De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo
Summary
Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.
Abstract
Pez cebra han sido utilizados para estudiar los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo de time-lapse del embrión transparente de vida. Aquí se describe un método para montar embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes y se muestra cómo automatizar la captura de imágenes con lapso de tiempo utilizando un microscopio confocal. También describe un método para crear daño controlado y preciso a las distintas ramas de los axones sensoriales periféricas en el pez cebra con el poder concentrado de un láser de femtosegundo montada en un microscopio de dos fotones. Los parámetros para el éxito de dos fotones axotomía debe ser optimizado para cada microscopio. Vamos a demostrar de dos fotones axotomía en tanto a la medida de dos fotones microscopio Zeiss y un 510 / confocal de dos fotones que son dos ejemplos.
Pez cebra neuronas sensoriales del trigémino se pueden visualizar en una línea transgénica que expresa GFP dirigida por un promotor neuronas sensoriales específicas 1. Hemos adaptado este modelo de pez cebra trigémino de observar directamente la regeneración de axones sensoriales en vida embriones de pez cebra. Los embriones son anestesiados con tricaína y colocado dentro de una gota de agarosa al solidificarse. Embriones inmovilizados están sellados dentro de una cámara de imágenes llenas de feniltiourea (PTU) Timbres. Hemos encontrado que los embriones pueden ser continuamente imágenes de estas cámaras durante 12-48 horas. Una imagen confocal solo es capturado para determinar el sitio deseado de axotomía. La región de interés se encuentra en el microscopio de dos fotones de imágenes de los axones sensoriales en baja, no dañar el poder. Después de hacer zoom sobre el sitio deseado de axotomía, el poder es mayor y una sola exploración de esa región definida es suficiente para romper el axón. Ubicación de múltiples imágenes a intervalos de tiempo-luego se estableció en un microscopio confocal de observar directamente la recuperación de una lesión axonal.
Protocol
Discussion
Hemos utilizado los métodos descritos a axotomize precisamente periférico los axones sensoriales y de observar directamente la regeneración en el embrión de pez cebra de vida. A largo plazo de lapso de tiempo de imagen confocal en el pez cebra puede ser utilizado para observar muchos procesos de desarrollo en vivo. El procedimiento de axotomía de dos fotones descritos podrán ser modificados para muchos de los objetivos experimentales. Hemos utilizado el mismo procedimiento general para la ablación de los…
Acknowledgements
Damos las gracias a Marcos Terasaki para el asesoramiento inicial sobre el uso de un microscopio de dos fotones para crear daño en los tejidos locales, Kathy Joubin para el asesoramiento sobre el montaje de time-lapse, y los laboratorios de Sagasti y Portera-Cailliau para los debates. Los primeros experimentos fueron realizados por AS como becario de la Fundación de hierba en los Laboratorios de Biología Marina en Woods Hole, MA. Trabajar en el laboratorio Sagasti fue apoyado por becas de la Fundación de Whitehall, la Fundación Klingenstein, y Burroughs Wellcome Premio Trayectoria del Fondo en las Ciencias Biológicas.
References
- Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15, 804-814 (2005).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Sacconi, L. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Yanik, M. F. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822-822 (2004).
- Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. Mechanisms of laser cellular microsurgery. Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).
