Microscopia spettrale riflettometrica su assoni Myelinated In Situ

Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della mielina, come la plasticità della mielina e la demielinizzazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio della nanostruttura dell'assone mielinizzato nel tessuto cerebrale intatto senza alcuna marcatura complessa o preparazione del campione. Qui, dimostreremo l'applicazione in una fetta di cervello, ma questa tecnica può essere estesa agli animali vivi.

Dopo aver fissato e affettato il tessuto cerebrale del topo secondo il protocollo di testo, preparare un vetrino e due vetrini di copertura per ogni fetta di tessuto. Usa un tagliavetro per tagliare a metà uno dei bicchieri quadrati di copertura. Quindi, crea un distanziatore usando la supercolla per attaccare i due pezzi sul vetrino.

Usando un pennello o una pipetta, prelevare una fetta di cervello e adagiare il tessuto su un vetrino tra il distanziatore, facendo attenzione a non piegare il tessuto. Erogare 100 microlitri di PBS sulla superficie del tessuto. Quindi, posizionare il secondo vetro di copertura quadrato sulla parte superiore del fazzoletto evitando l'introduzione di bolle d'aria.

Utilizzare lo smalto per unghie per sigillare intorno al vetro di copertura per evitare l'evaporazione del PBS e la contaminazione da polvere durante la successiva sessione di imaging. Almeno un'ora prima dell'imaging, accendere il microscopio per consentire la stabilizzazione termica della sorgente laser. Quindi accendi il software per la scansione spettrale e fai clic sul pulsante di acquisizione nella parte superiore della GUI.

Attivare l'otturatore del software per il laser a luce bianca e il tubo fotomoltiplicatore. In modalità di acquisizione, selezionare la modalità lambda XY nell'elenco a discesa. La modalità di ingresso del laser viene quindi modificata automaticamente da percentuale costante a potenza costante.

In eccitazione lambda, impostazioni di scansione lambda, deselezionare la casella di movimento SP automatico e impostare la finestra spettrale per il laser di input da 470 a 670 nanometri e la dimensione del passo spettrale a quattro nanometri. Impostare l'intervallo spettrale di PMT da 450 a 690 nanometri facendo doppio clic o spostando la barra di regolazione per l'intervallo spettrale. Scegliere un obiettivo a immersione in acqua adatto con un'apertura numerica elevata.

Dai qualsiasi valore al PMT e alla potenza del laser per attivare la configurazione AOBS e il pulsante di scansione in tempo reale. Nella configurazione AOBS, passare al percorso ottico controllando la riflessione. Quindi, montare uno specchio di riferimento sul tavolino del microscopio con la superficie rivolta verso la lente dell'obiettivo.

Se non è facile posizionare lo specchio sul tavolino del microscopio, far aderire uno specchio sulla piastra piana. Regolare il tavolino del microscopio per allineare il piano focale alla superficie dello specchio. Quindi, regolare il guadagno PMT e la potenza del laser, considerando la gamma dinamica del rivelatore.

Sotto uno pseudocolore, controlla che non ci sia saturazione in tutta la gamma di lunghezze d'onda. Se si osserva una saturazione, ridurre la potenza del laser. Quindi eseguire l'acquisizione della scansione lambda.

Rimuovere lo specchio dal tavolino e ripetere la stessa acquisizione senza campione per ottenere il riferimento scuro. Quindi salvare i dati in un formato TIF multi-stack. Per eseguire l'acquisizione dell'immagine SpeRe, posizionare il tessuto montato sul tavolino del microscopio.

Per allineare approssimativamente il tessuto al piano focale della lente dell'obiettivo, attraverso un oculare utilizzare la modalità di fluorescenza ad ampio campo. Con la scansione dal vivo attivata, controllare il tavolino del microscopio per allineare il piano focale alla regione di interesse nel tessuto. Per evitare il rumore di fondo del vetrino coprioggetti, selezionare una regione target di almeno 15 micrometri di profondità dall'interfaccia del tessuto di vetro.

Acquisire lo stack di immagini spettrali per la regione di destinazione utilizzando la stessa procedura illustrata in precedenza in questo video. Quindi salva i dati per il tessuto e l'offset scuro in formato TIF multi-stacked. Per elaborare le immagini in ImageJ, aprire i dati spettrali per lo specchio di riferimento e il tessuto cerebrale.

Selezionare le ROI per le pile di immagini aperte, l'area centrale per lo specchio di riferimento e il segmento di una fibra assonale per il tessuto cerebrale. Quindi esegui l'immagine, impila, traccia il profilo dell'asse Z per acquisire gli spettri grezzi per le ROI selezionate. Le fibre degli assoni possono essere strutturalmente eterogenee lungo le loro lunghezze, quindi, si raccomanda di selezionare il ROI su un piccolo segmento di assone tipicamente inferiore a cinque micrometri per ridurre al minimo gli artefatti di volume parziale.

Apri i dati di offset scuro, uno preso per lo specchio di riferimento e l'altro preso per il tessuto cerebrale, e traccia il profilo dell'asse Z come appena dimostrato. Quindi utilizzare le opzioni di copia e incolla per salvare tutte le opzioni acquisite. Per eseguire la correzione della linea di base e l'analisi del segnale SpeRe, sottrarre gli spettri di offset dagli spettri dello specchio di riferimento e dei tessuti cerebrali.

Normalizza ogni spettro dividendo l'intensità massima dello spettro. Inserire il numero d'onda prendendo il reciproco della lunghezza d'onda utilizzata nell'esperimento, normalizzare lo spettro dell'assone dividendo quello dello specchio di riferimento e sottrarre l'offset CC dallo spettro normalizzato. E poi ottenere la frequenza del numero d'onda adattando lo spettro acquisito a una sinusoide.

Converti la frequenza del numero d'onda acquisita in periodicità prendendo il reciproco e converti la periodicità del numero d'onda nel diametro dell'assone utilizzando l'equazione mostrata qui. In questo esperimento, fette fisse di cervello sono state colorate in fluorescenza contro la mielina e l'imaging SpeRe è stato effettuato con una dose di luce di un ordine di grandezza inferiore rispetto alla microscopia confocale a fluorescenza convenzionale. Il segnale SpeRe è stato localizzato lungo il centro degli assoni mielinizzati come previsto dalla geometria della riflessione ottica.

Dallo spettro riflettente di un segmento di assone si otteneva la periodicità del numero d'onda, che veniva successivamente convertita in diametro dell'assone. Questo grafico illustra un profilo trasversale dell'intensità della fluorescenza dalla regione in scatola qui, e il diametro misurato da SpeRe è risultato essere in buon accordo con la misurazione basata sulla fluorescenza. L'imaging SpeRe si basa sulla riflessione ottica.

Pertanto, un vetrino coprioggetti a base di silice può introdurre un rumore di fondo significativo. Nella configurazione ottica, il rumore di fondo era considerevole quando la profondità di imaging dal vetrino coprioggetti era inferiore a cinque micrometri, ma veniva evitato quando la profondità di imaging era maggiore di 15 micrometri. La fase di calibrazione non è richiesta per tutti gli esperimenti, ma è consigliata almeno una volta alla settimana.

Una volta completata la calibrazione, la procedura di imaging può essere terminata in genere entro 20 secondi per ogni campo visivo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di considerare la latenza dinamica del rivelatore per la scansione dell'intero spettro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere la nanostruttura dagli assoni mielinizzati utilizzando le immagini di riflettanza.