Herstellung von amperometrische Elektroden
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Kohlefaser Elektroden zu erzeugen. Die Elektroden werden anschließend verwendet, um Katecholaminausschüttung von Vesikeln mit Kohlefaser Amperometrie erkennen.
Abstract
Carbon-Elektroden sind entscheidend für den Nachweis von Katecholamin Entlassung aus dem Vesikel in einzelnen Zellen für Amperometrie Messungen. Hier beschreiben wir die Techniken erforderlich, um geräuscharm (<0,5 pA) Elektroden zu erzeugen. Die Techniken wurden aus veröffentlichten Beschreibungen wurden von früheren Forschern (1,2) modifiziert. Die Elektroden sind durch Herstellung von Kohlenstoff-Fasern und Einfädeln sie einzeln in jede Kapillare mit Hilfe eines Vakuums mit einem Filter, um die Faser absaugen gemacht. Anschließend wird die Kapillare mit Faser durch eine Elektrode Abziehers, wodurch zwei Hälften, die jeweils mit einer feinen Spitze. Die Elektroden werden in heißem, flüssigem Epoxidharz mit Härter gemischt, um ein Epoxid-Glas-Siegel erstellen getaucht. Schließlich sind die Elektroden in einen Ofen gelegt, um das Epoxidharz zu heilen. Sorgfältige Behandlung der Elektroden ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sie gemacht werden konsequent und ohne Beschädigung. Dieses Protokoll zeigt, wie in der Herstellung und schneiden amperometrischen Elektroden für die Aufzeichnung von einzelnen Zellen.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie zu generieren und zu schneiden amperometrischen Elektroden. Während amperometrische Aufnahmen, ist eine Kohlefaser-Elektrode gegen die Oberfläche eines sekretorischen Zelle platziert. Exozytotische Aktivität wird als amperometrische Spikes, die die elektrochemische Strom, der durch den Transfer von Elektronen nach der Oxidation der Katecholamine verursacht zeigt beobachtet. Mit etwas Übung machen und Schneiden amperometrischen Elektroden kann Geräuschpegel erheblich über viele der …
Acknowledgements
Wir danken Dr. Aaron P. Fox an der Universität von Chicago, in dessen Labor das Protokoll wurde ursprünglich entworfen, und William Roden (Saint Louis University) für die Weiterentwicklung des Protokolls.
Wir danken der Whitehall-Stiftung und National Science Foundation für die Unterstützung.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes | Reagent | Sigma Aldrich | P23954-100G04 716AJ | Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light. |
| Carbon Fibers | Material | Goodfellow | C005725 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Material | Fisher | NC9836768 | |
| Epoxy Resin | Reagent | Miller-Stephenson | Epon Resin 828 | |
| Dissecting Microscope | Instrument | |||
| Electrode Puller | Instrument | Narishige Japan | PP-830 | 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C |
| Oven | Instrument | set to 100 degrees F. | ||
| Hot plate | Instrument | set to 55 degrees C |
Riferimenti
- Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).
- Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
