Fabricación de electrodos amperométricos

Summary

Este protocolo se describe cómo generar electrodos de fibra de carbono. Los electrodos se utilizan posteriormente para detectar la liberación de catecolaminas de las vesículas con amperometría de fibra de carbono.

Abstract

Electrodos de fibra de carbono son cruciales para la detección de la liberación de catecolaminas de las vesículas en las células individuales para las mediciones de amperometría. A continuación, describimos las técnicas necesarias para generar ruido bajos (<0,5 pA) electrodos. Las técnicas han sido modificadas a partir de las descripciones publicadas por otros investigadores (1,2). Los electrodos son hechos por la preparación de fibras de carbono y los hilos de forma individual en cada tubo capilar mediante el uso de una aspiradora con un filtro para aspirar la fibra. A continuación, el tubo capilar con la fibra es tirado por un extractor de electrodos, la creación de dos mitades, cada una con una punta afilada. Los electrodos se sumergen en epoxi líquida caliente mezclada con el endurecedor para crear un sello de epoxy de cristal. Por último, los electrodos se colocan en un horno para curar la resina. El manejo cuidadoso de los electrodos es fundamental para garantizar que se hace de forma coherente y sin daños. Este protocolo se muestra cómo fabricar y cortar electrodos amperométricos para la grabación de una sola célula.

Protocol

Parte 1: Preparación de fibra de carbono Cortar un haz de fibras de carbono (que utilizamos 7μm diámetro) en una longitud que es de ~ 1,25 X la longitud de la pipeta capilar. Retire el tamaño de punto de ebullición ~ 100 ml de acetona en un recipiente y añadir las fibras a la acetona caliente, hirviendo durante 30 minutos o más. Eliminar las fibras de la acetona caliente, y transferir a un vaso limpio con 50-100 ml de acetona fresca. Fibras secas, colocando el paquete en u…

Discussion

Este protocolo se describe cómo generar y cortar electrodos amperométricos. En las grabaciones amperométrica, un electrodo de fibra de carbono se coloca contra la superficie de una célula secretora. La actividad de exocitosis se observa como los picos de amperométrica, lo que indica la corriente electroquímica causada por la transferencia de electrones después de la oxidación de las catecolaminas. Con la práctica de decisiones y reducir los electrodos amperométricos, los niveles de ruido puede ser mejorado en …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes	Reagent	Sigma Aldrich	P23954-100G04 716AJ	Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.
Carbon Fibers	Material	Goodfellow	C005725
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Material	Fisher	NC9836768
Epoxy Resin	Reagent	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
Dissecting Microscope	Instrument
Electrode Puller	Instrument	Narishige Japan	PP-830	1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C
Oven	Instrument			set to 100 degrees F.
Hot plate	Instrument			set to 55 degrees C