制备海兔感觉运动神经元细胞培养

Summary

小学文化<em>海兔</em>感觉运动神经元突触的形成和突触可塑性研究提供一个模型的制备<em>在体外</em>。这个视频演示的感觉和运动神经元的鉴定和显微切割<em>海兔</em>神经节以及建立和保持文化的感觉运动神经元的方法。

Abstract

海洋软体动物海兔californica的神经系统是相对简单的，约20,000神经元组成。神经元大（直径可达1毫米）和识别，具有不同的大小，形状，位置和色素沉着，胞体外部暴露在五个配对神经节分布于整个动物的身体。这些属性允许划定的基本^电路 1，在动物的特定行为的调查。感觉和运动神经元之间的突触连接，是一个在动物的鳃撤退反射的核心组成部分，其中动物撤回其刺中虹吸触觉刺激的一个简单的防御反射。这种反射的非关联和关联学习经历的形式，包括敏，习惯性和经典性条件反射，。感官电机突触突触可塑性的研究特别的好处，可以在文化重组，特点刺激引起的可塑性在动物^的 2,3行为有直接关联的形式。具体来说，羟色胺的应用程序产生一个突触的加强，取决于应用协议，持续几分钟（短期便利），小时（中期的便利）或天（长期便利）。相比之下，肽发射机FMRFamide的应用产生了突触减弱或抑郁症，取决于应用协议，去年从天分钟（长期抑郁症）。的神经元的大尺寸允许反复突触强度的急剧电极记录天期间注射表达载体，siRNA和其他化合物，针对特定的信号级联和分子，从而确定分子和细胞生物学的步骤背后的变化在突触效能。

海兔文化体系的一个额外的好处，从事实的神经元突触特异性^展示文化4,5。因此，感觉神经元不与自己（autapses）或与其他感觉神经元形成突触，也没有形成与非目标确定在文化运动神经元突触。静脉曲张，感觉和运动神经元之间的突触联系的网站，都足够大（直径在2-7微米），允许在光镜水平研究目标的运动神经元突触的形成与（以及突触形态的变化）。

在这段视频中，我们展示了准备的感觉，运动神经元的文化，包括anesthetizing成人和青少年海兔的每一步，剖析他们的神经节，神经节蛋白酶消化，去除结缔组织显微切割，感觉和运动神经元的识别和清除每个显微切割细胞类型，运动神经元，感觉神经元和感觉神经轴突的操纵此外电镀形成与培养运动神经元的联系。

Protocol

准备（参见解决方案在协议结束部分解决方案的组成） 准备培养皿。涂层玻璃Mattek玻璃底培养皿与聚- L -赖氨酸（四硼酸钠）。加入足够的完全覆盖的玻璃和离开> 1小时（可以过夜）。彻底清除聚- L -赖氨酸，在人工海水冲洗（ASW）的4-5倍。删除最后一次冲洗后，加2毫升50％L15（补充盐和含L -谷氨酰胺在终浓度为2mm）/ 50％血淋巴。这种培养基中必​​须至少一个小时，在盘前电镀细胞，…

Discussion

海兔感觉运动文化的成功做好准备，有一个有点慢的学习曲线，因为它涉及到显微切割和操纵通过一个立体显微镜观察单个神经元的精细动作技能的发展。根据我们的经验，它需要大约1-3周的实践，获得健康的文化孤立的感觉神经元和一个额外的1-3周，以了解如何对感觉神经与运动神经元。我们经常准备在Labconco超净工作台文化，虽然有可能准备任何实验室的工作台或办公桌上，只要显微?…

Materials

Solutions needed for culture

1. 0.35 M MgCl₂, stored at room temperature, used for anesthesia.
2. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw.
3. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter
   

   L-15 powder	13.8g
   NaCl	15.4 g
   D-Glucose	6.24 g
   MgSO4•7H20	6.45g
   KCl	350 mg
   NaHCO3	170 mg
   MgCl2•6H2O	5.49 g
   CaCl2•2H2O	1.43g
   HEPES	3.53g

   Add ddH20 to 1 liter.  The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 µm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month.
4. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 µm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001).
5. Culture medium.  Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made.
6. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl₂(6H₂O), 20 mM MgSO₄, 10 mM CaCl₂(2H₂O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.