双光子现场斑马鱼的胚胎干切断和时间推移共焦成像
Summary
在这里，我们描述了一个用于安装长期成像，双光子成像和组织损伤的技术，和时间推移共焦成像的斑马鱼胚胎的方法。
Abstract
斑马鱼长有被利用来研究时间推移成像的生活透明的胚胎发展的细胞和分子机制。在这里，我们描述的方法安装长期成像斑马鱼的胚胎，并演示如何自动捕获的时间推移，使用共聚焦显微镜图像。我们还描述了一种方法来创建控制，精确地破坏个人使用集中安装在双光子显微镜飞秒激光功率在斑马鱼的外周感觉轴突分支。成功的双光子干切断参数必须为每个显微镜进行了优化。定制的双光子显微镜和蔡司510焦/双光子提供了两个例子，我们将展示双光子干切断。
斑马鱼三叉神经感觉神经元1感官神经元特异性启动子驱动的转基因表达的GFP可以可视化。我们已经适应了这种斑马鱼三叉模式，以直接观察活的斑马鱼胚胎的感觉轴突再生。胚胎与tricaine麻醉和定位，因为它巩固了在琼脂糖下降。固定的胚胎被密封在一个充满成像与苯基硫脲嘧啶（PTU）林格室。我们已经发现胚胎可以在这些商会不断成像为12-48小时。一个单一的共聚焦图像，然后捕获，以确定所需的干切断的网站。双光子显微镜成像低，非破坏性的权力下的感觉轴突位于该地区的利益。放大所需的站点上的干切断后，功率增加，单一的，定义区域扫描足以切断轴突。然后设置多个位置的时间推移成像共聚焦显微镜直接观察到，从性轴索损伤恢复。
Protocol
Discussion
我们用描述的正是axotomize外周感觉神经轴突和生活斑马鱼的胚胎中直接观察到再生的方法。长期时间推移在斑马鱼的共焦成像可用于观察在体内的发育过程。双光子干切断过程可以修改许多不同的实验目标。我们使用相同的一般程序消融整个三叉神经的感觉神经元胞体，放大细胞体内，而不是一个分支的末梢神经轴突。荧光识别任何类型的细胞，可以精确的损坏或集中功率飞秒激光烧蚀。?…
Acknowledgements
我们感谢马克寺崎初步意见，对利用双光子显微镜，创造局部组织损伤，凯西茹班安装时间推移成像的意见，并讨论Sagasti和Portera – Cailliau实验室。最初的实验中，只要在中，马伍兹霍尔海洋生物实验室的草基金会研究员。在Sagasti实验室的工作是支持由白厅基金会，该Klingenstein基金会和巴勒斯惠康生物科学基金事业奖补助。
References
- Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15, 804-814 (2005).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Sacconi, L. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Yanik, M. F. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822-822 (2004).
- Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. Mechanisms of laser cellular microsurgery. Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).
