Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen
Summary
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.
Abstract
Zebrafische sind seit langem verwendet, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Entwicklung von Zeitraffer-Bildgebung des lebendigen transparent Embryo zu studieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zebrafisch-Embryos für die langfristige Bildgebung montieren und zu demonstrieren, wie die Erfassung von Zeitraffer-Aufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop zu automatisieren. Wir beschreiben eine Methode, um den kontrollierten, präzisen Schäden an einzelnen Zweigen der peripheren sensorischen Axone im Zebrafisch mit dem Schwerpunkt Kraft eines Femtosekunden-Laser auf einem Zwei-Photonen-Mikroskop montiert erstellen. Die Parameter für eine erfolgreiche Zwei-Photonen-Axotomie muss für jedes Mikroskop optimiert werden. Wir werden Zwei-Photonen-Axotomie sowohl auf custom built Zwei-Photonen-Mikroskop und einem Zeiss 510 konfokalen / Zwei-Photonen auf zwei Beispiele geben zu demonstrieren.
Zebrafisch Trigeminus sensorischen Neuronen können in einer transgenen Linie, die GFP durch ein sensorisches Neuron spezifischen Promotor 1 angetrieben visualisiert werden. Wir haben diese Zebrafisch Trigeminus-Modell angepasst, um direkt zu beobachten sensorischen Axonregeneration in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Die Embryonen werden betäubt mit Tricaine positioniert und in einem Tropfen Agarose als sie erstarrt. Immobilisierte Embryonen werden in einem bildgebenden Kammer mit Phenylthioharnstoff (PTU) Ringers gefüllt versiegelt. Wir haben festgestellt, dass Embryonen kontinuierlich in diesen Kammern werden für 12-48 Stunden abgebildet. Ein einziger konfokalen Bild wird dann erfasst, um die gewünschte Stelle des Axotomie bestimmen. Die Region von Interesse ist auf der Zwei-Photonen-Mikroskop durch die Abbildung der sensorischen Axone bei niedrigen, nicht-schädliche Macht entfernt. Nach dem Zoomen in die gewünschte Stelle des Axotomie, wird die Leistung erhöht und einen einzigen Scan des definierten Bereichs ist ausreichend, um das Axon zu durchtrennen. Mehrere Lage Zeitraffer-Imaging wird dann auf einem konfokalen Mikroskop direkt beobachten axonalen Erholung von Verletzungen gesetzt.
Protocol
Discussion
Wir haben die Methoden beschrieben, um genau axotomize peripheren sensorischen Axonen und direkt zu beobachten Regeneration im lebenden Zebrafisch-Embryos verwendet. Langfristige Zeitraffer-konfokale Bildgebung in Zebrafisch kann verwendet werden, um viele Entwicklungsprozesse in vivo zu beobachten. Die Zwei-Photonen-Axotomie beschriebene Verfahren kann für viele verschiedene experimentelle Ziele modifiziert werden. Wir haben die gleiche allgemeine Verfahren zur gesamten Trigeminus sensorischen Neurons Zellkö…
Acknowledgements
Wir danken Mark Terasaki für Erstberatung mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop, um lokale Gewebeschäden, Kathy Joubin um Rat Halterung für Zeitraffer-Imaging und der Sagasti und Portera-Cailliau Labors für Diskussionen zu schaffen. Erste Versuche wurden von AS als Grass Foundation Fellow am Marine Biological Labs in Woods Hole, MA durchgeführt. Die Arbeit im Labor war Sagasti durch Zuschüsse aus dem Whitehall-Stiftung, die Klingenstein Foundation, und ein Burroughs Wellcome Fund Career Award in den biologischen Wissenschaften unterstützt.
References
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