Soft Agar Colony Formation Assay: Une méthode pour tester les effets de nouveaux composés sur la prolifération des cellules cancéreuses

Pour commencer, prenez une concentration appropriée d’agarose fondue dans un tube conique et ajoutez-lui la quantité désirée de milieu de culture chaud. Inverser doucement pour mélanger le contenu. Ajouter ce mélange dans chaque puits d’une assiette de six puits et lui permettre de se solidifier. C’est la couche inférieure. Ensuite, traiter les cellules cancéreuses avec le composé d’intérêt et ajouter la concentration requise d’agarose.

Maintenant, versez ce mélange contenant le nombre désiré de cellules par millilitre dans chaque puits. Il s’agit d’une couche contenant des cellules. Une fois que le milieu se solidifie, incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une semaine. Préparer une couche d’alimentation en mélangeant l’agarose au milieu et compléter ce mélange avec le composé d’intérêt. Ajouter délicatement cette couche d’alimentation dans chaque puits, lui permettre de se solidifier et d’incuber la plaque à 37 degrés Celsius.

Répétez cette procédure d’alimentation chaque semaine pour reconstituer les cellules avec le milieu jusqu’à ce que les colonies se forment. Si le composé d’intérêt est un inhibiteur de la tumorigénicité, il supprimera la croissance des cellules résultant en quelques colonies dans les puits. Dans le protocole suivant, nous effectuerons un essai mou de formation de colonie d’agar pour étudier l’effet des inhibiteurs de PADI sur la tumorigenicity des cellules cancéreuses de sein.

Commencez cette procédure en préparant 3% d’agarose 2 hydroxyéthyles. Dans une bouteille en verre propre et sèche de 100 millilitres, ajouter 0,9 gramme d’agarose 2 hydroxyéthyle suivie de 30 millilitres d’eau distillée. Cuire le mélange au micro-ondes pendant 15 secondes et faire tourbillonner doucement. Répétez cette étape jusqu’à ce que la poudre d’agarose se dissolve complètement. Ensuite, autoclave la solution contenant de la bouteille pendant 15 minutes.

Laissez refroidir la solution agarose à température ambiante avant d’en utiliser davantage. Préchauffer plusieurs pipettes de cinq millilitres et de 10 millilitres dans un incubateur de 37 degrés Celsius pour empêcher l’agarose de se solidifier dans la pipette lors de la manipulation. Relâchez partiellement le couvercle de la bouteille et micro-ondes la solution d’agarose 2 hydroxyéthyle pré-faite de 3 % pendant 15 secondes. Puis faites pivoter doucement la solution et micro-ondes pendant encore 15 secondes.

Soyez prudent lorsque vous tourbillonnez la solution agarose parce que la solution se lève lorsqu’elle est exposée à l’air et peut déborder. S’il y a du gel solide résiduel dans la bouteille, cuire au micro-ondes pendant encore quelques secondes. Gardez la bouteille contenant la solution agarose dans un bain d’eau de 45 degrés Celsius pendant les prochaines étapes pour empêcher la solution agarose de se solidifier prématurément.

Ensuite, transférez 12 millilitres de supports réchauffés à l’aide des pipettes préchauffées dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Ajouter immédiatement trois millilitres de la solution agarose de 3% et inverser doucement le tube conique pour mélanger l’agarose avec les médias. Ajouter ensuite délicatement deux millilitres de ce mélange dans chaque puits d’une plaque de culture de six puits sans former de bulles d’air. Incuber la plaque de culture de six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant une heure pour permettre au mélange de se solidifier.

Après que le mélange se solidifie, placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. La couche inférieure est maintenant prête à l’emploi.

Un aspect difficile de cette procédure est de s’assurer que toutes les cellules sont distribuées également et que le gel agarose fondu ne se solidifie pas avant l’ajout à chaque puits, pour s’assurer que les cellules sont mélangées dans les médias avant d’ajouter le gel d’agarose liquide. En outre, les pipettes sont préchauffées à l’avance pour éviter que les solutions ne se solidifient lors de la manipulation.

Pour préparer la cellule contenant une couche, essayez d’abord de trypsiniser les cellules MCF10DCIS et de les diluer à une concentration cellulaire de 40 000 cellules par millilitre. Ensuite, prenez huit millilitres de médias à l’aide de pipettes préchauffées, et transférer dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Ajouter immédiatement deux millilitres de 3% d’agarose au tube conique, et inverser doucement pour mélanger l’agarose avec les médias. Évitez de former des bulles.

Ensuite, prenez deux millilitres des cellules et traitez-les avec deux micromolaires BB-chlor-amidine dans DMSO, ou DMSO seul comme le contrôle. Après le traitement, mélanger les cellules avec un agarose de 0,6% dans une dilution d’un à un pour faire une concentration finale d’un micromolaire BB-chlor-amidine. Ensuite, prenez un millilitre du mélange cellule-agarose et ajoutez doucement sur la couche inférieure de la plaque de culture de six puits.

Placez la plaque de culture de six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes pour permettre à la couche supérieure de se solidifier. Après que le mélange se solidifie, placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant une semaine avant d’ajouter la couche d’alimentation. Commencez la préparation de la couche d’alimentation en micro-ondes de la solution d’agarose pré-faite 3% 2 hydroxyethyl comme avant, et en équilibrant la bouteille de solution d’agarose dans un bain d’eau de 45 degrés Celsius.

Mélangez un millilitre de solution agarose de 3% avec neuf millilitres de médias chauds dans un tube conique de 50 millilitres, et inversez doucement pour mélanger l’agarose avec le média. Évitez de former des bulles d’air. Après avoir traité le mélange avec du BB-chlor-amidine, ajouter délicatement un millilitre du mélange dans chaque puits de la plaque de culture de six puits contenant les couches inférieures et molles. Ensuite, placez la plaque de culture de six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes pour permettre au mélange de se solidifier.

Une fois que la couche d’alimentation se solidifie, placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius. Répétez cette procédure d’alimentation chaque semaine en superposant un millilitre de solution de traitement moyen agarose de 0,3 % sur la couche d’alimentation existante pour reconstituer les cellules avec de nouveaux médias jusqu’à ce que la formation de la colonie soit observée.