milten regenererer. Dyretransplantationsmodeller har givet indsigt i flere parametre for miltregenerering og immunfunktion ^4,5. Især har eksperimentelle modifikationer af transplantatpræparationsmetoden gjort det muligt at undersøge vævsregenerering mere detaljeret på cellulært og molekylært niveau.

Transplantationer, der involverer hele miltskiver, gennemgår en fase med massenekrose, før en ny miltstruktur genopbygges⁶. Den indledende fase af transplantannekrose tyder på, at hovedparten af transplanteret væv stort set består af røde og hvide blodlegemer og er unødvendig for miltregenerering. Dette blev undersøgt eksperimentelt ved at udelukke hæmatopoietiske celler fra milttransplantater før transplantation under musens nyrekapsel. Her viste miltens ikke-leukocyt/ikke-erytrocytfraktion, som omfatter stromale og endotelceller, sig at være tilstrækkelig til at inducere de novo vævsdannelse⁷. Miltstromalvæv kunne yderligere behandles til en enkeltcellesuspension, hvilket muliggør anvendelse af cellesorteringsteknologier til at manipulere cellulær transplantatsammensætning. Ved selektivt at fjerne kandidatcelletyper blev der identificeret to CD45-TER-119-stromale cellepopulationer, der var uundværlige for transplantatudvikling: en endotellignende CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ cellepopulation og en mere bredt defineret PDGFRβ⁺ mesenkymalcellepopulation⁸.

Konstruktionen af transplantater fra miltceller varierer med hensyn til støttematerialer og cellebelastningsprocesser. Milt fremstillet ud fra manipuleret væv er tidligere blevet fremstillet ved at lægge miltenheder på et polyglykolsyre/poly-L mælkesyrepolymerstillads ^5,9. Interessant nok kunne miltstromale celler absorberet i en kollagensvamp ikke indpodes, mens stromale celler aggregeret og indlæst over et kollagenark lettede miltregenerering⁸. Resuspensionen af miltstromale celler inde i en Matrigel-matrix har også vist sig at inducere celleaggregering under tredimensionelle kulturbetingelser¹⁰. Denne metode er dog ikke testet til brug i transplantationsmodeller. Det overordnede mål med den nuværende protokol er at tvangsaggregere og indkapsle miltstromale celler direkte i kældermembranmatrixen, som efterfølgende kan overføres til et tredimensionelt in vitro-vævskultursystem eller anvendes som et køretøj til dyremodeltransplantationer (supplerende figur 1).

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til forsøgsprotokoller godkendt af University of Queensland Animal Ethics Committee (UQBR/079/19).

1. Vævsopsamling og stromalcelleforberedelse

1. Aflive 0,5-1,5 dage gamle han- og/eller hun-BALB/c neonatale donormus ved induktion af hypotermi ved at pakke dyrene ind i silkepapiret og lægge dem under knust is i >10 min.
   BEMÆRK: Denne protokol kan tilpasses forskellige musestammer, aldre og antallet af dyr.
2. Forbered sterile kirurgiske instrumenter.
3. Læg musen i en ret lateral position. Swab huden med 80% ethanol og lav et 1 cm snit med Iris kirurgiske saks for at udsætte bugvæggen.
4. Lav et andet 0,5 cm snit over milten og brug et par fine tang til forsigtigt at løfte vævet op. Brug en kirurgisk saks til at skære blodkarrene og skære vævet. Overfør vævet til en petriskål, der indeholder iskold fosfatbufret saltvand (PBS). Fjern eventuelt resterende bindevæv, der er fastgjort til milten.
   BEMÆRK: Et stereomikroskop kan hjælpe fine motoriske bevægelser, der kræves til manipulation af kirurgiske instrumenter.
5. For at adskille hele væv overføres neonatal milt (puljer på 10 eller mindre) til den indre rand af en omvendt 14 ml konisk rørhætte. Mekanisk afbryde væv med en pressebevægelse ved hjælp af plastbagenden af et 1 ml sprøjtestempel.
6. Placer og fastgør hætten tæt over et 14 ml konisk rør indeholdende 10 ml koldt PBS. Vend røret 5x for at vaske alt forstyrret væv fra hætten ind i røret.
7. Gentag trin 1.6 for eventuelt resterende væv.
8. Lad røret ligge på is i 1 min for at lade vævet sætte sig til bunden af røret.
9. Supernatanten (indeholdende hæmatopoietiske celler) kasseres forsigtigt ved at føre opløsningen gennem en reversibel 70 μm cellesi.
10. Den uopløselige stromale fraktion genvindes ved at vende sien og vaske stromalvævet tilbage i det koniske 14 ml koniske rør ved hjælp af frisklavet 2 ml suppleret Dulbeccos modificerede ørnemedium (sDMEM) indeholdende 1 mg/ml kollagenase IV, 40 μg/ml DNase I og 2 % føtalt bovint serum (FBS).
    FORSIGTIG: Collagenase IV og Collagenase D er farlige stoffer og skal håndteres inde i et biosikkerhedsskab med passende personlige værnemidler.
11. Til fremstilling af en enkeltcellesuspension fordøjes poolet væv enzymatisk (op til 20) i 10 minutter ved 37 °C med konstant rotation.
12. Der tilsættes 4 ml frisklavet sDMEM indeholdende 1 mg/ml collagenase D, 40 μg/ml DNase I og 2% FBS direkte til røret med stromalvæv. Der inkuberes i yderligere 10 minutter ved 37 °C med konstant rotation.
13. Stop fordøjelsen ved at tilsætte 8 ml iskold PBS. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
14. Supernatanten kasseres, og cellerne vaskes to gange ved resuspendering i 1 ml kold PBS og centrifugering ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Hold celler på is.
    BEMÆRK: Celler kan tælles og justeres til en ønsket koncentration. Dette kan kræve optimering for forskellige cellepopulationer. Ved hjælp af denne protokol genvindes typisk 0,5^x 10 6^stromale celler / milt afhængigt af donormusens alder. Celler kan valgfrit farves og FACS sorteres på dette stadium for at definere cellesammensætning.

2. Matrixindkapsling af celleaggregater

1. Forkølede sterile P200-pipettespidser inde i en fryser på -20 °C.
2. Skær fleksibel laboratoriefilm (f.eks. Parafilm) i stykker på 1 cm x 2 cm og steriliser ved nedsænkning i 80% ethanol i 10 minutter efterfulgt af PBS i 10 minutter. Laboratoriefilm kan fremstilles på forhånd og opbevares sterilt.
3. Forbered 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ celler ved centrifugering ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten suges forsigtigt, så der efterlades ca. 20 μL af det resterende PBS-rumfang. Hold cellepillen på is.
   BEMÆRK: Den resterende PBS kan forsigtigt aspireres uden at forstyrre cellepillen for at bekræfte volumenet.
4. Opsug 2 μL iskold membranmatrix i kælderen til en forkølet P200-pipettespids ved hjælp af en P20-pipetter.
   BEMÆRK: En stærkt koncentreret kældermembranmatrix (f.eks. Corning Matrigel Matrix High Concentration) hjælper med at danne et stærkt størknet stik.
5. Drej forsigtigt for at skubbe pipettespidsen ud. Stræk en præsteriliseret strimmel af laboratoriefilmen og læg den over enden af pipettespidsen, og pas på ikke at gennembore filmen. Fortsæt med at pakke spidsen ind i filmen for at forsegle pipettespidsen. Placer forsigtigt den forseglede spids direkte på is, og pas på ikke at sprænge filmen.
6. Resuspender cellepellet i den resterende PBS og lag opløsningen forsigtigt over kældermembranmatrixen. Hold konstruktionen på is.
7. Forbered et centrifugeringsrør ved at placere et 1,2 ml klyngerør inde i et 14 ml konisk rør.
8. Pipettespidsen anbringes i den indlejrede rørkonfiguration, og centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter.
9. Det koniske 14 ml koniske rør anbringes lodret, og det inkuberes ved 37 °C i 15 minutter, så membranmatrixen i kælderen kan størkne inde i pipettespidsen.
   BEMÆRK: Det 14 ml koniske rør kan placeres på is, indtil det kræves til nedstrøms anvendelse.

3. Tredimensionel organoidkultur

1. Fjern forsigtigt laboratoriefilmen fra pipettespidsen.
2. Indsæt et tyndt trådstempel i rustfrit stål gennem pipettespidsens større åbning.
3. Matrixproppen udstødes, indtil den frigives gennem spidsen i en brønd i en ikke-behandlet 6-brønds vævskulturplade indeholdende 2 ml sDMEM suppleret med 10% FBS, 1x glutamax, 1x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 10 μM stenhæmmer, 10 U / ml penicillin / streptomycin og 50 μM β-mercaptoethanol.
   BEMÆRK: Vævskulturbeholderen og det tilsvarende medievolumen kan justeres efter behov.
   FORSIGTIG: NEAA, Penicillin / Streptomycin og β-mercaptoethanol er farlige stoffer og skal håndteres inde i et biosikkerhedsskab med passende personlige værnemidler.
4. Kulturorganoider ved 37 °C, 5% CO₂ og 95% fugtighed i 4-12 uger.
5. Udskift halvdelen af mediet hver 5. dag.
   BEMÆRK: Hvis organoider begynder at binde sig til vævskulturpladen, overføres de til en frisk brønd.

4. Nyrekapseltransplantation

1. Forbered sterile kirurgiske instrumenter.
2. Udfør en subkapsulær nyretransplantation af kældermembranmatrixstikket:
   1. Bedøv 8 uger gammel BALB/c hun-modtagermus med isofluran i henhold til Institutional Animal Ethics Guidelines.
      FORSIGTIG: Isofluran er et farligt stof. Spildgas skal skylles for at forhindre adgang til arbejdsmiljøet.
   2. Læg musen i en ret lateral position.
   3. Barber håret fra operationsstedet og desinficer huden i henhold til institutionelle retningslinjer.
      BEMÆRK: Det anbefales, at det kirurgiske sted desinficeres tre gange i en cirkulær bevægelse med skiftevis jodbaseret eller chlorhexidinbaseret og alkoholbaseret skrubbe.
   4. Lav et 2 cm snit i huden vinkelret på rygsøjlen for at udsætte peritonealvæggen.
      BEMÆRK: Fin kirurgisk saks eller et skalpelblad kan bruges til hudsnit. Brugere bør følge institutionelle retningslinjer for dyreetik eller standardprocedurer.
   5. Lav et mindre 0,5 cm snit i peritonealvæggen over nyrerne.
      BEMÆRK: Snittet skal tilnærme nyrebredden for at sikre, at nyren forbliver eksteriøriseret under transplantationen.
   6. Udvendig nyren gennem peritonealåbningen ved at anvende nedadgående tryk ved hjælp af tommelfingeren og pegefingeren. En pincet kan bruges til at hjælpe udvendigt. Sørg for, at nyrerne er fugtige under hele proceduren ved regelmæssigt at anvende steril PBS ved hjælp af en vatpind.
   7. Under et stereomikroskop skal du klemme nyrekapslens perirenale fedt med et par bøjede ultrafine tang ved den ene pol af nyrerne. Brug et andet par bøjede ultrafine tang til forsigtigt at rive nyrekapselmembranen opad i modsat retning, hvilket skaber en lille åbning.
   8. Indsæt forsigtigt benet på en tang under kapselmembranen. Brug en langsom fejende bevægelse til at adskille kapselmembranen fra nyreparenchymen.
   9. Forbered kældermembranmatrixproppen til transplantation ved at fjerne laboratoriefilm fra pipettespidsen.
   10. Løft nyrekapslen med en tangspids og indsæt pipettespidsen gennem åbningen, og skub den mod nyrens modsatte pol.
   11. Sæt et trådstempel ind i pipettespidsen, og skub matrixstikket ud, samtidig med at pipettespidsen trækkes ud af nyren.
   12. Fugt nyrerne med PBS og internaliser igen.
   13. Luk bugvæggen med en 5-0 Vicryl sutur og luk huden med to autoclips.
   14. Administrer smertestillende (buprenorphin ved 0,05-0,1 mg/kg subkutant eller i henhold til institutionelle dyreetiske retningslinjer).
       FORSIGTIG: Buprenorphin er et farligt stof og skal håndteres med passende personlige værnemidler.
3. Sluk for strømmen af isofluran, men hold iltstrømmen tændt, så musen kan trække vejret rent ilt, indtil den begynder at komme til bevidsthed.
4. Sæt musen tilbage i buret. Hold dyret varmt under genopretning ved delvist at placere buret oven på en varmepude eller under en varmelampe, og overvåg, indtil musen er helt genoprettet fra anæstesi.
5. Overvåg postkirurgisk bedring i de første to uger eller som krævet af institutionelle retningslinjer.

Representative Results

Celleaggregering er vigtig for at fremme celle-til-celle-kontakt og signalering. Indkapsling af celleaggregater inde i kældermembranmatrixen understøttede begge 3-dimensionelle kulturer til in vitro vævsorganoiddannelse og lettede den mekaniske levering af celler i nyrekapslen til transplantattransplantation. For at etablere disse konstruktioner blev kældermembranmatrixen først opretholdt i flydende tilstand under iskolde forhold. Celleaggregering blev efterfølgende opnået ved lagdeling af en koncentreret cellesuspension over og anvendelse af centrifugalkraft til at skubbe celler gennem højdensitetsmatrixen. Optimering af centrifugeringshastigheden (200-2000 x g) var nødvendig for at opnå en mellemlagscellepositionering (figur 1A), som også var afhængig af cellenummeret. Højere centrifugalkræfter (>500 x g) drev cellerne helt frem til pipettens spids (figur 1B), og der skal udvises forsigtighed ved mindre celleantal (dvs. <5 x 10⁵), der kan gå tabt under fjernelse af den fleksible laboratoriefilmdækning. Omvendt kan celler muligvis ikke bevæge sig tilstrækkeligt gennem kældermembranmatrixen, hvis G-kræfterne er for lave (≤200 x g) (figur 1C). Centrifugeringshastighed for cellenumre <1 x 10⁵ eller >2,5 x 10⁶ skal muligvis optimeres yderligere. Efter centrifugering blev cellerne sat inde i kældermembranmatrixen ved opvarmning af konstruktionen til 37 °C i 15 minutter. Denne størkningsproces gjorde det muligt at skubbe matrixens "stik" helt ud (figur 1D) ved hjælp af et tyndt trådstempel.

In vitro miltorganoid dannelse
Kældermembranmatrixpropper, der udslynges i en passende vævskulturbeholder, dannede reproducerbart 3-dimensionelle organoidlignende strukturer, som kunne opretholdes efter standard vævskulturteknikker og -betingelser (37 °C, 5% CO₂, 95 % fugtighed)¹¹. I kultur forsvandt det understøttende kældermembranmatrixsubstrat gradvist mellem dag 0 og 14 (figur 2A, i-iii) og kunne ikke længere observeres på dag 21, hvilket efterlod en intakt organoidlignende sfærisk cellemasse (figur 2A, vi), der måler ca. 545 μm (s.d. = 120 μm, n = 6)¹¹ i diameter. Disse organoide strukturer blev understøttet i kultur ud over 30 dage, men steg ikke i størrelse over tid (figur 2B). Miltorganoider var sammensat af CD45-TER-119^- stromal, CD45-TER-119⁺ erytrocyt og CD45⁺TER-119^- lymfoide celler (figur 2C), men hyppigheden af hver population var variabel på tværs af individuelle organoider (n = 4; Tabel 1). For at vurdere miltorganoidernes generelle struktur blev 50 μm tykke vævskryosektioner forberedt og visualiseret. Organoider bestod af en ikke-hul struktur med celler til stede over hele vævets diameter (figur 2D). Vurdering af organoidsektioner ved 7 μm enkeltcellelagtykkelse afslørede, at celler var arrangeret i snorlignende strukturer uden en klar rumlig orientering (figur 2D) med områder uden kerner mellem cellestrenge. CD45-antistoffarvning verificerede tilstedeværelsen af nukleerede hæmatopoietiske celler, som tæt omringede organoidens perifere områder (figur 2E). Derudover blev CD45⁺ celler med tydelig, spindelformet morfologi observeret i mere centrale organoide regioner. Et generelt fravær af CD90.2 (T-celle) og CD19 (B-celle) antistoffarvning, men positiv CD11b-farvning, viste den specifikke tilstedeværelse af myeloide celler (figur 2F). Ikke-hæmatopoietiske CD105⁺ og CD31⁺ endotelceller blev også påvist i flere organoider¹¹.

In vivo milttransplantattransplantation
Indkapslingen af aggregerede miltstromale celler i en halvfast matrix letter dyretransplantationsundersøgelser. Denne teknik blev brugt til at indlejre ufraktionerede eller CD45-TER-119^- FACS sorterede neonatal milt stromale cellepræparater inde i en kældermembranmatrixprop, der tjener som et køretøj til transplantation under musens nyrekapsel. I overensstemmelse med lignende celleaggregeringsprotokoller⁸ regenererede kældermembranmatrixindkapslede cellekonstruktioner (MECC'er) med succes miltvæv i 4/5 uafhængige dyretransplantationer, hvilket bekræftede levedygtigheden af denne transplantatkonstruktionsteknik. For at teste nytten af MECC'er til at definere celletyper, der kræves til miltregenerering, blev MECC-transplantater konstrueret af neonatale miltceller, som specifikt var udtømt af PDGFRβ ⁺ MAdCAM-1 ⁺ eller PDGFRβ ⁺ MAdCAM-1^- stromale (CD45^-) celler¹¹. Transplantater, der manglede PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ celler, bevarede kapaciteten til grov vævsregenerering (4/4 transplantater; Figur 3A) ¹¹. Tre ud af fire regenererede væv udviste normal miltcellesammensætning og -struktur med centrale arterioler, hvidmassefollikler, adskilte T- og B-cellerum, follikulære dendritiske celler, retikulære celler i marginalzonen og marginale metallofile makrofager, sinusoider med rød papirmasse, myeloide celler og makrofager (figur 3B)¹¹. I modsætning hertil undlod transplantater, der manglede PDGFRβ⁺MAdCAM-1-celler, stort set ikke at regenerere miltvæv (1/4 transplantater)¹¹. Disse data understøtter vigtigheden af transplantatafledte PDGFRβ⁺ celler i miltvævsregenerering⁸ og udpeger et specifikt krav til PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- stromale celler.

Figur 1. Indkapsling af kældermembranmatrix af aggregerede miltstromale celler. En 200 μL pipettespids bruges til at lette celleaggregering inde i en kældermembranmatrix. Et fluidisk matrixlag etableres først ved at opsuge 2 μL iskold kældermembranmatrix til en forkølet pipettespids. En cellesuspension deponeres over matrixlaget, og centrifugalkraft påføres for at mobilisere og aggregere celler i kældermembranmatrixen. (A) Indstillinger for centrifugehastighed er optimeret til at placere celleaggregater midtvejs langs matrixlaget. (B) For høj centrifugalhastighed resulterer i celler, der aggregeres i pipettens ende. (C) Utilstrækkelig hastighed forhindrer cellebevægelse gennem matrixen. D) En halvfast matrixprop skubbes ud af pipettespidsen efter inkubation ved 37 °C i 15 minutter. Pilespidser angiver placeringen af celleaggregater i matrixen. Vægtstang, 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. In vitro kultur af kældermembranmatrix-indkapslede miltaggregater og dannelsen af 3-dimensionelle organoidstrukturer. (A) Miltorganoidudvikling over et 35-dages tidsforløb. Paneler (i-vi) svarer til dag 0, 7, 14, 21, 28 og 35 i kultur. Billeder blev taget på et Nikon TS2 Inverted Phase Contrast Microscope. Skalastang, 500 μm. (B) Miltorganoiddiameter over længere dyrkningsperioder. Hver linje repræsenterer en individuel organoid. (C) Flowcytometrikarakterisering af stromale (CD45-TER-119^-), lymfoide (CD45⁺TER-119^-) og erythroide (CD45-TER-119⁺) cellepopulationer efter 53 dage i kultur. Overpanel: Kontrolvæv fremstillet af neonatal miltstroma. Nederste panel: Miltorganoid, dag 52. D) Organoidvævets bruttomorfologi ved 50 μm (øvre paneler) og 7 μm (nedre paneler) sektionstykkelser efter 22 dage i kultur. (E) Lokalisering og morfologi af CD45⁺ hæmatopoietiske celler efter 34 dage i kultur. Forstørret område vises i højre panel. Sektioner er 7 μm. (F) Vurdering af myeloide (CD11b), T (CD90.2) og B (CD19) celler efter 34 dage i kultur. Forstørret område vises i indsat. Sektioner er 7 μm. Billeder blev taget ved hjælp af et Nikon Eclipse Ti2-E Live Cell Microscope. Skalastænger (D, E, F), 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3. Analyse af kældermembranmatrixtransplantatvæv. Transplantater blev konstrueret af neonatal miltstroma udtømt af PDGFRβ ⁺ MAdCAM-1 ⁺ celler (n = 4). Yderligere data tilgængelige online¹¹. (A) Makroskopisk udseende af et regenereret milttransplantat 4 uger efter transplantation under nyrekapslen. Det gule område i boks angiver regenereret miltvæv. Billedet blev taget ved hjælp af et Leica M60 stereomikroskop udstyret med en Snap zoom-adapter og en Apple iPhone 6S. Skalabjælke, 1000 μm. (B) Sammensatte flerfarvede immunfluorescensbilleder af transplantatvæv med en tykkelse på 30 μm kryosektioneret på koronalplanet. Antistoffarvning blev udført med angivne markører for at visualisere miltvævets mikroarkitektur. Billeder blev taget ved hjælp af et Nikon Eclipse Ti2-E Live Cell Microscope. Boksområder viser områder med højere forstørrelse. Vægtstang, 1000 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Organoid nr.	Stromale celler	Erytrocytter	Lymfocytter
1	62	7.7	31
2	22	24	55
3	3.6	0.1	96
4	10	76	12

Tabel 1. Procentdel stromale, erythroide og lymfoide cellepopulationer blandt individuelle miltorganoider.

Supplerende figur 1. Skematisk oversigt over protokollen, der fremhæver de vigtigste trin i generering af matrixindlejrede cellekonstruktioner til in vitro- og in vivo-undersøgelser . Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Aggregeringen af neonatale miltceller inde i et halvfast medium repræsenterer en levedygtig metode til generering af miltkonstruktioner. Lignende kældermembranmatrixbaserede protokoller er blevet brugt til at initiere tredimensionelle miltkulturer¹⁰. Her demonstrerer vi, at miltkonstruktioner er lige så modtagelige for in vitro organoidkultursystemer såvel som in vivo-transplantationsmodeller . Det skal bemærkes, at transplantationen af in vitro-dyrkede miltorganoider endnu ikke er blevet testet, men det ville være af interesse at bestemme kapaciteten til fuld eller delvis miltvævsregenerering. Denne protokol arver også celleaggregeringsteknikker beskrevet i tidligere milttransplantationsundersøgelser⁸. Disse undersøgelser involverede lastning af celleaggregater over et kollagenark efterfulgt af transplantation under nyrekapslen. Indkapsling af celleaggregater inde i kældermembranmatrixen giver en klar fordel med hensyn til transplantatorientering, hvor variation forbundet med kollagenarksiden nedad versus celleaggregat-side nedad elimineres.

Metoden til fremstilling af kældermembranmatrixkonstruktioner er relativt ligetil. Brugen af kældermembranmatrix med høj koncentration sikrer, at celler oprindeligt understøttes i en aggregeret tilstand, før matrixen spredes over flere dage. Det er vores erfaring, at der er minimal blanding og fortynding af kældermembranmatrixen efter omhyggelig lagdeling (trin 2.6) og centrifugering (trin 2.8) af en PBS-suspenderet celleopløsning. De fleste optimeringer centrerer sig om placering af cellepellet i matrixstikket (figur 1). Dette kan løses ved at teste flere variabler såsom centrifugeringshastighed, tid, kældermembranmatrixvolumensammensætning, PBS-suspenderet celleopløsningsvolumen og pipettespidsstørrelse. Celleantal og karakteristika (størrelse, tæthed) kan også påvirke indstillinger, og hvert cellepræparat skal optimeres individuelt.

Flere begrænsninger er vigtige at fremhæve. Kældermembranmatrix kan være et temperaturfølsomt produkt, og man skal sørge for at arbejde hurtigt for at holde reagenserne kolde. Dette forhindrer for tidlig matrixstørkning og sikrer korrekt indkapsling af cellerne. Mens alle relevante materialer opbevares, klargøres eller vedligeholdes i kolde omgivelser, kan manuelle håndteringstrin (f.eks. udslyngning af pipettespidsen, forsegling med fleksibel laboratoriefilm [Trin 2.5]) varierende indføre ekstern varme fra brugeren, ændre matrixviskositeten og påvirke cellemigrationskarakteristika under centrifugering. Reproducerbarhed inden for og mellem eksperimenter kan derfor være vanskelig at opnå konsekvent.

Den anden begrænsning er kravet om brugeroplevelse og færdigheder. Visse manuelle teknikker kan kræve udvidet træning for at udføre effektivt og med succes. For eksempel kan forsegling af pipettespidsen med laboratoriefilm (trin 2.5) i første omgang resultere i lave succesrater, men dette vil uundgåeligt forbedres med praksis. Kompetence med dyremikrokirurgiske teknikker opnås også gennem gentagelse. Ved transplantationer skal der udvises forsigtighed, især når pipettespidsen indsættes under nyrekapslen (trin 4.2.10), trådstemplet indsættes for at skubbe stikket ud (trin 4.2.11), og spidsen trækkes ud af nyrerne. Det er vigtigt, at stikket skubbes forsigtigt og støt ud, mens pipettespidsen samtidig trækkes ud. Overdreven bevægelse kan resultere i, at nyrekapslen bliver perforeret eller parenchymen bliver beskadiget, hvilket fører til overdreven blødning.

Sammenfattende er en proces til indkapsling af celler i en halvfast matrix beskrevet her med fokus på forståelse af miltvævsdannelse. Dette system kan ligeledes anvendes på en lang række celletyper med potentiale for flere in vitro- eller in vivo-downstream-anvendelser .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm