Двухфотонное axotomy и покадровой конфокальной микроскопии в живых эмбрионов данио рерио
Summary
Здесь мы опишем метод для монтажа данио эмбрионов для долгосрочных изображений, двухфотонного изображений и тканей повреждения техники и покадровой конфокальной микроскопии.
Abstract
Данио рерио уже давно используются для исследования клеточных и молекулярных механизмов развития путем покадровой визуализации живых прозрачных эмбриона. Здесь мы опишем метод для монтирования данио эмбрионов для долгосрочных изображений и продемонстрировать, как автоматизировать захват покадровой изображения с помощью конфокальной микроскопии. Мы также опишем метод для создания контролируемой, точный ущерб отдельным отраслям периферических сенсорных аксонов в данио использованием сосредоточены мощности фемтосекундного лазера установлены на двухфотонного микроскопа. Параметры для успешного двухфотонного axotomy должны быть оптимизированы для каждого микроскопа. Мы продемонстрируем двухфотонного axotomy с обеих индивидуальному заказу двухфотонного микроскопа и Zeiss 510 конфокальной / двухфотонного предоставить два примера.
Данио рерио тройничного сенсорных нейронов могут быть визуализированы в трансгенной линии выражения GFP обусловлен сенсорного нейрона конкретных промоутер 1. Мы адаптировали эту данио тройничного модель непосредственно наблюдать сенсорной регенерации аксонов в живых рыбок данио эмбрионов. Эмбрионы анестезировали tricaine и расположены в пределах капли агарозы как он затвердевает. Иммобилизованные эмбрионы запечатан в визуализации камере, наполненной фенилтиомочевиной (ПТУ) Ringers. Мы обнаружили, что эмбрионы могут быть постоянно отображается в этих камерах для 12-48 часов. Одного конфокальной изображение затем захватили, чтобы определить желаемый сайт axotomy. Интересующей нас области находится на двухфотонного микроскопа изображений сенсорных аксонов при низких, не причинен ущерб власти. После увеличения в желаемый сайт axotomy, сила увеличивается, и одно сканирование, как определено региона достаточно, чтобы разорвать аксона. Несколько месте покадровой визуализации затем устанавливается на конфокальной микроскопии непосредственно наблюдать аксонального восстановления после травмы.
Protocol
Discussion
Мы использовали методы, описанные точно axotomize периферических сенсорных аксонов и непосредственно наблюдать регенерации в эмбрион полосатого данио жизни. Долгосрочные покадровой конфокальной микроскопии в данио рерио могут быть использованы для наблюдения многих процессов развития…
Acknowledgements
Мы благодарим Марка Тарасаки для первоначальной консультации по вопросам использования двухфотонного микроскопа для создания локальных повреждений тканей, Кэти Жубен за советом по монтажу для покадровой обработки изображений и Сагасти и Portera-Кайо лабораторий для дискуссий. Первоначальные эксперименты проводились А. С. в качестве стипендиата Фонда Трава на Морской биологической лаборатории в Вудс-Хол, Массачусетс. Работа в Сагасти лаборатория была поддержана грантами фонда Whitehall, Klingenstein фонда, и Фонда Burroughs Wellcome Карьера премии в области биологических наук.
References
- Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15, 804-814 (2005).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Sacconi, L. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Yanik, M. F. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822-822 (2004).
- Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. Mechanisms of laser cellular microsurgery. Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).
